Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

Animales
Métodos
Obtención de embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro.
La ovulación se indujo por la inyección de 800 UI de gonadotrofina coriónica
humana en el saco dorsal linfático de la rana hembra. Luego de 15 horas, se
recolectaron oocitos, los que fueron inmediatamente fecundados con un
macerado de testículo. La remoción de este órgano se realizó luego del
sacrificio del animal mediante sección medular, previa anestesia por inmersión
en agua a 4ºC durante 30 minutos. Cinco minutos después de la fecundación,
los embriones se cubrieron MBS 0.1x por al menos 30 minutos. A continuación,
se removió la gelatina con una solución de cisteína al 2% pH 8, ajustada con
NaOH, y se lavaron 10 veces con MBS 0,1x para posteriormente mantenerlos
en este mismo medio a 14º C. Aroximadamente 2 horas después, los
embriones en estadío de dos células fueron traspasados a un medio de Ficoll
4% en MBS 0.1x para ser inyectados. Para la identificación de los estadíos del
desarrollo embrionario se utilizó la clasificación de Nieuwkoop y Faber (1967) (N
y F).
Microinyección de embriones e inducción con dexametasona. Se realizó la
sobreexpresión de los genes indicados en la Tabla 1 o de los antrisentidos
modificados (morfolinos, Tabla 2) mediante inyección del mRNA transcrito in
vitro en embriones de Xenopus laevis junto con el mRNA de β-galactosidasa o
de la proteína fluorescente verde (GFP), los que se utilizaron como marcadores
de linaje. Para el análisis de expresión génica en embriones completos y del
electrofisiológico en cultivos de placa neural, se inyectó el polo animal de uno
de los blastómeros en estadio de 2 y/ó 4 células (de acuerdo al experimento, se
eligió los blastómeros ventrales o dorsales). En el caso del analisis de expresión
génica en caps animales, ya sea mediante ISH o RT-PCR, se inyecto el polo
animal de los 4 blastomeros en embriones de estadio de cuatro células. La
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