Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

REST/NRSF en el genoma anotado de Danio rerio usando como sujeto de
comparación las secuencias aminoacídicas conservadas de REST/NRSF de
ratón, humano y Xenopus, usando el programa TBLASTX. Con esta información
se amplificó el cDNA de zREST/NRSF usando el sistema comercial Expand
Long Template PCR System (Roche) y los partidores directo
CGCTCGAGCCGGTGTTTCCCACTGCC y reverso
GCTTCTAGAGCTGCCGCCCCTTCTAG diseñados en base a la secuencia
codificante de inicio y término. El producto de PCR se clonó en pCR4-TOPO
(Invitrogen), se escindió con XhoI y XbaI (indicados en negrita en la secuencia
de los partidores), se ligó al pCS2+NLS/MT (Turner y Weintraub, 1994) digerido
con estas mismas enzimas y finalmente fue secuenciado.
Analisis de PCR semicuantitativo (SQ-PCR) en explantes animales. Se
purificó RNA total de 15 explantes animales de estadio 10.5 usando Trizol
(Invitrogen) para cada condición experimental tal como se indica en la sección
de resultados. El cDNA fue sintetizado usando Superscript II (Invitrogen) y
partidor oligo(dT). El SQ-PCR se realizó tal como se indica en Gawantka et al.,
(1998). Los partidores utilizados fueron: Msx-1F (GCTAAAAATGGCTGCTAA),
Msx-1R (AGGTGGGCTGTGTAAAGT), Vent2F (CATCATCATCCCCTGGAG),
Vent2R (TAGAGTTGGATCGACTCGT), ODCF
(GTCAATGATGGGTGTATGGATC) y ODCR
(TCCATTCCGCTCTCCTGAGCAC).
Inmunodetección de histona H3 fosforilada. Se recolectaron embriones en el
estadio de néurula temprana, se fijaron en MEMFA, se deshidrataron en
metanol absoluto con dos lavados de 30 minutos y se almacenaron a –20 o C.
Antes de proceder al protocolo de inmunohistoquímica, los embriones se
blanquearon con solución de blanqueo (materiales) y se lavaron cuatro veces
por 10 minutos en PBS1x. Se bloqueó con MAB/BMBR por 30 minutos. Luego
se retiró el bloqueador y se agregó una dilución 1/1000 del anticuerpo anti-
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