Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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Animales Métodos Obtención de embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro. La ovulación se indujo por la inyección de 800 UI de gonadotrofina coriónica humana en el saco dorsal linfático de la rana hembra. Luego de 15 horas, se recolectaron oocitos, los que fueron inmediatamente fecundados con un macerado de testículo. La remoción de este órgano se realizó luego del sacrificio del animal mediante sección medular, previa anestesia por inmersión en agua a 4ºC durante 30 minutos. Cinco minutos después de la fecundación, los embriones se cubrieron MBS 0.1x por al menos 30 minutos. A continuación, se removió la gelatina con una solución de cisteína al 2% pH 8, ajustada con NaOH, y se lavaron 10 veces con MBS 0,1x para posteriormente mantenerlos en este mismo medio a 14º C. Aroximadamente 2 horas después, los embriones en estadío de dos células fueron traspasados a un medio de Ficoll 4% en MBS 0.1x para ser inyectados. Para la identificación de los estadíos del desarrollo embrionario se utilizó la clasificación de Nieuwkoop y Faber (1967) (N y F). Microinyección de embriones e inducción con dexametasona. Se realizó la sobreexpresión de los genes indicados en la Tabla 1 o de los antrisentidos modificados (morfolinos, Tabla 2) mediante inyección del mRNA transcrito in vitro en embriones de Xenopus laevis junto con el mRNA de β-galactosidasa o de la proteína fluorescente verde (GFP), los que se utilizaron como marcadores de linaje. Para el análisis de expresión génica en embriones completos y del electrofisiológico en cultivos de placa neural, se inyectó el polo animal de uno de los blastómeros en estadio de 2 y/ó 4 células (de acuerdo al experimento, se eligió los blastómeros ventrales o dorsales). En el caso del analisis de expresión génica en caps animales, ya sea mediante ISH o RT-PCR, se inyecto el polo animal de los 4 blastomeros en embriones de estadio de cuatro células. La 51
concentración de mRNA a inyectar se determinó para cada experimento (ver resultados). Como control, se usó embriones no inyectados o inyectados sólo con el trazador de linaje β-galactosidasa en iguales concentraciones (Lombardo y Slack, 1997). La activación de dnXREST se llevó a cabo mediante adición de Dexametasona disuelta en etanol 95%, al medio de cultivo en una concentración final de 10mg/ml (Kolm y Sive, 1995) en estadio 6, 9 y 12 según N y F (Figura 13). Se probó la expresión de la quimera mediante western blot usando extractos totales de embriones en estadio de néurula y un anticuerpo monoclonal que reconoce los epitopos myc de la proteína de fusión (Figura 13). 52
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Universidad de Chile, Facultad de M
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Quisiera agradecer muy especialment
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