Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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el líquido y secó el mRNA para finalmente resuspenderlo en 20 μL de agua DEPC. La concentración y pureza del mRNA se determinó por lectura espectrofotométrica a 260 y 280 nm. Gen Enzima de restricción RNA polimerasa referencia β-gal XhoI Sp6 Cedido Turner por Dr. David Bmp-4 XbaI Sp6 Schmidt et al., 1995 GFP Not Sp6 Cedido Ribera. por Dra. Angie XCoREST NcoI Sp6 de la Calle Mustienes et al., 2002 dnXREST NotI Sp6 Esta tesis XREST/NRSF NotI Sp6 Esta tesis zREST/NRSF NotI Sp6 Esta tesis Tabla 1. mRNAs sintetizados in vitro para la inyección en embriones de Xenopus laevis. Se indica el gen o construcción templado, la enzima de restricción utilizada y la RNA polimerasa correspondiente. Morfolino Gen blanco Secuencia MoXREST XREST/NRSF ACTGGTTGACCATTTGAGTGGC MoCoREST XCoREST CTGCTCCCTTCTCGATCATGGCTGG MoControl Control TTTCAGACGGACCACTGTCAGTGCG Tabla 2. Morfolinos para la inyección en embriones de Xenopus laevis. Los antisentidos fueron diseñados contra la secuencia que incluye el codon de inicio, se indica el gen blanco y la secuencia nucleotídica. 59
Síntesis de ribosondas para hibridación in situ. Se usaron sondas de RNA antisentido modificadas por la incorporación de DIG-UTP (Harland, 1991), las cuales se generaron a partir de los plasmidios que contienen los cDNAs codificantes para los genes en estudio (Tabla 1). Cada plasmidio se linearizó con una enzima de corte único río arriba de la secuencia de interés. De manera de sintetizar la hebra antisentido complementaria al mensajero endógeno que se pretende detectar, se utilizó el promotor ubicado río abajo de la secuencia de interés en el vector. La reacción de transcripción in vitro se realizó adicionando 1 μg del plasmidio linearizado en una solución que contiene: 2 μL de amortiguador de transcripción 10x, 2 μL de mezcla de nucleótidos (ATP 10 mM, CTP 10 mM, GTP 10 mM, UTP 6,5 mM, DIG-UTP 3,5 mM), 1 μL (20 U) de inhibidor de RNasas, agua DEPC para completar 20 μL y 1 μL de la RNA polimerasa correspondiente. La reacción se incubó durante al menos dos horas a 37°C; luego se agregó 20 U de DNAsa I y se continuó la incubación durante 15 minutos adicionales. Pasado este período, se verificó la eliminación del DNA analizando una alícuota de la reacción en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. Finalmente, se agregaron 20 μL de agua DEPC adicionales y se filtró en una columna Sephadex G20 (mini Quick RNA Spin Columns, Roche) equilibrada en TE pH 7,5 con el fin de eliminar los nucleótidos no incorporados al RNA sintetizado. Los transcritos se analizaron en geles de agarosa 1%, formaldehído 2,2% en amortiguador MOPS, teñidos con bromuro de etidio. La concentración y pureza de los ácidos nucléicos se determinó por lectura espectrofotométrica a 260 y 280 nm. 60
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