Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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Gen Enzima de RNA Territorio de referencia restricción polimerasa expresión Chordin EcoRI T7 mesodermo Sasai et al., dorsal 1994 X-Delta-1 XhoI T7 neuronas Chitnis et al., primarias 1995 Hes-1 EcoRI T7 dominios Clon EST neurogénicos XL036f10 Keratin EcoRI Sp6 ectodermo no Jonas et al., neural 1985. msx-1 EcoRI T3 borde y crestas Suzuki et al., neurales 1997. MyoD BamHI Sp6 mesodermo Hopwood y paraxial Gurdon, 1990. NaV1.2 XhoI Sp6 neuronas Armisen et primarias al., 2002. X-ngnr-1 BamHI T3 neuronas Ma et al., primarias 1995. Notch-1 ClaI Sp6 placa neural Chitnis et al., 1995 XREST/NRSF EcoRI T3 ver resultados esta tesis SCG10 BamHI T7 neuronas Armisen et primarias al., 2002. SoxD ClaI T7 placa neural Mizuseki al., 1998a et Sox2 XbaI T7 placa neural Mizuseki al., 1998b et Slug BglII Sp6 crestas Mayor et al., neurales 1995. N-tubulin SacI T3 Neuronas Chitnis et al., primarias 1995. Zic2 SacII Sp6 dominios inter- Brewster et neurogénicos al., 1998 Tabla 3. Genes utilizados para la síntesis de ribosondas para ISH. Se indica la enzima de restricción utilizada para linearizar el plasmidio que contiene el inserto; la RNA polimerasa utilizada en la transcripción in vitro, el territorio asociado a la detección <strong>del</strong> mensajero mediante hibridación in situ y la referencia bibliográfica. 61
Hibridación in situ (ISH). Los embriones, almacenados en etanol, se rehidrataron con tres lavados, de cinco minutos cada uno, en metanol 75%, 50% y 25% v/v, para posteriormente lavarlos 3 veces durante 5 minutos en PTw (todos los lavados e incubaciones se realizaron a temperatura ambiente en tubos de microcentrífuga dispuestos horizontalmente sobre la plataforma de un rotador de 3 dimensiones, a menos que se indique otra condición). Luego se hicieron dos lavados, de cinco minutos cada uno, con TEA 0,1 M pH 7,5. Al último lavado de TEA se le agregaron 1,5 mL de anhídrido acético por cada 0,5 mL de TEA y se lavó durante otros cinco minutos, al final de los cuales se agregaron 1,5 mL adicionales de anhídrido acético y se lavó durante cinco minutos más. A continuación, los embriones se sometieron a tres lavados de cinco minutos cada uno con PTw. Posteriormente, se retiró el PTw y se agregó amortiguador de hibridación suficiente para cubrir los embriones, el cual se cambió por amortiguador fresco luego que los embriones sedimentaron en el tubo. La prehibridación consistió en la incubación a 60°C durante seis horas en este amortiguador, con los tubos dispuestos en posición vertical sobre el rotador de 3 dimensiones. Luego, el amortiguador de hibridación se reemplazó con la ribosonda correspondiente marcada con DIG-UTP, en una concentración de 1 mg/mL en el amortiguador de hibridación. La hibridación con las ribosondas se realizó durante 16 horas en las mismas condiciones descritas para la prehibridación. A continuación, los embriones se sometieron a lavados sucesivos de 10 minutos cada uno con las soluciones de lavado 1, 2, 3 y 4 (ver Materiales: soluciones) y de 30 minutos en la solución de lavado 5 (ver Materiales: soluciones). Todos los lavados se realizaron a 60º C y con los tubos en posición vertical sobre el rotador de 3 dimensiones. Después de esta operación, los lavados e incubaciones se efectuaron a temperatura ambiente: tres lavados de 5 minutos cada uno con PTw, dos lavados de 5 minutos cada uno en MAB e incubación durante 2 horas en MAB/BMBR. A continuación se incubó a 4° C durante la noche con rotación en 3 dimensiones con el anticuerpo 62
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Universidad de Chile, Facultad de M
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Quisiera agradecer muy especialment
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