Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

Hibridación in situ (ISH). Los embriones, almacenados en etanol, se
rehidrataron con tres lavados, de cinco minutos cada uno, en metanol 75%,
50% y 25% v/v, para posteriormente lavarlos 3 veces durante 5 minutos en PTw
(todos los lavados e incubaciones se realizaron a temperatura ambiente en
tubos de microcentrífuga dispuestos horizontalmente sobre la plataforma de un
rotador de 3 dimensiones, a menos que se indique otra condición). Luego se
hicieron dos lavados, de cinco minutos cada uno, con TEA 0,1 M pH 7,5. Al
último lavado de TEA se le agregaron 1,5 mL de anhídrido acético por cada 0,5
mL de TEA y se lavó durante otros cinco minutos, al final de los cuales se
agregaron 1,5 mL adicionales de anhídrido acético y se lavó durante cinco
minutos más. A continuación, los embriones se sometieron a tres lavados de
cinco minutos cada uno con PTw. Posteriormente, se retiró el PTw y se agregó
amortiguador de hibridación suficiente para cubrir los embriones, el cual se
cambió por amortiguador fresco luego que los embriones sedimentaron en el
tubo. La prehibridación consistió en la incubación a 60°C durante seis horas en
este amortiguador, con los tubos dispuestos en posición vertical sobre el rotador
de 3 dimensiones. Luego, el amortiguador de hibridación se reemplazó con la
ribosonda correspondiente marcada con DIG-UTP, en una concentración de 1
mg/mL en el amortiguador de hibridación. La hibridación con las ribosondas se
realizó durante 16 horas en las mismas condiciones descritas para la
prehibridación. A continuación, los embriones se sometieron a lavados
sucesivos de 10 minutos cada uno con las soluciones de lavado 1, 2, 3 y 4 (ver
Materiales: soluciones) y de 30 minutos en la solución de lavado 5 (ver
Materiales: soluciones). Todos los lavados se realizaron a 60º C y con los tubos
en posición vertical sobre el rotador de 3 dimensiones. Después de esta
operación, los lavados e incubaciones se efectuaron a temperatura ambiente:
tres lavados de 5 minutos cada uno con PTw, dos lavados de 5 minutos cada
uno en MAB e incubación durante 2 horas en MAB/BMBR. A continuación se
incubó a 4° C durante la noche con rotación en 3 dimensiones con el anticuerpo
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