Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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Figura 13. Estrategia de pérdida de función para el análisis del papel de XREST/NRSF durante la neurogénesis de Xenopus laevis. En un blastómero de embriones en estadío de dos células se inyecta el mRNA correspondiente al dominio de unión al DNA de XREST/NRSF (dn XREST) fusionado al dominio regulatorio del receptor de glucocorticoides (GR) y a epítopes Myc. Al mismo tiempo se coinyecta el mRNA de β-galactosidasa como marcador de linaje celular (arriba). El dominio GR permite inducir la translocación nuclear de la construcción haciendo funcional al dominante negativo de XREST/NRSF en diferentes etapas del desarrollo mediante la adición de Dexametasona al medio de cultivo. Los epítopes Myc permiten a su vez controlar la expresión de la proteína exógena (arriba a la derecha). El modelo propuesto sugiere que la pérdida de función de XREST/NRSF mediante la expresión de su dominante negativo activaría la expresión de sus genes blanco. 53
Recolección de embriones. Para el procedimiento de hibridación in situ se recolectaron embriones de estadios de néurula temprana (13.5-14.5, N y F), media (15-16, N y F), tardía (18-19, N y F) y organogénesis (24-27, N y F), los cuales fueron devitelinizados manualmente. A continuación se incubaron en MEMFA durante 1 hora a temperatura ambiente en tubos de microcentrífuga dispuestos horizontalmente sobre la plataforma de un rotador de 3 dimensiones. Los embriones ya semifijados, se lavaron dos veces por 10 minutos en PBS1x libre de ribonucleasas y se realizó la detección de la actividad β-galactosidasa, mediante incubación en la solución de revelado de β-gal de 30 minutos a dos horas. Finalmente, se incubaron nuevamente en MEMFA por 30 minutos, se deshidrataron en etanol absoluto dos veces por 30 minutos y se almacenaron a -20º Celsius (C) hasta la hibridación in situ. Para la realización de cultivos celulares primarios se recolectaron embriones en estadio 15. Explantes animales. Los explantes fueron realizados utilizando cuchillas de cejas y pinzas en MBS 1x. Se removió explantes de ectodermo animal en estadío 9 (blástula tardía), los que fueron cultivados en MBS 0.5x hasta el equivalente de estadio 11 para los experimentos de RT-PCR, y néurula para los estudios de hibridación in situ según se indica en la sección de los resultados. Cultivo celular. Los cultivos se prepararon a partir de la mitad posterior de la placa neural de embriones únicos en estadio de néurula temprana. La separación de la placa neural de la notocorda y del mesodermo paraxial, se realizó mediante disección manual utilizando pinzas en el medio de disección (ver Materiales). La placa neural se disoció mediante aspiracion y expulsión del tejido en el medio de disociación utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estirada hasta un diámetro de 100 μm. Luego las células disociadas se plaquearon en placas de cultivo de 35mm de diámetro y cultivaron en el medio de cultivo (ver Materiales). Finalmente se realizaron los registros electrofisiológicos sobre células cultivadas entre 14-16 hrs. (Fig. 2). Los cultivos poseen una población 54
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Quisiera agradecer muy especialment
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