Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

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REST/NRSF en el genoma anotado de Danio rerio usando como sujeto de comparación las secuencias aminoacídicas conservadas de REST/NRSF de ratón, humano y Xenopus, usando el programa TBLASTX. Con esta información se amplificó el cDNA de zREST/NRSF usando el sistema comercial Expand Long Template PCR System (Roche) y los partidores directo CGCTCGAGCCGGTGTTTCCCACTGCC y reverso GCTTCTAGAGCTGCCGCCCCTTCTAG diseñados en base a la secuencia codificante de inicio y término. El producto de PCR se clonó en pCR4-TOPO (Invitrogen), se escindió con XhoI y XbaI (indicados en negrita en la secuencia de los partidores), se ligó al pCS2+NLS/MT (Turner y Weintraub, 1994) digerido con estas mismas enzimas y finalmente fue secuenciado. Analisis de PCR semicuantitativo (SQ-PCR) en explantes animales. Se purificó RNA total de 15 explantes animales de estadio 10.5 usando Trizol (Invitrogen) para cada condición experimental tal como se indica en la sección de resultados. El cDNA fue sintetizado usando Superscript II (Invitrogen) y partidor oligo(dT). El SQ-PCR se realizó tal como se indica en Gawantka et al., (1998). Los partidores utilizados fueron: Msx-1F (GCTAAAAATGGCTGCTAA), Msx-1R (AGGTGGGCTGTGTAAAGT), Vent2F (CATCATCATCCCCTGGAG), Vent2R (TAGAGTTGGATCGACTCGT), ODCF (GTCAATGATGGGTGTATGGATC) y ODCR (TCCATTCCGCTCTCCTGAGCAC). Inmunodetección de histona H3 fosforilada. Se recolectaron embriones en el estadio de néurula temprana, se fijaron en MEMFA, se deshidrataron en metanol absoluto con dos lavados de 30 minutos y se almacenaron a –20 o C. Antes de proceder al protocolo de inmunohistoquímica, los embriones se blanquearon con solución de blanqueo (materiales) y se lavaron cuatro veces por 10 minutos en PBS1x. Se bloqueó con MAB/BMBR por 30 minutos. Luego se retiró el bloqueador y se agregó una dilución 1/1000 del anticuerpo anti- 57
histona H3 fosforilada (Upstate) en MAB/BMBR, en la que los embriones fueron incubados 14-18 horas a 4°C. Luego se lavaron los embriones con MAB 4 veces por 30 minutos y se agregó el anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa de rában (Jackson) en una dilución 1/5000 en MAB/BMBR el cual se incubó por 6 horas. Completado el tiempo de incubación del anticuerpo secundario se procedió a lavar con PBS 1x 4 veces por 30 minutos y se incubaron los embriones en DAB por 15 minutos a 4 o C, seguido, se adicionó 1 μl de peróxido de hidrógeno (3%). Se siguió la reacción bajo lupa hasta obtener la tinción deseada. La reacción fue detenida lavando 2 veces por 5 minutos con PBS 1x y posterior fijación con solución de formaldehído en PBS 1x. Transcripción in vitro de mRNA. Se transcribió mRNA a partir de los cDNA linearizados de los clones donados y de los producidos en el transcurso de esta tesis. Dependiendo de la orientación del inserto se usó la enzima de restricción y polimerasa adecuadas (Tabla 1). La transcripción de los mRNA para la inyección en embriones se realizó utilizando al sistema comercial mMessage mMachine Kit (Ambion), según se las instrucciones del fabricante. Se mezcló 1 μg de plásmido linearizado, 2 μL de amortiguador de transcripción 10x, 10 μL de mezcla de nucleótidos (2x NTP/CAP), agua DEPC hasta completar 20 μL y 2 μL de la RNA polimerasa respectiva. Esta mezcla se incubó a 37°C durante 2 horas. Luego, se agregó 1 μL de DNAsa I y se continuó la incubación a 37°C durante otros 15 minutos. La reacción se detuvo agregando 115 μl de agua DEPC y 15 μl de una solución de acetato de amonio 5 M y EDTA 100 mM. El mRNA sintetizado se extrajo con un volumen de una mezcla fenol, cloroformo, alcohol isoamílico 25:24:1 y se agregó 2,5 volúmenes de etanol absoluto. El mRNA se centrifugó durante 20 minutos a 12000g para luego eliminar el sobrenadante, lavar con etanol 70% y volver a centrifugar a 12000g durante 5 minutos, luego de los cuales se eliminó 58
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