Participación del Factor Silenciador Neuronal Restrictivo - Tesis ...

Síntesis de ribosondas para hibridación in situ. Se usaron sondas de RNA
antisentido modificadas por la incorporación de DIG-UTP (Harland, 1991), las
cuales se generaron a partir de los plasmidios que contienen los cDNAs
codificantes para los genes en estudio (Tabla 1). Cada plasmidio se linearizó
con una enzima de corte único río arriba de la secuencia de interés. De manera
de sintetizar la hebra antisentido complementaria al mensajero endógeno que
se pretende detectar, se utilizó el promotor ubicado río abajo de la secuencia de
interés en el vector. La reacción de transcripción in vitro se realizó adicionando
1 μg del plasmidio linearizado en una solución que contiene: 2 μL de
amortiguador de transcripción 10x, 2 μL de mezcla de nucleótidos (ATP 10 mM,
CTP 10 mM, GTP 10 mM, UTP 6,5 mM, DIG-UTP 3,5 mM), 1 μL (20 U) de
inhibidor de RNasas, agua DEPC para completar 20 μL y 1 μL de la RNA
polimerasa correspondiente. La reacción se incubó durante al menos dos horas
a 37°C; luego se agregó 20 U de DNAsa I y se continuó la incubación durante
15 minutos adicionales. Pasado este período, se verificó la eliminación del DNA
analizando una alícuota de la reacción en un gel de agarosa al 1% teñido con
bromuro de etidio. Finalmente, se agregaron 20 μL de agua DEPC adicionales y
se filtró en una columna Sephadex G20 (mini Quick RNA Spin Columns, Roche)
equilibrada en TE pH 7,5 con el fin de eliminar los nucleótidos no incorporados
al RNA sintetizado. Los transcritos se analizaron en geles de agarosa 1%,
formaldehído 2,2% en amortiguador MOPS, teñidos con bromuro de etidio. La
concentración y pureza de los ácidos nucléicos se determinó por lectura
espectrofotométrica a 260 y 280 nm.
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