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2.5.1 Extracción de ADN.
2.5 Identificación molecular.
Se realizó la extracción de ADN genómico, partiendo del micelio del hongo, crecido
en APD durante 4 semanas a 30°C, se transfirió aproximadamente 1cm 2 de micelio a un
Eppendorf de 2 ml se agregó 200 l de buffer de lisis (Tris-HCl pH 8 20mM, EDTA 2mM,
1.2% triton x-100, lisozima 2mg/ml), se mezcló e incubó por 2 horas a 37° C. Se agregó
390 l de TE 1X con SDS al 1% más 4ul de proteinasa K (2mg/ml) y se incubó por 1 hora
a 55° C. Se agregó 100 l de Na Cl 5M y se mezcló, luego se agregaron 80 l de cetyl
trimetyl amomonium bromide adicionado de cloruro de sodio, se mezcló e incubó por 10
min a 65°C. Posteriormente se agregaron un volumen igual de cloroformo-alcohol-
isoamílico (24:1) y fenol saturado (250 l) y 100 l TE1X. Se mezcló, se centrifugó a
14.000 rpm por 8 min y se separó la fase acuosa. Se repitió el volumen igual de
cloroformo-alcohol-isoamílico (24:1) y 250 l de fenol saturado y 100 l de TE1X
(mezclar y centrifugar, separar la fase acuosa). A la fase acuosa final se agregaron 0.6
volumen de alcohol-isopropílico y del volumen total el 10% de acetato de sodio 3M pH 5.2
2, luego se incubó a -20°C por 15 min. Se centrifugó a 14.000 rpm por 8 min. Se desechó
el sobrenadante y la pastilla que quedó, se lavó 1ml de etanol 70%. Posteriormente se
centrifugó a 14000 rpm por 8 min. Se desechó el sobrenadante, se lavó 2 veces. Se dejó
secar a temperatura ambiente, se resuspendió en 50 l de TE 1X y se calentó a 65° C por 15
min. Para finalizar el ADN se cuantificó por espectrofotometría (Coulter DU 800
Beckman). Se refrigeró a -20°C hasta su utilización.
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