Chang Medium® D with Gentamicin For Human Amniotic Fluid Cells

de tamanho conveniente, e recongelar.με τις οδηγίες.3. Descongelar as alíquotas em banho Maria a 37°C nomomento de utilização.INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃOUtilização de Chang Medium D com Gentamicina emculturas primárias: Metodologia In Situ.1. Centrifugar o líquido amniótico a baixa velocidade paraconcentrar as células.2. Ressuspender o precipitado de células num volumepequeno do próprio líquido amniótico do doente. Porexemplo, aspirar o sobrenadante de 10 mL deixando0.5 mL de líquido, e ressuspender. Adicionar suficienteChang Medium D com Gentamicina à suspensãoconcentrada de células para alcançar um volumede cultura final de 0.5 mL por lamela (num total de 4lamelas), ou 2 mL por recipiente.3. Sem perturbar, incubar as culturas a 37°C numaatmosfera de 5% - 8% CO 2.4. No dia 2 de cultura, adicionar 2 mL de Chang MediumD com Gentamicina.5. Após 4 ou 5 dias, comprovar o crescimento das culturas.Uma vez que se observe crescimento, aspirar todo omeio de cultura e adicionar 2 mL de Chang Medium Dcom Gentamicina fresco. A partir deste momento, érecomendável mudar o meio de cultura de 2 em 2 dias.6. Verificar o crescimento das culturas durante ou depoisdo quinto dia, e colher quando se observem númerossuficientes de colónias.7. Obtém-se melhores resultados quando se muda omeio com Chang Medium D com Gentamicina no diaanterior à colheita.Utilização de Chang Medium D com Gentamicina emculturas primárias: Metodologia em recipiente.1. Centrifugar o líquido amniótico a baixa velocidade paraconcentrar as células.2. Ressuspender o precipitado de células num volumepequeno do próprio líquido amniótico do doente. Porexemplo, aspirar o sobrenadante de 10 mL deixando 1mL de líquido e ressuspender. Adicionar 4 mL de ChangMedium D com Gentamicina para obter um volume totalde 5 mL por recipiente.3. Sem perturbar, incubar as culturas a 37°C numaatmosfera de 5% - 8% CO 2.4. Verificar o crescimento ao dia 5. Mudar o meio porChang Medium D com Gentamicina fresco e colher acultura se observar um crescimento suficiente .5. Verificar o crescimento das culturas e mudarcompletamente o meio todos os dias daqui para afrente até observar um número suficiente de colóniaspara colheita.6. Obtém-se melhores resultados quando se muda omeio com Chang Medium D com Gentamicina no diaanterior à colheita.Utilização de Chang Medium D na Cultura de Células doLíquido Amniótico Derivadas de Culturas Primárias:Para passar as células cultivadas, tratar as culturas comtripsina (ou pronase, etc.) tal como se tratam normalmenteas células num meio convencional. Contudo, o tratamentocom pronase deve ser monitorizado cuidadosamente. Osamniócitos cultivados em Meio Chang D com Gentamicinatendem a ser mais sensíveis ao tratamento com proteasesque os cultivados em meios convencionais. Tendo esteaspecto em conta, pode ser por vezes necessário reajustaro protocolo.2. Διανείμετε ασηπτικά σε πρακτικού μεγέθουςυποπολλαπλάσια και ψύξτε ξανά.3. Αποψύξτε τα υποπολλαπλάσια σε υδατολουτρόθερμοκρασίας 37°C όταν είστε έτοιμοι να ταχρησιμοποιήσετε.ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣΧρήση Chang Medium D με Γενταμικίνη για ΠρωτογενείςΚαλλιέργειες: in situ Μεθοδολογίες1. Υποβάλλετε σε φυγόκεντρο το αμνιακό υγρό, σε χαμηλήταχύτητα, για συμπύκνωση των κυττάρων.2. Ανα-αιωρείστε το κυτταρικό συσσωμάτωμα σεμικρό όγκο του αμνιακού υγρού της ασθενούς. Γιαπαράδειγμα, αναρροφήστε το υπερκείμενο υγρό των 10mL νηματοποιημένου αμνιακού υγρού σε 0.5 mL πάνωαπό το κυτταρικό συσσωμάτωμα και ανα-αιωρείστε.Προσθέστε επαρκές Chang Medium D με Γενταμικίνηστο συμπυκνωμένο κυτταρικό αιώρημα για να έχετετελικό όγκο καλλιέργειας 0.5 mL ανά καλυπτρίδα(σύνολο 4 καλυπτρίδες) ή 2 mL ανά φιάλη.3. Επωάστε τις καλλιέργειες αδιατάρακτες στους 37°C5%-8% CO 2ατμόσφαιρα.4. Γεμίστε τις καλλιέργειες την 2η ημέρα, προσθέτοντας2 mL Chang Medium D με Γενταμικίνη.5. Μετά από 4 έως 5 ημέρες, ελέγξτε τις καλλιέργειεςγια την ανάπτυξη τους. Οι καλλιέργειες θα πρέπει νατρέφονται αφού παρατηρηθεί ανάπτυξη. Θρέψτε τιςκαλλιέργειες αφαιρώντας όλο το υπερκείμενο υγρόκαλλιέργειας και αντικαθιστώντας με 2 mL φρέσκοChang Medium D με Γενταμικίνη. Προτείνεται οικαλλιέργειες να τρέφονται κάθε 2 ημέρες μετά από αυτό.6. Ελέγξτε την ανάπτυξη των καλλιεργειών την / μετά την5η ημέρα και συλλέξτε όταν παρατηρηθούν επαρκείςαποικίες.7. Τα καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται όταν οικαλλιέργειες τρέφονται με Chang Medium D μεΓενταμικίνη την ημέρα πριν την συλλογή.Χρήση Chang Medium D με Γενταμικίνη για ΠρωτογενείςΚαλλιέργειες: Μεθοδολογίες Προχοϊδών1. Υποβάλλετε σε φυγόκεντρο το αμνιακό υγρό σε χαμηλήταχύτητα για συμπύκνωση των κυττάρων.2. Ανα-αιωρείστε το κυτταρικό συσσωμάτωμα σεμικρό όγκο του αμνιακού υγρού της ασθενούς. Γιαπαράδειγμα, αναρροφήστε το υπερκείμενο υγρό των 10mL από νηματοποιημένο αμνιακό υγρό σε 1 mL πάνωαπό το κυτταρικό συσσωμάτωμα και ανα-αιωρείστε.Προσθέστε 4 mL Chang Medium D με Γενταμικίνη γιασυνολικό όγκο 5 mL ανά φιαλίδιο.3. Επωάστε τις καλλιέργειες αδιατάρακτες σεθερμοκρασία 37°C 5%-8% CO 2ατμόσφαιρα.4. Ελέγξτε την ανάπτυξη την 5η ημέρα. Αλλάξτε το μέσομε φρέσκο Chang Medium D με Γενταμικίνη καισυγκεντρώστε αν παρατηρηθεί επαρκής κυτταρικήανάπτυξη.5. Ελέγξτε την ανάπτυξη των καλλιεργειών και αλλάξτεπλήρως το μέσο καθημερινά, έως ότου παρατηρηθούνεπαρκείς αποικίες και είναι έτοιμες για συλλογή.6. Τα καλύτερα αποτελέσματα λαμβάνονται ότανοι καλλιέργειες τρέφονται με Chang Medium D εΓενταμικίνη την ημέρα πριν την συλλογή.Χρήση Chang Medium D με Γενταμικίνη για ΑνάπτυξηΚυττάρων Διόδου Αμνιακού Υγρού: