Chang Medium® D with Gentamicin For Human Amniotic Fluid Cells

tamaño conveniente, y recongelar.Cultures Primaires : Methode In Situ3. Descongelar las alícuotas al baño María a 37°C en elmomento de utilizarla.INSTRUCCIONES DE USOUtilización de Chang Medium D con Gentamicina en cultivosprimarios: Metodología In Situ1. Centrifugar el líquido amniótico a baja velocidad paraconcentrar las células.2. Resuspender el precipitado de células en un volumenpequeño del propio líquido amniótico de la paciente.Por ejemplo, aspirar el sobrenadante de 10 mL dejando0.5 mL de líquido, y resuspender. Añadir suficienteChang Medium D con Gentamicina a la suspensiónconcentrada de células para alcanzar un volumen decultivo final de 0.5 mL por cubre-objetos (un total de 4cubre-objetos por muestra), o 2 mL por frasco.3. Sin perturbarlos, incubar los cultivos a 37°C en unaatmosfera de 5% - 8% CO 2.4. En el día 2 del cultivo, añadir 2 mL de Chang MediumD con Gentamicina.5. A los 4 o 5 días, comprobar el crecimiento en loscultivos. Una vez que se observe crecimiento, aspirartodo el medio de cultivo y añadir 2 mL de Chang MediumD con Gentamicina fresco. A partir de este momento, esrecomendable cambiar el medio de los cultivos cada 2días.6. Comprobar el crecimiento de los cultivos durante odespués del quinto día, y sacrificar cuando se observeque hay suficientes colonias.7. Se obtienen mejores resultados cuando se realizaun cambio de medio con Chang Medium D conGentamicina el día anterior al sacrificio.Utilización de Chang Medium D con Gentamicina en cultivosprimarios: Metodología en frasco.1. Centrifugar el líquido amniótico a baja velocidad paraconcentrar las células.2. Resuspender el precipitado celular en un volumenpequeño del propio líquido amniótico de la paciente.Por ejemplo, aspirar el sobrenadante de 10 mL dejando1 mL de líquido y resuspender. Añadir 4 mL de ChangMedium D con Gentamicina para obtener un volumentotal de 5 mL por frasco.3. Sin perturbarlos, incubar los cultivos a 37°C en unaatmósfera de 5% - 8% CO 2.4. Revisar el crecimiento en el día 5. Cambiar el medio porChang Medium D con Gentamicina fresco y sacrificarel cultivo si observa un crecimiento suficiente .5. Comprobar el crecimiento de los cultivos y cambiarcompletamente el medio cada día de aquí en adelante,hasta observar un número suficiente de colonias parasacrificar.6. Se obtienen mejores resultados cuando se realizaun cambio de medio con Chang Medium D conGentamicina el día anterior al sacrificio.Utilización de Chang Medium D en el Cultivo de Células delLíquido Amniótico Derivadas de Cultivo Primario:Para realizar pases de los amniocitos cultivados, tratarlos cultivos con tripsina ( o pronasa, etc.) como se tratannormalmente las células en un medio convencional. Losamniocitos cultivados en Medio Chang D tienden a ser mássensibles al tratamiento con proteasas que los cultivados enmedios convencionales. Aunque se puede utilizar el mismotratamiento con tripsina, pronasa, etc..., es recomendablecontrolar el proceso para reajustar el protocolo en casoque sea necesario.1. Centrifuger le liquide amniotique à 1000 tours/minpendant 5 minutes pour concentrer les cellules.2. Resuspendre le culot dans un petit volume du liquideamniotique de la patiente. Par exemple, aspirer lesurnageant obtenu en centrifugeant 10 ml de liquideamniotique et resuspendre le culot dans 0,5 ml de celiquide. Ajouter suffisamment de milieu de Chang Davec Gentamicine au culot de cellules concentréesresuspendues pour obtenir un volume final nécessairepour 4 lamelles (0,5 ml par lamelle) ou 2 ml par flaskette.3. Incuber les cultures sans agitation à 37°C enatmosphère CO 2(5% - 8%).4. Alimenter les cellules à J2 en ajoutant 2 ml de milieude Chang D.5. Après 4 à 5 jours, la croissance des cultures doit êtresurveillée. Dès que des foyers ont été observés, lescultures doivent être supplémentées en enlevant lesurnageant et en le remplaçant par 2 ml de milieude Chang D avec Gentamicine frais. Il est ensuiterecommandé de changer le milieu tous les 2 jours.6. Analyser la croissance des cellules au jour 5 et après etrécolter les cellules lorsque suffisamment de coloniessont observées (15 à 20).7. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les culturessont supplémentées la veille de la récolte avec du milieude Chang D avec Gentamicine frais.Utilisation Du Milieu Chang D Avec Gentamicine PourCultures Primaires: Methode En Flacon1. Centrifuger le liquide amniotique à 1000 tours/minpendant 5 minutes pour concentrer les cellules.2. Resuspendre le culot dans un petit volume du liquideamniotique de la patiente. Par exemple, aspirer lesurnageant obtenu par la centrifugation de 10 mlde liquide, ajouter 1 ml de ce liquide au culot etresuspendre. Ajouter 4 ml de milieu de Chang D avecGentamicine pour un volume total de 5 ml par flacon.3. Incuber les cultures à 37 °C en atmosphère CO 2(5%- 8%).4. Analyser la croissance à J5. Remplacer le milieu pardu Chang D avec Gentamicine frais et récolter si unecroissance suffisante est observée.5. Analyser les cultures et changer complètement le milieutous les 2 jours jusqu’à ce que suffisamment de coloniessoient observées et prêtes à être récoltées.6. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les cellulessont supplémentés la veille de la récolte.Utilisation du milieu Chang D avec Gentamicine pour leRepiquage des Cellules du Liquide Amniotique:Pour les subcultures, traiter les cultures avec la trypsine(ou pronase, etc.) comme vous le faites normalementlorsque les cellules poussent dans un milieu conventionnel.Cependant, le traitement avec des protéases doit êtreconduit prudemment. Les cellules amniotiques qui croissentdans le milieu de Chang D avec Gentamicine ont tendanceà être plus sensibles aux protéases que celles qui poussentdans un milieu traditionnel. Il est nécessaire d’en tenircompte dans votre protocole.