Chang Medium® D with Gentamicin For Human Amniotic Fluid Cells

3. Aliquots vor gebrauch im 37° C wasserbad auftauen.GebrauchshinweiseChang Medium D mit Gentamicin für Primärkulturen: InSitu Methoden1. Amnionflüssigkeit bei niedrigen Drehzahlenzentrifugieren, um die Zellen zu konzentrieren.2. Das Zellpellet in einer kleinen Menge patienteneigenerAmnionflüssigkeit resuspendieren. zB: den Überstandvon 10 ml der zentrifugierten Amnionflüssigkeitbis auf o,5 ml über dem Zellpellet aspirieren undresuspendieren. Ausreichend Chang Medium D withGentamicin zu der konzentrierten Zellsuspensionzugeben: 0.5 ml pro Deckglas (maximal 4 Deckgläser)oder 2 ml pro Kulturflasche3. Kulturen ungestört bei 37° C in 5%-8% CO 2atmosphäreinkubieren.4. Am 2. Tag die Kulturen mit 2 ml Chang Medium D mitGentamicin In fluten.5. Nach 4 bis 5 Tagen sollte das Wachstum der Kulturenüberprüft werden. Die Kulturen sollten gefüttert werden,sobald sie wachsen. Dazu wird der Zellkulturüberstandentfernt und durch 2 ml neues Chang Medium D mitGentamicin ersetzt. Danach sollten die Kulturen alle 2Tage neu gefüttert werden.6. Kulturwachstum am oder nach dem 5.Tag überprüfen,und wenn ausreichend Kulturen vorhanden sind, ernten.7. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn am Tagvor der Ernte nochmals mit Chang Medium D mitGentamicin gefüttert wird.Anwendung von Chang Medium D with Gentamicin fürPrimäre Kulturen: Flaschenmethode1. Amnionflüssigkeit bei niedrigen Drehzahlenzentrifugieren, um die Zellen zu konzentrieren.2. Das Zellpellet in einer kleinen Menge patienteneigenerAmnionflüssigkeit resuspendieren. zB: den Überstandvon 10 ml der zentrifugierten Amnionflüssigkeit bis auf 1ml über dem Zellpellet aspirieren und resuspendieren.4 mL of Chang Medium D mit Gentamicin zugeben zueinem Gesamtvolumen 5 mL pro Kulturflasche.3. Kulturen ungestört bei 37° C in 5%-8% CO 2Atmosphäreinkubieren.4. Kulturwachstum am 5.Tag überprüfen. Medium mitfrischem Chang Medium D mit Gentamicin austauschenund bei ausreichendem Zellwachstum ernten.5. Kulturwachstum 5.Tag überprüfen und jeden Tag dasMedium vollständig tauschen bis ausreichend Kolonienvorhanden sind. Danach ernten.6. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn am Tagvor der Ernte nochmals mit Chang Medium D mitGentamicin gefüttert wird.Anwendung von Chang Medium D mit Gentamicin zur Kulturpassagierter amnionzellenZum Passagieren der zellen werden die kulturen mit Trypsin(oder Pronase, etc.) behandelt. Genau so, als wären diezellen in einem konventionellen Medium gewachsen.Allerdings sollte die Protease Behandlung sorgfältigbeobachtet werden, da amnionzellen, die in Chang MediumD mit Gentamicin kultiviert wurden, sensitiver reagierenals Zellen nach Behandlung in konventionellen Medien.Unter Umständen muss das protokoll entsprechendmodifiziert werden.ISTRUZIONI PER L’USO DEL PRODOTTOUso del Chang Medium D con gentamicina per coltureprimarie: Metodologie In Situ.1. Centrifugare il fluido amniotico a velocita bassa perconcentrare le cellule.2. Risospendere il pellet cellulare in una piccola quantità diliquido amniotico della paziente. Ad esempio, aspirareil surnatante di 10 mL di liquido amniotico centrifugatofino a 0.5 mL al di sopra del pellet e e risospendere.Aggiungere alla sospensione concentrata di cellule unaquantità di Chang Medium D con gentamicina atta aottenere un volume finale di 0.5 mL per coverslip (perun totale di 4 coverslip) o di 2 mL per fiasca.3. Incubare le colture a 37° C in atmosfera 5%-8% CO 2.4. Al secondo giorno, aggiungere 2 mL di CHANGMEDIUM D con gentamicina alle colture.5. Dopo 4 o 5 giorni, controllare la crescita delle colture.Arricchire le colture non appena si osserva una crescitarimuovendo il surnatante e sostituendolo con 2 mLdi CHANG MEDIUM D con gentamicina fresco. Siraccomanda di continuare ad arricchire le colture inquesto modo ogni 2 giorni.6. Controllare la crescita delle colture dopo 5 giorni, eprelevarle quando si osservano un numero sufficientedi colonie.7. Risultati migliori si ottengono arricchendo con CHANGMEDIUM D con gentamicina le colture il giorno primadella raccolta.Uso Di Chang D Per Colture Primarie: Metodologie In Fiasca1. Centrifugare il liquido amniotico a bassa velocità perconcentrare le cellule.2. Risospendere il pellet in una piccola quantità di liquidoamniotico della paziente. Ad esempio, aspirare ilsurnatante di 10 mL di liquido amniotico centrifugato finoa 1 mL al di sopra del pellet e risospendere. Agguingere4 mL di Chang Medium D con gentamicina per ottenereun volume totale di 5 mL per fiaschetta.3. Incubare le colture a 37° in atmosfera al C 5%-8% CO 2.4. Controllare la crescita al 5° giorno . Sostituire ilterreno con Chang Medium D con gentamicina frescoe raccogliere se si osserva una sufficiente crescitacellulare.5. Controllare la crescita e sostituire il terreno ogni giornosuccessivo al quinto fino a che le colonie sono inquantità sufficiente e pronte per la raccolta.6. Migliori risultati si ottengono con colture arricchite conChang Medium D con gentamicina il giorno prima dellaraccolta.Uso di Chang Medium d per colture secondarie di liquidoamniotico:Per trasferire le cellule, trattare le colture con tripsina(o pronase, etc.) come nel caso di colture in terrenoconvenzionale. In ogni caso il trattamento con proteasideve essere accuratamente monitorato. Le cellule di liquidoamniotico coltivate in Chang Medium D con gentamicinatendono a essere più sensibili al trattamento con proteasirispetto a quelle coltivate in un terreno tradizionale. Inragione di ciò può essere necessario modificare il protocollo.