Chang Medium® D with Gentamicin For Human Amniotic Fluid Cells

BRUKSANVISNINGAnvändning av Chang Medium D med gentamicin förprimärodling: in situ-metodik1. Centrifugera amnionväskan på låg hastighet så attcellerna koncentreras.2. Resuspendera pelleten i en liten volym av patientensegen amnionvätska. Aspirera t.ex. supernatantenfrån 10 mL centrifugerad amnionvätska till 0,5 mLovanför cellpelleten och resuspendera pelleten. Tillsätttillräckligt med Chang Medium D med gentamicin till denkoncentrerade cellsuspensionen för att möjliggöra enslutlig utstryksvolym av 0,5 mL per täckglas (totalt 4täckglas) eller 2 mL per flaskett.3. Inkubera kulturerna utan att störa dem vid 37 ºC i 5-8% CO 2-atmosfär.4. Flöda kulturerna på dag 2 genom att tillsätta 2 mL ChangMedium D med gentamicin.5. Efter 4-5 dagar bör kulturerna kontrolleras medavseende på växt. När växt har observerats börkulturerna tillföras näring. Tillför näring till kulturernagenom att avlägsna all supernatant och ersätta denmed 2 mL färskt Chang Medium D med gentamicin. Detrekommenderas att därefter tillföra näring till kulturernavarannan dag.6. Kontrollera kulturerna med avseende på växt på/efterdag 5 och skörda dem när tillräckligt med kolonierobserveras.7. Bästa resultat erhålls när kulturerna tillförs näring medChang Medium D med gentamicin dagen innan deskördas.Användning av Chang Medium D med gentamicin förprimärodling: Metod med flaska1. Centrifugera amnionväskan på låg hastighet så attcellerna koncentreras.2. Resuspendera pelleten i en liten volym av patientensegen amnionvätska. Aspirera t.ex. supernatanten från10 mL centrifugerad amnionvätska till 1 mL ovanförcellpelleten och resuspendera pelleten. Tillsätt 4 mLChang Medium D med gentamicin till en total volympå 5 mL per flaska.3. Inkubera kulturerna utan att störa dem vid 37 ºC i 5–8% CO 2-atmosfär.4. Kontrollera kulturerna med avseende på växt på dag5. Byt till färskt Chang Medium D med gentamicin ochskörda om tillräcklig cellväxt observeras.5. Kontrollera kulturerna med avseende på växt och bytdärefter ut mediet varje dag tills tillräckligt med kolonierobserveras och är klara att skördas.6. Bästa resultat erhålls när kulturerna tillförs näring medChang Medium D med gentamicin dagen innan deskördas.Användning av Chang Medium D med gentamicin förodling av celler från amnionvätska i efterföljande passage:För passage av cellerna behandlas kulturerna med trypsin(eller pronas etc.) på normalt sätt som vid odling av celler ikonventionellt medium. Proteasbehandlingen bör dock nogaövervakas. Celler från amnionvätska som odlas i ChangMedium D med gentamicin tenderar att vara känsligare förproteasbehandling än celler från amnionvätska som odlas ikonventionellt medium. Laboratoriets protokoll kan behövamodifieras för att ta hänsyn till detta faktum.3. Kui olete valmis alikvoote kasutama, sulatage need37°C vesivannis.KASUTUSJUHISEDSöötme Chang Medium D gentamitsiiniga kasutaminetüvikultuuride kultiveerimiseks: in situ meetod1. Tsentrifuugige amnionivedelik madalal kiirusel, et rakudkontsentreeruks.2. Resuspendeerige rakukämp väheses patsiendi omaamnionivedelikus. Näiteks – aspireerige tsentrifuugitud10 mL amnionivedeliku supernatant kuni seda onrakukämbu kohale jäänud 0,5 mL ja resuspendeerige.Lisage kontsentreeritud rakususpensioonile küllaltsöödet Chang Medium D gentamitsiiniga, et see lubablõpuks esemeklaasi iga katteklaasi (kokku 4 katteklaasi)alla kanda 0,5 mL ehk 2 mL kolbikese kohta.3. Inkubeerige kultuurid segamatult 5%...8% CO 2-atmosfääris temperatuuril 37 °C.4. Loputage kultuurid 2. päeval, kasutades selleks 2 mLsöödet Chang Medium D gentamitsiiniga.5. 4 kuni 5 päeva möödudes kontrollige kultuuride kasvu.Kasvu täheldamisel tuleb kultuure hakata söötma.Söötke kultuure kogu kultuuri supernatandi eemaldadesja seda asendades 2 mL värske söötmega ChangMedium D gentamitsiiniga. Pärast seda on soovitatavkultuuride söötmine iga 2 päeva tagant.6. Kontrollige kultuuride kasvu 5. päeval või pärast seda japiisaval arvul kolooniate tekkimise korral koguge needkokku.7. Parimad tulemused saate siis, kui söödate kultuuresöötmega Chang Medium D gentamitsiiniga päev ennenende kokku kogumist.Söötme Chang Medium D gentamitsiiniga kasutaminetüvikultuuride kultiveerimiseks: kolbi meetod1. Tsentrifuugige amnionivedelik madalal kiirusel, et rakudkontsentreeruks.2. Resuspendeerige rakukämp väheses patsiendi omaamnionivedelikus. Näiteks – aspireerige tsentrifuugitud10 mL amnionivedeliku supernatant kuni seda onrakukämbu kohale jäänud 1 mL ja resuspendeerige.Lisage 4 mL söödet Chang Medium D gentamitsiinigaet igas kolbis oleks vedeliku lõplik kogus 5 mL.3. Inkubeerige kultuurid segamatult 5%...8% CO 2-atmosfääris temperatuuril 37 °C.4. Kontrollige 5. päeval kultuuride kasvu. Vahetage söödevärske söötme Chang Medium D gentamitsiiniga vastuja piisava kasvu täheldamise korral koguge rakudkokku.5. Kontrollige kultuuride kasvu ja vahetage sööde täielikultvälja iga päev pärast seda kuni täheldate piisaval arvulkolooniaid ja need on kokku kogumiseks valmis.6. Parimad tulemused saate siis, kui söödate kultuuresöötmega Chang Medium D gentamitsiiniga päev ennenende kokku kogumist.Söötme Chang Medium D gentamitsiiniga kasutaminepassaaži läbinud amnionivedeliku rakkude kultiveerimiseks:Rakkude passaaži teostamiseks töödelge kultuuretrüpsiiniga (või proteinaasi vms) nagu rakkude harilikultkonventsionaalses söötmes kasvatamise puhul. Töötlemistproteinaasiga tuleb aga hoolikalt jälgida. Söötmes ChangMedium D gentamitsiiniga kasvatatud amnionivedeliku rakudkipuvad olema tundlikumad proteinaasiga töötlemisele kuitavalises söötmes kasvatatud amnionivedeliku rakud. Sedaarvesse võttes võib protokolli muutmine osutuda vajalikuks.