Chang Medium® D with Gentamicin For Human Amniotic Fluid Cells

1. Hücreleri konsantre etmek için amniyotik sıvıyı düşükhızla santrifüjleyin.2. Hücre pelletini hastanın kendi amniyotik sıvısınınküçük bir hacmi içinde yeniden süspanse edin. Örneğininceltilmiş 10 mL amniyotik sıvının üst fazını hücrepelletinin 0.5 mL üstüne çekin ve yeniden süspanseedin. Lamel (toplam 4 lamel) başına 0.5 mL’lik veyaflasket başına 2 mL’lik son kaplama hacmi sağlamakiçin, konsantre hücre süspansiyonuna yeterli miktardaGentamisinli Chang Medyum D ekleyin.3. Kültürleri 37°C %5 CO2’lik atmosferde kendi halinebırakarak inkübe edin.4. İkinci günde kültürlere 2 mL Gentamisinli ChangMedyum D ekleyin.5. 4-5 gün sonra kültürlerin gelişim durumu kontroledilmelidir. Gelişim gözlenir gözlenmez kültürlerbeslenmelidir. Kültürleri beslemek için tüm kültür üstfazını atın ve 2 mL yeni Gentamisinli Chang MedyumD ekleyin. Bunun ardından kültürlerin her 2 günde birbeslenmesi tavsiye edilmektedir.6. Beşinci günde veya sonrasında kültürlerin gelişimdurumunu kontrol edin ve yeterince koloni gözlendiğindehasat yapın.7. En iyi sonuçların elde edilmesi için, kültürler hasattanönceki gün Gentamisinli Chang Medyum D ilebeslenmelidir.Chang Medium C’nin Primer Kültürler İçin Kullanımı:Flask Yöntemleri1. Hücreleri konsantre etmek için amniyotik sıvıyı düşükhızla santrifüjleyin.2. Hücre pelletini hastanın kendi amniyotik sıvısının küçükbir hacmi içinde yeniden süspanse edin. Örneğininceltilmiş 10 mL amniyotik sıvının üst fazını hücrepelletinin 1 mL üstüne çekin ve yeniden süspanse edin.Flask başına 5 mL’lik toplam hacim için 4 mLGentamisinli Chang Medyum D ekleyin.3. Kültürleri 37°C %5 CO2’lik atmosferde kendi halinebırakarak inkübe edin.4. Beşinci gün kültürlerin gelişim durumunu kontrol edinMedyumu yeni Chang Medium C ile değiştirin ve eğeryeterli hücre gelişimi gözleniyorsa hasat edin.5. Kültürlerin gelişim durumunu kontrol edin ve bundansonra yeterli koloni gözlenene ve hasada hazır olanakadar iki günde bir medyumu tamamen değiştirin.6. En iyi sonuçların elde edilmesi için, kültürler hasattanönceki gün Gentamisinli Chang Medyum D ilebeslenmelidir.Chang Medium C’nin Geçitli Amniyotik Sıvı HücreleriYetiştirmek İçin Kullanımı:Hücreleri geçitlemek için, normalde hücreler normalmedyumda yetiştirildiği zaman yaptığınız gibi kültürleretripsin (veya pronaz vs) uygulayın. Fakat proteaz uygulamasıdikkatli bir şekilde gözlenmelidir. Gentamisinli ChangMedyum D’de yetiştirilen amniyotik sıvı hücreleri, gelenekselmedyumda yetiştirilmiş amniyotik sıvı hücreleriylekarşılaştırıldığında proteaz uygulamasına karşı genellikledaha hassastır. Protokolünüzü bunu dikkate alacak şekildedeğiştirmeniz gerekebilir.