Chang Medium® D with Gentamicin For Human Amniotic Fluid Cells

1. Odstřeďte plodovou vodu při nízkých otáčkách akoncentrujte tak buňky.Anvendelse af Chang Medium D med gentamicin til primærekulturer: Metodologi in situ2. Rozpusťte buněčnou peletu v malém objemu plodovévody stejné pacientky. Například odsajte supernatant z10 ml plodové vody a ponechte jen 0,5 ml nad peletou.Poté znovu rozpusťte. Ke koncentrované buněčnésuspenzi přidejte dostatečné množství Chang MediumD s gentamycinem, abyste měli 0,5 ml suspenze najedno krycí sklíčko (celkem 4 krycí sklíčka) nebo 2 mlna kultivační lahvičku.3. Inkubujte kultury v klidu při teplotě 37 °C a v atmosféře5-8 % CO 2.4. Druhý den kultury zalijte 2 ml přípravku Chang MediumD s gentamycinem.5. Po 4 – 5 dnech zkontrolujte růst kultur. Jakmile začnourůst, je třeba dodat živiny. Odstraňte proto veškerýsupernatant a nahraďte 2 ml čerstvého Chang MediumD s gentamycinem. Poté doporučujeme doplňovat živinykaždé 2 dny.6. Dále růst kultury kontrolujte průběžně a odebertemateriál, jakmile se vytvoří dostatek kolonií.7. Optimálních výsledků dosáhnete odebráním materiáluden po přidání čerstvého média.Použití k primární kultivaci: kultivace v lahvích1. Odstřeďte plodovou vodu při nízkých otáčkách akoncentrujte tak buňky.2. Rozpusťte buněčnou peletu v malém objemu plodovévody stejné pacientky. Například odsajte supernatantz 10 ml plodové vody a ponechte jen 1 ml nad peletou.Poté znovu rozpusťte. Přidejte 4 ml přípravku ChangMedium D s gentamycinem do celkového objemu 5 mlna láhev.3. Inkubujte kultury v klidu při teplotě 37 °C a atmosféře5-8 % CO 2.4. Zkontrolujte růst 5. den. Vyměňte médium za čerstvéChang Medium D s gentamycinem, a pokud je kulturadostatečně narostlá, odeberte materiál.5. Poté denně kontrolujte růst kultury a zcela vyměňujtemédium, dokud se nevytvoří dostatek kolonií a nejsoupřipraveny k použití.6. Optimálních výsledků dosáhnete odebráním materiáluden po přidání čerstvého média.Použití k množení pasážovaných buněk z plodové vody:Chcete-li buňky pasážovat, ošetřete kulturu trypsinem(nebo pronázou atd.), jak to normálně provádíte u buněkpěstovaných v konvenčním médiu. Průběh ošetřeníproteázou však pečlivě monitorujte. Buňky z plodové vodykultivované v přípravku Chang Medium D s gentamycinembývají citlivější na ošetření proteázou než buňky zkonvenčního média. Možná bude nutné v tomto smysluupravit protokol.pH média používaného k doplnění živin musí být v rozmezí6,8–7,2 (médium tedy musí mít mírně nažloutlou lososovoubarvu). pH lze snadno upravit vložením média s mírněpovolenou čepičkou asi na 30 minut do inkubátoru satmosférou 5-8 % CO 2.Poznámka: V médiu se běžně tvoří krystalky oxalátuvápenatého. Přítomnost krystalků není podle všeho nazávadu funkci přípravku.1. Centrifuger amnionvæsken ved lav hastighed for atkoncentrere cellerne.2. Resuspender cellepelleten i en lille volumen afpatientens egen amnionvæske. Aspirer fxsupernatanten fra 10 ml centrifugeret amnionvæske til0,5 ml over cellepelleten, og resuspender. Tilsæt nokChang Medium D med gentamicin til den koncentreredecellesuspension for at få en endelig volumen på 0,5 mlpr. dækglas (i alt 4 dækglas) eller 2 ml pr. ampul.3. Inkubér kulturerne uforstyrret ved 37 °C i en atmosfæremed 5-8 % CO 2.4. Skyl kulturerne på dag 2 ved at tilsætte 2 ml ChangMedium D med gentamicin.5. Efter 4-5 dage skal kulturernes vækst kontrolleres.Kulturerne skal forsynes med nyt medium, nårvækst observeres. Dette gøres ved at fjerne helekultursupernatanten og tilsætte 2 ml friskt ChangMedium D med gentamicin. Det anbefales, at kulturerneforsynes med friskt medium hver 2. dag derefter.6. Kontroller kulturernes vækst på/eller efter dag 5 og høst,når der kan observeres nok kolonier.7. De bedste resultater opnås, hvis kulturerne forsynesmed Chang Medium D med gentamicin dagen inden,at de høstes.Anvendelse af Chang Medium D med gentamicin til primærekulturer. Metodologi med kolbe1. Centrifuger amnionvæsken ved lav hastighed for atkoncentrere cellerne.2. Resuspender cellepelleten i en lille volumen afpatientens egen amnionvæske. Aspirer fxsupernatanten fra 10 ml centrifugeret amnionvæsketil 1 ml over cellepelleten, og resuspender. Tilsæt 4ml Chang Medium D med gentamicin, så den totalevolumen er 5 ml pr. kolbe.3. Inkubér kulturerne uforstyrret ved 37 °C i en atmosfæremed 5-8 % CO 2.4. Kontroller væksten på dag 5. Udskift mediet medfriskt Chang Medium D med gentamicin og høst, hvistilstrækkelig cellevækst kan observeres.5. Kontroller kulturernes vækst og udskift medietfuldstændigt hver dag derefter, indtil nok kolonier kanobserveres, som er klar til at blive høstet.6. De bedste resultater opnås, hvis kulturerne forsynesmed Chang Medium D med gentamicin dagen inden,at de høstes.Anvendelse af Chang Medium D med gentamicin til dyrkningaf passerede amnionvæskeceller:Passage af cellerne opnås ved at behandle kulturernemed trypsin (eller pronase m.m.) som ved celler, derdyrkes i konventionelt medium. Proteasebehandling skalimidlertid overvåges nøje. Amnionvæskeceller, der dyrkesi Chang Medium D med gentamicin, har en tendens tilat være mere sensitive over for proteasebehandling endamnionvæskeceller, der dyrkes i konventionelt medium.Det kan være nødvendigt at ændre protokollen for at tagehensyn hertil.