Test fonctionnel de mesure des activités enzymatiques de ...

tel-00126858, version 1 - 26 Jan 2007
Sommaire
Objectifs de la thèse_____________________________________77
Partie expérimentale ____________________________________81
Chapitre I : Mise au point de la fabrication de la biopuce ____________________________ 85
I) Les différentes lésions présentes sur la biopuce________________________________________ 88
A) L’ADN portant les lésions______________________________________________________ 88
B) Préparation des plasmides portant les lésions _______________________________________ 88
1) La qualité des plasmides_____________________________________________________ 88
2) La qualité des lésions _______________________________________________________ 89
3) Choix du nombre de lésions par plasmide _______________________________________ 89
C) Les différents plasmides présents sur la biopuce_____________________________________ 90
1) Plasmide contrôle __________________________________________________________ 90
2) Plasmide portant les dimères de cyclobutane de pyrimidine et les photoproduits(6-4)_____ 90
3) Les plasmides portant des produits d’oxydation de bases ___________________________ 92
4) Plasmide portant des bases alkylées ____________________________________________ 94
5) Les plasmides portant des pontages ____________________________________________ 96
6) Plasmide portant des sites abasiques ___________________________________________ 97
D) Organisation des dépôts sur la biopuce ____________________________________________ 98
II) Réalisation des dépôts à l’aide du robot de dispense ___________________________________ 100
A) Le robot de dispense ScieFlexarrayer ____________________________________________ 100
1) Présentation du robot et caractéristiques techniques ______________________________ 100
2) Fonctionnement du robot ___________________________________________________ 100
3) La technologie de dispense piézoélectrique _____________________________________ 102
B) Mise au point des paramètres de dépôt ___________________________________________ 103
1) Le lavage de la buse de dispense _____________________________________________ 103
2) Choix du nombre de gouttes par dépôt_________________________________________ 105
3) Choix du volume de prélèvement_____________________________________________ 107
4) Conditionnement de la buse de dispense et reproductibilité_________________________ 109
III) Le support utilisé pour réaliser la biopuce ________________________________________ 109
A) Lames de Poly-L-Lysine ou lames Hydrogel ______________________________________ 110
1) Morphologie des dépôts ____________________________________________________ 110
2) Signal de réparation obtenu _________________________________________________ 111
3) Conservation des plasmides sur le support______________________________________ 113
4) Conclusion ______________________________________________________________ 116
B) Analyse par microscopie confocale du support_____________________________________ 116
1) Présentation de la microscopie confocale_______________________________________ 117
2) Localisation des plasmides et de la réparation dans l’Hydrogel______________________ 118
3) Conclusion ______________________________________________________________ 120
C) Fabrication de lames hydrogel _________________________________________________ 121
1) Problèmes rencontrés avec les lames Perkin Elmer _______________________________ 121
2) Mise au point de lames hydrogel _____________________________________________ 121
IV) Conclusion ________________________________________________________________ 125