la revue internationale sur bananiers et plantains - Bioversity ...

outils biotechnologiques modernes, des gènes
susceptibles d’influer la lutte contre la maladie des
raies noires ont été isolés. Les techniques de culture
de tissus et de cellules sont aussi utilisables.
Dans cette étude, nous comparons une
méthode déjà existante de transformation du
bananier au moyen d’Agrobacterium avec la
méthode de transformation du bananier par
bombardement de particules. Nous avons ensuite
perfectionné la méthode de transformation au
moyen d’Agrobacterium en modifiant la durée
de l’infection, l’âge et le volume des suspensions
embryogéniques. Les effets de la polyamine
spermidine sur la capacité de régénération des
clones de cellules embryogéniques transformées
ont été démontrés. La transformation et l’intégration
des gènes de la chitinase du riz Cht-2 et Cht-3
dans le bananier sont présentées. Les chitinases
sont des enzymes qui hydrolysent et coupent
la chitine, un composant majeur de la plupart
des champignons. Nous avons aussi évalué
la possibilité d’introduire plus d’un gène et de
développer une méthode rapide de détection des
gènes multiples. Les effets de l’emploi d’un gène
marqueur simple sont comparés à ceux de deux
différents gènes marqueurs sélectionnables. Cette
étude est encore en cours et l’activité chitinase est
analysée dans les lignées transgéniques générées.
26 lignées sont testées au champ en Ouganda.
Caractérisation et isolement de promoteurs du bananier
étiquetés par ADN-T actifs durant la régénération in
vitro et réactifs aux basses températures
Efrén Germán Santos Ordóñez
Thèse présentée en avril 2008* à la
Katholieke Universiteit Leuven, Leuven,
Belgique
Une stratégie d’étiquetage par ADN-T de
tout le génome a été effectuée pour la
caractérisation et l’isolement de nouveaux
promoteurs du bananier. Des suspensions
cellulaires embryogéniques de bananier ont
été transformées au moyen d’Agrobacterium
tumefaciens dotée du gène de la luciférase
(luc+) optimisé par codons et sans promoteur
à la frontière droite de l’ADN-T. Environ 89 000
colonies cellulaires transgéniques de bananier
ont été criblées pour leur luminescence, de
deux à trois mois après la transformation, en
utilisant un système caméra sophistiqué dans
une boîte étanche à la lumière. Le criblage
est effectué en conditions contrôlées de
température, la luminescence est examinée
en temps réel à 26°C puis à des températures
basses (LT) décroissantes, 18°C, 16°C, 12°C
et 8°C. Le taux de colonies cellulaires montrant
une luminescence à 26°C et sous les différents
traitements LT a varié de 0,17% à 2,69%. Les
colonies cellulaires transgéniques répondant
à 8°C (montrant un profil d’expression
stimulée ou réprimée de la luciférase)
ont été régénérées en plantules et leur
luminescence examinée à différents stades du
développement in vitro. Avec l’accroissement
de la différenciation, le nombre de lignées
montrant une expression LUC induite par LT
a décru. Les plantules de bananier montrant
une luminescence ont été analysées pour le
nombre de copies de l’ADN-T par hybridation
de Southern. Le nombre d’inserts ADN-T était
en moyenne de 3,6 (allant de 1 à 5) dans 10
lignées indépendantes testées. Les séquences
d’ADN flanquant les frontières droite et gauche
de l’ADN-T ont été isolées par TAIL-PCR
(PCR à asymétrique thermique entrelacée)
et PCR inverse. La continuité de séquence
entre les séquences flanquant les frontières
droite et gauche correspondantes a été
révélée par liaison PCR en utilisant des
amorces spécifiques. L’analyse RT-PCR
a été effectuée dans les lignées à inserts
multiples pour identifier et confirmer la
séquence qui a activé l’expression de la
luciférase. Quatre séquences promoteurs
candidates, qui ont été fusionnées par
transcription au gène luc+, ont été clonées
en amont d’un gène rapporteur uidAINT et
transformées de nouveau au bananier, ce qui
a permis de confirmer l’activité de promoteur
pour deux séquences dans les cultures
in vitro. L’activité du promoteur dans des
plants de bananier matures reste à étudier.
En conclusion, un système d’étiquetage
à haut débit par l’ADN-T nous a permis
de caractériser et d’isoler des nouveaux
promoteurs du bananier exploitables dans
plusieurs applications dont la sélection de
bananier par modification génétique.
*Note de l’éditeur : Le report d’impression de ce dernier
numéro d’INFOMUSA nous a fourni l’opportunité d’ajouter
les résumés de deux thèses présentées en 2008 qui peuvent
être du plus grand intérêt pour nos lecteurs.
InfoMusa - Vol. 16 N° 1-2, Juin et décembre 2007 33
Thèse