Prolil endopeptidasa eta piroglutamil peptidasa I ... - Euskara
Prolil endopeptidasa eta piroglutamil peptidasa I ... - Euskara
Prolil endopeptidasa eta piroglutamil peptidasa I ... - Euskara
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Teknika<br />
Metodoak<br />
Substratu soluzioaren mililitro bakoitzari, aktibitatea ezagutu nahi zen<br />
homogenizatuaren 50 mikrolitro gehitzen zitzaion <strong>eta</strong> 37 gradu zentigradutan inkubatu<br />
30 minututan zehar. Denbora hau pasatzean, erreakzio entzimatikoa gelditzen zen<br />
az<strong>eta</strong>to 0,1 M, pH=4,2 soluzio indargetzailearen mililitro bat gehituz.<br />
Entzimatikoki askatutako β-naftilamina, espektrofluorometrikoki neurtzen zen<br />
345 nm-tako kitzikapena <strong>eta</strong> 412 nm-tako igorpena hautatuz. Lagin guztiak hiru al<strong>eta</strong>n<br />
neurtu ziren. Zuria egiteko substratu soluzioa, laginik gabe <strong>eta</strong> az<strong>eta</strong>toa gehitu ondoren<br />
erabiltzen zen.<br />
Espektrofluorimetroan lortutako balioak askatutako β-naftilaminaren pikomol<br />
bihurtzen ziren. Hon<strong>eta</strong>rako, β-naftilaminaren kontzentrazio ezagunak, fosfato<br />
indargetzaile (50 mM, pH=4,2) soluzioan (substratuaren soluzio berean)<br />
flurometrikoki neurtuz lortu zen erregresio kurba erabili zen. Estrapolazioa PC<br />
ordenagailu bidez egin zen.<br />
Ondoren, datu hauek <strong>peptidasa</strong> aktibitate-unitate<strong>eta</strong>n (PU) aurkezten genituen.<br />
Unitate hauek substratu fluorogenikoaren pikomol bat minutuko hidrolisatzen duen<br />
entzima kantitatea adierazten dute. Azkenengo emaitza aktibitate espezifiko bezala<br />
ematen da; hau da, PU mg proteina bakoitzeko (PU/mg proteina).<br />
5. PROTEINEN NEURKETA:<br />
Oinarria<br />
Lagin<strong>eta</strong>n dagoen proteina kontzentrazioa kalkulatzeko metodoa Coomasie<br />
urdin disdiratsu izeneko koloranteak polipeptidoekiko duen afinitatean oinarritzen da<br />
(Bradford, 1976). Teknika kolorimetrikoa da, hau da, zenbait konposatu kimikok argia<br />
zurgatzeko duten gaitasunean oinarritzen da.<br />
Kolorantea proteinekin lotu <strong>eta</strong> gai kimiko horren zurgapenaren uhin luzeran<br />
aldak<strong>eta</strong> bat gertatzen da, 465 nm-tik 595 nm-tara pasatuz. Zurgapenaren gehikuntza,<br />
kolorantea saturantea izanik, proteina kontzentrazioarekiko zuzenki proportzionala da.<br />
Honela, absortzioaren gehikuntza espektrofotometro edo kolorimetro batean neurtuz<br />
proteina kantitate ezagunekin egindako zurgapen patroi-zuzen batean interpola<br />
daiteke.<br />
Materialak <strong>eta</strong> Metodoak 93
Change language