Capitolo 2 - Omero

Questa serie di reazioni viene eseguita automaticamentein apparecchi specifici, che prendono il nome di"sequenziatori automatici di proteine", in cui èpossibile ottimizzare le condizioni delle singole fasidel processo degradativo e quindi riuscire adidentificare più di 60 residui della porzione N-terminale della proteina. L'identificazione degliamminoacidi rilasciati nei cicli successivi diventaproblematica, a causa degli effetti cumulativi direazioni incomplete e di reazioni secondarie delprocesso di degradazione. Questi apparecchi permettonodi poter lavorare con quantità molto basse di proteina,nell'ordine di decine di pmoli.Questi sequenziatori sono collegati on line con un HPLCdotato di una colonna in fase inversa, su cui vengonoiniettati automaticamente i PTH ottenuti ad ogni ciclodi degradazione. Il riconoscimento a 269 nm e l'analisiquantitativa di ogni PTH avviene per confronto con PTHstandard. E'chiaro che il riconoscimento può avveniresenza problemi solo se è presente un solo PTH per ogniciclo di degradazione di Edman.Per poter determinare la struttura primaria di unaproteina è quindi necessario che la proteina sia puraalmeno per il 90%. Nel caso in cui la proteina siacostituita da subunità differenti è necessario, inoltre,separare le subunità e operare su ogni singola subunità.