Schede di attività - Epidemiologia eziologica / 2012 - CPO

Epidemiologia eziologicaCentro di Riferimento per l'Epidemiologia e la Prevenzione Oncologica in PiemonteScheda: 4.046Rilevamento dello stato di integrazione di papillomavirus di ceppo 16 inlesioni cervicali pre-neoplastiche confermato con DIPS-PCR esequenziamentoDetection of human papillomavirus type 16 integration inpre-neoplastic cervical lesions and confirmation by DIPS-PCR andsequencingRESPONSABILE: Prof. Franco MERLETTIOBIETTIVI GENERALI E SINTESI PROGETTO:Analizzare lo stato fisico dell’infezione da papillomavirus di ceppo 16 (HPV16) in lesioni cervicalipre-neoplastiche utilizzando un metodo di analisi quantitativa in real time-PCR (QRT-PCR) dellesequenze virali integrate.Allestire uno studio preliminare per valutare l’affidabilità di tale metodo nell’identificazione disequenze di HPV16 integrate nel genoma della cellula ospite attraverso la conferma dei risultaticon un metodo “gold standard” rappresentato dalla DIPS-PCR (Detection of IntegratedPapillomavirus Sequences) seguita da sequenziamento.Utilizzare il metodo in QRT-PCR per analizzare un’ampia casistica di lesioni cervicalipre-neoplastiche raccolta nel corso dello Studio NTCC (PI G, Ronco).Valutare il ruolo dell’identificazione precoce dello stato di integrazione virale per l’identificazioneed il monitoraggio di soggetti a più alto rischio di progressione neoplastica.MATERIALI, METODI E RISULTATI ATTESI:Per lo studio preliminare sono stati selezionati 170 campioni d’archivio di cellule cervicali ottenutida donne coinvolte in programmi di screening per il carcinoma della cervice uterina organizzati aTorino tra il 1996 ed il 2002. Tutti i 170 campioni risultavano positivi a ceppi di HPV ad alto rischiodi carcinogenesi, e sono stati testati per la presenza di HPV16 DNA. Nei campioni risultati positiviper HPV16 DNA è stata valutata la presenza di sequenze virali integrate nel genoma delle celluleospiti mediante QRT-PCR. I risultati sono stati confermati con DIPS-PCR e successivosequenziamento.STATO DI AVANZAMENTO AL 31/12/2011:Lo studio preliminare è stato concluso e i risultati che dimostrano l’affidabilità del metodo diindagine e ne validano l’impiego in studi su vasta scala sono stati raccolti in un manoscrittopubblicato su J. Clin Virol nell’anno 2007.E’ in corso l’analisi sulla casistica di campioni cervicali HPV 16 e HPV 18 positivi raccolti nel corsodello Studio NTCC (PI G, Ronco).Sono stati conclusi i seguenti processi:1. raccolta dei campioni e allestimento di una banca biologica di campioni di cellule cervicalipositivi a ceppi di HPV ad alto rischio con diagnosi istologica definita raccolti nell’ambito dellostudio NTCC (PI G, Ronco) in seguito a screening con test molecolare Hybrid Capture 2.2. estrazione di DNA dai campioni positivi ad HPV ad alto rischio3. genotipizzazione dei ceppi virali4. messa a punto della metodiche per l’analisi in QRT-PCR del carico virale e dello stato diinfezione (episomale o integrato) non solo di HPV16 ma con estensione ad altri genotipi virali :HPV18 e HPV 315. messa a punto di una metodica con impiego di Sybr Green come intercalante del DNA peranalizzare in QRT-PCR il carico virale di tutti gli altri ceppi ad alto rischio identificabili con i primersGP5+/6+.6. analisi in QRT-PCR dello stato di infezione (episomale o integrato) da HPV 16 e HPV 18 neicampioni dello studio NTCC.Sono in corso i seguenti processi:7. analisi statistiche dei risultati dello stato di infezione da HPV 16 e HPV 18 nei campioni NTCC in40