Schede di attivitÃ - Epidemiologia eziologica / 2012 - CPO

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Epidemiologia eziologicaCentro di Riferimento per l'Epidemiologia e la Prevenzione Oncologica in PiemonteScheda: 4.055Frequenza e infettività di HCV-RNA nei linfociti di soggetti conpatologie non correlate ad HCVHCV-RNA frequency and infectivity in perypheral blood lymphocytes ofsubjects free of HCV related pathologiesRESPONSABILE: Prof. Franco MERLETTIOBIETTIVI GENERALI E SINTESI PROGETTO:Recentemente, è stata descritta una nuova patologia definita “infezione occulta da virusdell’epatite C” (HCV occulta), caratterizzata dalla presenza di HCV-RNA nei linfociti periferici enelle cellule epatiche, e dall’assenza sia di anticorpi diretti contro il virus sia di RNA virale nelsiero. Nei linfociti del sangue periferico dei pazienti con infezione occulta da HCV è stata descrittala capacità di replicazione di HCV. Sebbene questi pazienti non siano sierologicamente positivi alvirus, potrebbero essere potenzialmente infettivi.Studi preliminari condotti presso il Laboratorio di Epidemiologia Molecolare del CeRMS di Torinohanno evidenziato su un campione di 276 soggetti italiani sani, negativi per sierologia e viremia,una frequenza pari circa al 3% di HCV-RNA nei linfociti. Tale condizione è riconducibile al quadrodescritto come “infezione da HCV occulta”.Al momento non esistono dati di frequenza di HCV-RNA nei linfociti della popolazione sana.Nonostante HCV sia ormai riconosciuto come agente causale del tumore del fegato, al momento imeccanismi della carcinogenesi virale non sono noti. Studi sulla frequenza di HCV occulta e sullapotenziale infettività virale di linfociti positivi a HCV-RNA potranno fornire indizi rilevanti suimeccanismi patogenetici e sull’opportunità di avviare successivi studi su più ampia scala volti astimare il rischio di cancerogenesi epatica.Lo studio attuale si propone i seguenti obiettivi:1. selezionare soggetti con HCV occulta all’interno di una popolazione priva di patologie epaticheclinicamente evidenziabili o di patologie HCV correlate;2. condurre uno studio di infettività virale di HCV in pazienti in cui sia stata ritrovata la condizionedi HCV occulta: ovvero valutare il potere infettivo di linfociti positivi ad HCV-RNA;3. valutare se nei linfociti di questi soggetti sia presente uno o più genotipi prevalenti;4. valutare l’eventuale presenza di varianti virali (quasi-species) nei linfociti;5. valutare l’eventuale presenza, tra le varianti, di virus difettivi.MATERIALI, METODI E RISULTATI ATTESI:In collaborazione con la UOA Banca del Sangue dell’ASO S. Giovanni Battista di Torino, è stataeffettuata la selezione tra i pazienti che afferiscono per una flebotomia (salasso) alla loro unità, dicirca 400 soggetti con patologie non correlate ad infezione da HCV (policitemia vera,emocromatosi, emosiderosi secondaria, poliglobulia secondaria).Sono stati inclusi nello studio i pazienti risultanti negativi alla ricerca sierologica per HCV, HBV eHIV e negativi per la presenza di HCV-RNA nel plasma. Sono stati inoltre inseriti nello studio, inqualità di controlli positivi, circa 50 soggetti afferenti all’UOA Banca del Sangue che si sonopresentati alla prima donazione e che sono risultati essere positivi al virus HCV.Per la rilevazione del genoma virale, L’RNA è stato estratto da buffy coat e plasma, retrotrascrittoa cDNA utilizzando “random primers” e controllato per adeguatezza tramite amplificazione delgene della b-actina.Per la rilevazione di HCV-RNA nella frazione leucocitaria, è stato utilizzato un kit commerciale (AlfaWasserman, Milan, Italy) basato sull’impiego di una miscela di amplificazione pronta all’uso,contenente primers altamente conservati e specifici per l’amplificazione della regione 5’UTR diHCV attraverso nested-PCR.La genotipizzazione è stata effettuata mediante kit commerciali Line Probe Assay (LiPA) e/osequenziamento diretto della regione UTR 5’terminale.L'analisi delle varianti virali o quasispecies sarà effettuata su tutti i campioni risultati positivi aHCV-RNA nei linfociti. Sarà amplificata, mediante “nested-PCR” la regione virale del frammentorelativo al punto di giunzione dei geni E1/E2, inclusa la sequenza ipervariabile (HVR-1) di 81nucleotidi. I prodotti di PCR saranno sottoposti a purificazione, e successivamente le varianti dellaregione E1/E2 di HCV saranno clonate in vettori pGEM in seguito inseriti in cellule batterichecompetenti di E. coli. Saranno poi selezionate, su base colorimetrica le colonie batteriche che50
Epidemiologia eziologicaCentro di Riferimento per l'Epidemiologia e la Prevenzione Oncologica in PiemonteScheda: 4.055conterranno il plasmide con la sequenza variante d’interesse, destinata alla caratterizzazionemediante sequenziamento.Per lo studio sulla potenziale infettività virale è stata avviata una collaborazione con laboratori dibiologia cellulare utilizzando linfociti vitali archiviati e conservati in azoto liquido sino al momentodell’uso.STATO DI AVANZAMENTO AL 31/12/2011:Sono stati conclusi i seguenti processi:1. selezione e reclutamento dei soggetti presso la Banca del Sangue. Sono stati 450 soggetticonsecutivi tra pazienti (policitemia vera, poliglobulia secondaria, emocromatosi, emosiderosisecondaria) che afferiscono all’ambulatorio salassi presso la Banca del Sangue dell’OspedaleMolinette previa richiesta di consenso informato così distribuiti: 400 con patologie non-HCVcorrelate e 50 come popolazione di controllo con patologie HCV correlate (soggetti negativi allaricerca per HBsAg e anti-HIV1-2, ma positivi alla ricerca per anti-HCV e aspiranti donatori disangue risultati non idonei per positività confermata ai test anti-HCV e/o HCV-RNA).2. E’ stato allestito un database in formato elettronico in cui sono registrati i codici identificatividei soggetti e le informazioni relative all’archivio dei campioni in studio e ai risultati dell'analisiserologiche e molecolari.3. Sono state prelevate da ogni paziente inserito nello studio 4 provette in EDTA per la ricerca diHCV-RNA nei linfociti e nel plasma e per la ricerca di anti-HCV, HBsAg, anti-HIV1-2. Dalle provettedi sangue raccolte in EDTA sono state eseguite la separazione delle frazioni ematiche percentrifugazione e la raccolta del buffy-coat e plasma, nonchè di linfociti “vitali” separati congradiente di densità Fycoll, con immediato stoccaggio a temperatura di -80°C, presso i locali delCeRMS.4. Dal buffy/coat e dal plasma di tutti i campioni è stato estratto l’RNA poi retrotrascritto a cDNA esono state eseguite le indagini per la ricerca di HCV-RNA.5. Sui tutti i casi HCV-RNA positivi nel plasma e /o nel buffy coat è stata eseguita lagenotipizzazione.6. Sui casi HCV-RNA positivi solo nel buffy coat è stata ripetuta l'analisi per HCV-RNA dopoultracentrifugazione della frazione plasmatica, a conferma della condizione di HCV occulta.7. Su tutti i soggetti in studio è stata effettuata il dosaggio delle transaminasi seriche.8. Sui soggetti HCV-RNA positivi nel buffy coat è stata eseguita l'analisi della potenziale infettivitàvirale in collaborazione con laboratori di biologia cellulare utilizzando i linfociti vitali conservati inazoto liquido.Sono in fase di avvio i seguenti processi:1. follow-up dei pazienti risultati positivi alla presenza HCV-RNA solo nel buffy-coat per valutareclearance o persistenza del virus.COLLABORATORI INTERNI:Laura DE MARCO, Valentina FIANO, Anna GILLIO-TOS, Lorenzo RICHIARDI, Morena TREVISANCOLLABORATORI ESTERNI:Franco Curti.RISORSE E FINANZIAMENTO:Compagnia S. Paolo/FIRMS, Ricerca Sanitaria Finalizzata.PUBBLICAZIONI:DE MARCO L, GILLIO TOS A, FIANO V.,RONCO G, KROGH V, PALLI D, PANICO S, TUMINO R, VINEIS P, MERLETTIF, RICHIARDI L, SACERDOTE C. Occult HCV infection: an unexpected finding in a population unselected forhepatic disease. PLoS ONE 4:e8128,2009.DE MARCO L, MANZINI P, TREVISAN M, GILLIO TOS A, DANIELLE F, BALLOCO C, PIZZI A, DE FILIPPO E, D'ANTICOS, VIOLANTE B, VALFRE' A, CURTI F, MERLETTI F, RICHIARDI L.Prevalence and follow up of occult HCV infection in an italian population free of clinically detectable infectiveliver disease. Submitted51
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