Transgene dieren

Methoden van Transgenese
Een gen-overdrachtsmethode moet aan de volgende
voorwaarden voldoen: een relatief groot DNA-molecuul
zoals een genconstruct moet de twee fysieke barrières
gevormd door respectievelijk de celmembraan en de
kernmembraan kunnen passeren zonder dat daarbij de
cel of het construct zelf wordt beschadigd. In de loop
der jaren is in celcultures daarvoor een scala van genoverdrachtstechnieken
ontwikkeld. Bij transgenese worden,
afhankelijk van de diersoort en het embryonale stadium
waarin de genoverdracht plaatsvindt, verschillende
methoden gebruikt.
Bij de muis zijn er drie hoofdmethoden van transgenese
te onderscheiden: (zie fig.1.)
a. Micro-injectie van DNA in één van de twee voorkernen
van een bevruchte eicel.
b. Infectie van pre-implantatie embryo’s met (retro)virale
vectoren.
c. Transfectie van embryonale stamcellen (ES-cellen),
die vervolgens in een pre-implantatie stadium van het
embryo worden geïnjecteerd.
Micro-injectie
Eind jaren 70 van de vorige eeuw werd de techniek geïntroduceerd
van injectie van een oplossing van DNA,
direct in de nog niet gefuseerde haploïde voorkern van
een bevruchte eicel (figuur 2). Aan deze succesvolle en
meest toegepaste methode is sinds die tijd fundamenteel
niets veranderd. Omdat een zoogdier eicel is omgeven
door een sterke, nauwelijks doordringbare eiwitmantel,
de zona pellucida, is deze mechanische methode van
micro-injectie de meest effectieve manier van gen-overdracht
gebleken voor transgenese bij zoogdieren (zie
voor details kadertekst en ook fig.9).
Na injectie worden de eicellen meestal gedurende een
nacht gekweekt in speciaal medium, in een incubator,
onder condities zoals die gebruikelijk zijn voor standaard
cel-cultures. De volgende ochtend worden in een schijnzwangere
draagmoeder per eileider ongeveer 15 eicellen,
die een deling hebben ondergaan (meer dan 90%), operatief
teruggeplaatst met behulp van een glascapillair.
Maximaal 25% van de muizen die 21 dagen later worden
geboren, hebben het geïnjecteerde DNA-construct stabiel
geïntegreerd in hun genoom, in de meeste zo niet alle
cellen van hun lichaam. Omdat 80% van deze dieren het
nieuw verworven DNA aan hun nakomelingen doorgeeft
volgens de wetten van Mendel (50% van de nakomelingen
transgeen) kan worden geconcludeerd dat integratie
10
van het geïnjecteerde DNA in het genoom efficiënt verloopt
in een vroege fase van het pre-embryo (figuur 2).
Micro-injectie
Een zeer dunne glascapillair (injectie pipet, ø uiteinde
= 0,5µm) gevuld met een waterige oplossing van
DNA (2-4 µg/ml) wordt door de zona pellucida van de
doorzichtige eicel (ø = 85 µm) geprikt tot in een van
de twee voorkernen (ø = 20 µm). Vervolgens wordt
met de injector, een elektrisch apparaat dat door
middel van een slangetje aan de injectiepipet is
bevestigd, een kleine, nauwkeurig te regelen hoeveelheid
(2-4 picoliter) van de DNA-oplossing geïnjecteerd,
door een met de injector verbonden voetpedaal
in te drukken waardoor een korte regelbare
luchtdrukpuls wordt gegeven. De eicel wordt voor de
handelingen in de juiste positie gehouden met
behulp van een tweede met olie gevulde dikkere
capillair (de houder pipet) die met een slangetje is
gekoppeld aan een microschroef, waaraan de eicel
wordt vastgezogen. Beide capillairs zijn vastgeklemd
in micromanipulatoren die zijn bevestigd op de
objecttafel van een (omkeer)microscoop en die worden
bediend met behulp van ‘joysticks’. Om alle
handelingen adequaat te kunnen uitvoeren, is een
200-400X vergroting vereist. Met behulp van speciale
zgn. interferentiecontrast objectieven (Nomarski)
kunnen de voorkernen goed zichtbaar worden
gemaakt.
De geïnjecteerde moleculen integreren meestal in de
vorm van een reeks in ‘kop-staart’ volgorde aan elkaar
gekoppelde kopieën, op een willekeurige plaats in het
genoom. Zowel de plaats van integratie als het aantal
kopieën kan de expressie van het transgen sterk beïnvloeden.
De eerder genoemde isolatorelementen verminderen
het effect van integratieplaats.
Daarnaast kan integratie plaatsvinden in of nabij een
functioneel gen dat daarmee kan worden uitgeschakeld.
Betreft het een essentieel gen dan zullen transgene muizen
met het transgen op die plaats in het genoom in
homozygote vorm niet levensvatbaar zijn. Schattingen
geven aan dat dit zich in ruim 10% van de integraties
voordoet.