Transgene dieren

wijze ingebracht transgen meestal niet goed tot expressie
bleek te komen. Met vectoren afgeleid van lenti-virussen,
een klasse retrovirussen waartoe ook het AIDS virus
behoort, is dat probleem onlangs overwonnen. Daarmee
is de belangstelling voor het gebruik van virale vectoren
voor transgenese weer sterk toegenomen. Vooral omdat
dergelijke vectoren zeer geschikt zijn gebleken om speciale
korte RNA moleculen (siRNA) tot expressie te brengen,
die zo zijn gemaakt dat ze complementair zijn aan
een deel van een bekend boodschapper RNA (mRNA). Na
te zijn gebonden aan het complementaire deel van dit
mRNA bewerkstelligen deze siRNA moleculen de afbraak
van het volledige mRNA, zodat dit niet meer in eiwit kan
worden vertaald. Deze nieuwe vorm van interventie, ditmaal
op RNA niveau, aangeduid met RNAi (“RNA interference”),
heeft zijn bruikbaarheid in celkweek al nadrukkelijk
bewezen. Hoewel het aantal succesvolle voorbeelden
nog beperkt is, lijkt RNAi ook in levende dieren een nieuw
krachtig en vooral ook snel hulpmiddel te worden om de
functie van genen te analyseren.
De infectie van bevruchte eicellen vindt plaats door middel
van injectie van een virus suspensie onder de zona
12
Een dunne glascapillair (injectiepipet waarvan de binnendiameter
iets groter is dan de diameter van een
ES-cel), verbonden met een microschroef en waarin 8
tot 12 ES-cellen zijn opgezogen, wordt door de zona
pellucida tussen twee cellen van het trophectoderm
door tot in de blastocoel geprikt. Vervolgens worden
met behulp van de microschroef de ES-cellen in de
blastocoel geïnjecteerd. Of de muizen die 19 dagen na
de manipulaties worden geboren daadwerkelijk
mozaïek zijn, kan eenvoudig worden bepaald door
gebruik te maken van ontvanger-blastocysten afkomstig
van een muizenstam met een andere vachtkleur
(bijvoorbeeld zwart) dan die waarvan de ES-cellen
afkomstig zijn (bijvoorbeeld wit). Een chimaera verraadt
zich onmiddellijk door het (zwart/wit) vlekkenpatroon
van zijn vacht. De mate waarin de vachtkleur
aanwezig is van de stam waarvan de ES-cellen afkomstig
zijn, is een directe indicatie voor de bijdrage van
de ES-cellen aan de chimaera (figuur 5).
Het maken van chimere muizen
pellucida of door infectie van bevruchte eicellen waarvan
de zona pellucida is verwijderd. In vergelijking met microinjectie
is de kans op schade aan het embryo bij infectie
verwaarloosbaar. Er is een efficiëntie gerapporteerd in de
orde van 98% transgene nakomelingen. De directe infectie
van embryo’s, waarvan de zona pellucida is verwijderd,
stelt minder hoge technische eisen dan microinjectie
en is daarom goedkoper en vooral geschikt voor
laboratoria die niet vertrouwd zijn met micro-injectie.
Bovendien lijkt deze route geschikt voor andere diersoorten,
waarin tot nu toe geen transgenese mogelijk is
gebleken. Bij vogels is het zelfs de enige succesvolle
methode van transgenese. Tegenover deze vele voordelen
staan onduidelijkheden met betrekking tot de biologische
veiligheid. In verband met mogelijke risico’s moet
het maken van transgene muizen met virale vectoren
daarom achter veiligheidsbarrières plaats vinden.
Wanneer echter de nakomelingen van met retrovirale
vectoren gemaakte transgene muizen ook worden
beschouwd als potentieel geïnfecteerde dieren, die achter
kostbare veiligheidsbarrières gehouden moeten worden,
ontstaan er aanzienlijke praktische problemen.
Men maakt voornamelijk gebruik van ES-cellen van
mannelijke oorsprong omdat een bijdrage van ‘mannelijke’
ES-cellen aan de ontwikkeling van het
geslachtsorgaan (kiembaan) van een chimeer resulteert
in de ontwikkeling van een mannetje, ongeacht
het geslacht van de ontvanger-blastocyst waarin deze
cellen zijn geïnjecteerd. Wanneer de altijd variabele
bijdrage van de ES-cellen aan het geslachtsorgaan
van de chimeer erg laag is, zal de hoeveelheid
geslachtscellen afkomstig van de ES-cellen gering
zijn. Daardoor zal de frequentie waarmee de in deze
ES-cellen aangebrachte genetische verandering op de
nakomelingen van de chimeer wordt overgedragen
eveneens erg laag zijn. Dit betekent over het algemeen,
dat er veel nakomelingen zullen moeten worden
gefokt om een nakomeling te verkrijgen met die genetische
verandering. Dat kan heel gemakkelijk met een
mannetje maar niet met een vrouwtje.