2013-21e jaargang juni 2013-nummer 2.pdf

More documents

Recommendations

Info

Tabel 1. PrimersequentiesOntwerp Target Sequentie PositieDetectie H. pylori:(28) UreA gen s:5’-GGGTATTGAAGCGATGTTTCCT-3’as:5’-GCTTTTTTGCCTTCGTTGATAGT-3’New Design UreA gen s: 5’-AGGAAACATCGCTTCAATACC-3’as: 5’-GCTTTGATTAGTGCCCATATTATG-3’Detectie claritromycine-resistentie:(21) 23SrRNA s: 5’-GGAGCTGTCTCAACCAGAGATTC-3’ 2071-2093as: 5’-CGCATGATATTCCCRTTAGCAG-3’ 2181-2201mycine-resistentie werd de nucleotide sequentie van hetPCR-product geanalyseerd.Het specificiteitspanel bestond uit in feces voorkomendebacteriën en andere Helicobacter-species, onder meerEscherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonasaeruginosa, Klebsiella oxytoca en pneumoniae, Enterococcusfaecalis, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, colien lari, en Helicobacter cinaedi, fenellii en pullorum.De PCR-reacties met DNA van bovenstaande microorganismenbleken alle negatief.MaagbioptenDe PCR werd gevalideerd op zowel H. pylori-kweekpositieveals kweeknegatieve maagbiopten van patiënten inhet LUMC. De kweek werd routinematig uitgevoerd inhet LUMC, waarbij maagbiopten binnen enkele uren naaankomst op het laboratorium werden ingezet op eenniet selectieve Columbia-agar met 5% schapenbloed enselectieve Pylori agar (bioMérieux Benelux B.V., Boxtel,Nederland). De platen werden micro-aerofiel geïncubeerdmet een groeicontrole en beoordeeld op dag 3 tot 5 en dag 7.Bij groei vond verdere determinatie plaats door middel vaneen Gram-preparaat en de oxidase-, katalase- en ureumtest.Voor de PCR werden de biopten overnacht gedigesteerddoor proteïnase K, waarna DNA werd geïsoleerd metbehulp van de Qiamp mini blood kit (Qiagen BeneluxB.V., Venlo, Nederland). PCR werd uitgevoerd in 45 cyclimet een annealingstemperatuur van 55° C op een CFX-96.SequentieanalyseVoor de gevoeligheidsbepaling van claritromycine werdDNA geamplificeerd met behulp van de 23S rRNA primers(tabel 1). Het gevormde PCR-product werd opgezuiverd metExo-SAP-IT (Isogen Life Science, Veldzigt, Nederland) envervolgens werd een cyclussequentiereactie uitgevoerdop een MyCycler (BioRad Laboratories B.V., Veenendaal,Nederland). De fragmenten werden opgezuiverdmet behulp van DyeEx (Qiagen Benelux B.V., Venlo,Nederland) en geanalyseerd op een ABI3130 sequencer(AppliedBioSystems, Californië, USA). De verkregensequenties werden handmatig geanalyseerd met behulpvan FinchTV (Geospiza, Inc, Seattle, USA) en VectorNTIAlignX software (Life Technologies, Bleiswijk, Nederland).ResultatenVan de twee geselecteerde primersets gaf de in-houseontwikkelde primerset het beste resultaat op verdunningenvan geïsoleerd H. pylori-DNA. Voor deze primerset werd deprobe FAM-TTGCCACGCCATCCATCACATCATC-BHQ1besteld waarna de PCR verder werd geoptimaliseerd.Real-time PCR werd uitgevoerd met Hotstar mastermix(Qiagen, Hilden, Duitsland), met 0,3 m M primers en 0,3 mM probe, en 2,5 mM extra MgCl2 bij een annealingstemperatuurvan 55 °C (data worden niet getoond). Verdunningentot 0,3 CFU werden met de PCR gedetecteerd.Vervolgens werd de PCR uitgevoerd op DNA geëxtraheerduit 48 bioptparen en twee enkele maagbiopten van 50patiënten. Van elke patiënt worden normaal gesprokentijdens endoscopie twee maagbiopten afgenomen; éénvan het corpus en één van het antrum. Van twee patiëntenbleek één van de biopten te ontbreken. Het panel bestonduit 13 kweekpositieve en 37 kweeknegatieve patiënten.Met de in-house real-time PCR werden 18 patiëntenpositief bevonden inclusief de 13 kweekpositieve biopten(tabel 2). In alle gevallen waren beide biopten van eenpaar zowel kweek- als PCR-positief. Van de vijf patiëntendie positief werden met PCR maar negatief bleven in dekweek, werden de klinische gegevens nagegaan. Bij vierTabel 2. Resultaten PCR op maagbiopten vs. kweekPatiënten Kweekpositief KweeknegatiefPCR-positief 13 5PCR-negatief 0 32Ned Tijdschr Med Microbiol 2013;21:nr265
Tabel 3. Gegevens patiënten met positieve PCR bij negatieve kweekKlinische gegevens/indicatie endoscopieBevindingenpathologieCt-waarde PCRH. pylori corpus/antrum-bioptPatiënt 1 Misselijk, braken micro-organismen verdacht 26,2voor H. pylori 25,1Patiënt 2 Buikkrampen aspecifieke 28,9ontsteking 28,9Patiënt 3 Rectaal bloedverlies aspecifieke 39,5ontsteking 39,1Patiënt 4 Bovenbuikpijn, aspecifieke 38,6verminderde eetlust ontsteking 32,6Patiënt 5 NASH-cirrose aspecifieke 30,7ontsteking 28,3van de vijf leek het te gaan om een reële infectie (tabel3), omdat de Ct-waarden van de PCR laag waren, er eeneerdere infectie met H. pylori was vastgesteld of omdat erhistopathologische aanwijzingen waren voor een infectiemet H. pylori. Bij één patiënt (patiënt 3, tabel 3) was eeninfectie met H. pylori minder waarschijnlijk op basis vande hoge Ct-waarde in beide biopten in combinatie metde beschikbare klinische gegevens en bevindingen bijgastroduodenoscopie.Bij 17 van de 18 PCR-positieve patiënten lukte het desequentie te bepalen. Bij drie van de 17 patiënten werdeen mutatie, coderend voor claritromycine-resistentie,aangetoond. In twee gevallen kwam dit overeen met hetresistentiepatroon gevonden in de kweek; in het derdegeval betrof het een patiënt waarvan de kweek negatiefwas. Dit bleek een patiënt te zijn die recent was behandeld,maar bij wie niet kon worden achterhaald of er nog steedsklachten bestonden.DiscussieOndanks het kleine aantal patiënten (n = 50) in dezestudie, bleek dat de sensitiviteit van de real-time PCR opmaagbiopten minstens zo goed was als die van de kweek.Alle kweekpositieve biopten werden gedetecteerd en dePCR detecteerde daarnaast nog eens vijf kweeknegatievebiopten (10%). Bij nadere analyse van klinische en pathologischegegevens zouden dit reële bevindingen kunnenzijn, wat suggereert dat de PCR gevoeliger is dan de kweek.Het feit dat H. pylori moeilijk te kweken is en alleen gedijtonder specifieke omstandigheden maakt het daarnaast ookaannemelijk dat een PCR sensitiever is dan kweek.In deze studie blijkt dat claritromycine-resistentie metbehulp van sequentieanalyse betrouwbaar te detecteren is.Dit zou betekenen dat laboratoria niet langer afhankelijkhoeven te zijn van de kweek om H. pylori te diagnosticerenen daarnaast toch informatie over claritromycinegevoeligheidte verkrijgen. Ook in laboratoria waar de kweeknog routinematig wordt uitgevoerd, kan sequentieanalysevan DNA geëxtraheerd uit een maagbiopt of DNA vaneen gekweekt H. pylori-isolaat, uitkomst bieden wanneerondanks een positieve kweek het antibiogram niet bepaaldkan worden.Het aantonen van H. pylori-DNA in feces zal een volgendestap in de verbetering van de diagnostiek zijn, aangeziendaarmee mogelijk de noodzaak van een invasieveendoscopie komt te vervallen. Er zijn reeds enkele studiesgepubliceerd waarbij een H. pylori-PCR op feces werdgeëvalueerd. De resultaten van deze studies wisselen. Zorapporteerden Schabereiter-Gurtner et al. een sensitiviteiten specificiteit van 98%, 30 terwijl Lottspeich et al. eensensitiviteit en specificiteit van respectievelijk 63% en100% beschrijven. 29 De toekomst zal moeten uitwijzenof detectie van H. pylori-DNA en het bepalen van de claritromycinegevoeligheidin feces een reële mogelijkheid is.ConclusieIn deze studie met een klein aantal patiënten (n = 50)blijkt de ontwikkelde real-time PCR een sensitieveremethode dan de kweek voor het aantonen van H. pyloriin maagbiopten. Daarnaast kan sequentieanalyse vanhet real-time PCR-product verkregen uit een maagbioptinformatie verschaffen over de claritromycinegevoeligheid.Invasieve diagnostiek in de vorm van endoscopie methet afnemen van biopten geldt nog steeds als de goudenstandaard voor het diagnosticeren van een H. pyloriinfectie.Wellicht wordt het in de toekomst mogelijk om H.pylori en eventuele resistentie te detecteren met behulp vaneen non-invasieve test.Ned Tijdschr Med Microbiol 2013;21:nr266
Page 1 and 2: 21 e Jaargang | Juni 2013 | Nummer
Page 3 and 4: Van de redactieDe jaargetijdenE. He
Page 5 and 6: ARTIKELVerleden, heden en toekomst
Page 7: Tabel 2. Percentage positieve EV- e
Page 10 and 11: 19. Harvala H, Robertson I, McWilli
Page 12 and 13: IntroductieProstaatcarcinoom is de
Page 14 and 15: Figuur 3. Incidentie van sepsis < 1
Page 16 and 17: 22. Isen K, Küpeli B, Sinik Z, Sö
Page 18 and 19: In summary, a successful molecular
Page 22 and 23: Referenties1. Allen P. What’s the
Page 24 and 25: COMBACTEOnderdeel een van het progr
Page 26 and 27: mogelijk in het geding is. Met het
Page 28 and 29: Figuur 2. Schema verificatie diagno
Page 30 and 31: VERENIGINGSNIEUWS‘Biofilms on the
Page 32 and 33: innenkomst op het laboratorium een
Page 34 and 35: PROMOTIES17 januari 2013J.M.A. van
Page 36 and 37: 24 mei 2013S.M.E. VrouenraetsNon-in
Page 38: Richtlijnen voor auteursHet Nederla

2013-21e jaargang juni 2013-nummer 2.pdf

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?