Especial microbiologia Pt. 1

Protocolos de Microbiologia Clínica
Coprocultura
Parte 1 - Salmonella e Shigella
• Carlos Henrique Pessôa
de Menezes e Silva
Doutor em Microbiologia
Microbiologista do Centro
Tecnológico de Análises
(CETAN), Vila Velha-ES
Consultor em Microbiologia do
Laboratório Landsteiner, Vitória-ES
: carloshenrique@cetan.com.br
A
convite da Revista Newslab, preparamos uma série denominada “Protocolos de Microbiologia Clínica”,
abordando os principais temas de interesse àqueles que militam na área, objetivando a educação continuada,
o aprimoramento científico e a aplicabilidade imediata das diretrizes sugeridas para que os setores
de Microbiologia Clínica dos laboratórios brasileiros possam realizar seus exames com acurácia e qualidade.
Proporcionaremos, ainda, uma visão crítica, com sugestões construtivas, para a melhoria da qualidade neste setor,
tanto para aqueles que já possuem um setor ativo, mas que desejam incrementá-lo com informações precisas e
coesas, quanto para os laboratórios de pequeno porte, os quais terão a oportunidade de implementar rotinas de
fácil execução com toda informação científica necessária. Inicialmente, abordaremos o tema Coprocultura, dividido
em duas partes para melhor interpretação. Bimestralmente, a Revista Newslab trará novos protocolos, a saber:
Urocultura, Microbiologia dos Líquidos Corporais Estéreis, Microbiologia das Secreções, Microbiologia do Sistema
Genital Humano e Micologia Clínica.
Introdução
As doenças diarréicas continuam
sendo uma freqüente causa de morte
ainda nos dias atuais, especialmente em
países em desenvolvimento. A incidência
anual e o perfil etiológico das diarréias em
diferentes populações podem variar de
acordo com os diversos fatores de risco,
tais como a idade muito jovem, deficiências
nutricionais, higiene inadequada de
alimentos e do próprio corpo, ausência
de cuidados sanitários básicos, acesso a
suprimentos de água contaminados e até
mesmo o verão, estação do ano que sempre
registra o maior número de casos de
internações devido às diarréias. Nos países
industrializados, a freqüência de casos de
diarréia por criança é de somente 0,5 a 2
episódios/criança/ano, enquanto que em
países em desenvolvimento este número
pode alcançar facilmente os 10 episódios/
criança/ano. Nos países industrializados
as diarréias por rotavírus predominam,
enquanto que nos países em desenvolvimento
as bactérias são comumente encontradas
nos casos de diarréia (18).
Quadro 1. Agentes etiológicos mais relacionados com as diarréias infecciosas
Bactérias Vírus Protozoários
Vibrio cholerae e outros
vibriões, Shigella spp., Salmonella
spp. (não tifóide),
E. coli (enterotoxigênica,
enteropatogênica clássica,
enteroinvasora, enterohemorrágica,
enteroagregativa),
Campylobacter jejuni,
Yersinia enterocolitica,
Clostridium difficile, Bacteroides
fragilis (enterotoxigênico)
Rotavírus, Adenovírus entérico,
Calicivírus, Astrovírus
Os agentes etiológicos envolvidos
nas diarréias infecciosas incluem muitas
espécies de bactérias, vírus e protozoários,
todos possuindo grande número de
sorogrupos e biotipos e sendo também
Entamoeba histolytica,
Giardia lamblia, Cryptosporidium,
Cyclospora
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Quadro 2. Características gerais de alguns microrganismos envolvidos em diarréias
Microrganismos
Fonte de Contaminação ou
Condição Predisponente
N o de Células que Levam à
Infecção
Período de Incubação
Aeromonas spp. Água Desconhecido Desconhecido
Bacillus cereus Carnes, vegetais Toxina 6-24 horas
Campylobacter jejuni Água, leite, carnes Desconhecido 3-11 dias
Clostridium difficile Terapia antimicrobiana Desconhecido 4-9 dias
Clostridium perfringens Carnes 10 9 – 10 10 8-16 horas
ETEC Alimentos, água 10 6 – 10 8 4-24 horas
EIEC Alimentos 10 6 – 10 8 8-24 horas
EHEC Carnes, leite Desconhecido 3-5 dias
Plesiomonas shigelloides Água, pescados Desconhecido 1-2 dias
Salmonella spp. Alimentos em geral 10 2 – 10 8 8-72 horas
Shigella dysenteriae Água 10-200 3-5 dias
Outras Shigella Água, alimentos 10-200 8-72 horas
Staphylococcus aureus Carnes, laticínios Toxina 1-6 horas
Vibrio cholerae Água, pescados 10 8 1-5 dias
Vibrio parahaemolyticus Pescados 10 6 - 10 8 15-24 horas
Yersinia enterocolitica Água, alimentos Desconhecido 16-48 horas
todos transmitidos pela via fecal-oral.
Pelo fato da grande diversidade de
microrganismos que podem estar envolvidos,
é virtualmente impossível para
qualquer laboratório clínico realizar um
completo exame de fezes diarréicas. Portanto,
os patógenos mais freqüentes são
investigados, dependendo da localização
geográfica e da estação do ano (13).
Shigella
O homem é o reservatório natural e as
infecções ocorrem via fecal-oral através
da ingestão de 20 a 200 células viáveis
em alimentos e água contaminados. Na
shigelose, corre uma invasão e destruição
da camada epitelial da mucosa com intensa
reação inflamatória, gerando leucócitos,
muco e sangue nas fezes. Deve-se
suspeitar de espécies de Shigella quando
observamos colônias lactose-negativas,
bioquimicamente inertes em muitas
provas bioquímicas de identificação. Elas
tipicamente não produzem gás a partir
de carboidratos, com exceção de alguns
biogrupos de S. flexneri que são aerogênicos.
Raras cepas de S. sonnei podem
Quadro 3. Subgrupos, sorotipos e subtipos de Shigella
Subgrupo
Grupo A: Shigella dysenteriae
Grupo B: Shigella flexneri
Grupo C: Shigella boydii
Grupo D: Shigella sonnei
fermentar tardiamente a lactose (2%) e
a sacarose (1%) e a maioria das cepas
desta espécie descarboxila a ornitina,
característica não observada em outras
espécies de Shigella.
Há quatro subgrupos principais e 43
sorotipos reconhecidos de Shigella (Quadro
3). A classificação do CDC combina
S. dysenteriae (grupo A), S. flexneri (grupo
B) e S. boydii (grupo C) como “Shigella
sorogrupos A, B e C” por conta de suas similaridades
bioquímicas. A presença de
ornitina-descarboxilase e a atividade de
beta-galactosidase fazem com que as cepas
de S. sonnei sejam bioquimicamente
distintas de outras espécies de Shigella. A
incapacidade de fermentar o manitol distingue
a S. dysenteriae. Todos os isolados
clínicos identificados bioquimicamente
Sorotipos e Subtipos
15 sorotipos (o tipo 1 produz a shiga toxina)
Oito sorotipos e nove subtipos
19 sorotipos
Um sorotipo
como Shigella devem ser confirmados
por testes sorológicos (13).
Salmonella
Salmonelas patogênicas ingeridas
com água ou alimentos contaminados
sobrevivem à passagem pela barreira ácida
do estômago e invadem as células da
mucosa dos intestinos delgado e grosso
e liberam toxinas. A invasão das células
epiteliais intestinais estimula a liberação
de citocinas que induzem uma resposta
inflamatória aguda. A reação inflamatória
na mucosa intestinal induz diarréia e
pode levar à ulceração e destruição da
mucosa intestinal. Da mucosa, a bactéria
pode disseminar-se para órgãos internos
causando doença sistêmica. As salmonelas
possuem antígenos somáticos (O) que são
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lipopolissacarídeos e antígenos flagelares
(H) que são proteínas. S. typhi também possui
um antígeno capsular ou de virulência
(Vi). Bioquimicamente elas geralmente são
lactose e sacarose-negativas.
Desde a época do primeiro isolamento
de Salmonella, reportado em 1884 por Gaffky
(Bacterium typhosum) e em 1886 por
Salmon e Smith (Salmonella choleraesuis),
o desenvolvimento da nomenclatura para
este gênero tem sido variado e complexo.
O gênero Salmonella possui mais de 2.400
sorotipos descritos no esquema atual de
Kauffmann-White. Antes de 01 de julho
de 1983, três espécies de Salmonella foram
usadas para reportar os resultados positivos
dos exames: S. choleraesuis, S. typhi e S.
enteritidis (com a maioria dos sorotipos
pertencendo a este último sorotipo).
Atualmente, todas as antigas denominações
das espécies e subgrupos de Salmonella
e Arizona são consideradas como
pertencentes à mesma espécie, mas podem
ser separadas em sete grupos taxonômicos,
representando seis subgrupos distintos. A
única exceção é S. bongori, anteriormente
conhecida como subgênero V, sendo uma
espécie totalmente distinta através de
estudos de homologia de DNA. Portanto,
há duas espécies e seis subespécies de S.
enterica no atual sistema de classificação
do CDC (Quadro 4).
Na prática do dia-a-dia, os isolados
desconhecidos provenientes de espécimes
clínicos que são sugestivos de pertenceram
ao gênero Salmonella, devem ser
confirmados por sorologia. Subcultivo
dos isolados confirmados devem ser encaminhados
para laboratórios de saúde
pública, onde as designações de sorotipos
(ex: Salmonella sorotipo Typhimurium)
serão realizadas. Répteis, particularmente
cobras, são o reservatório natural de S. enterica
subespécie arizonae, mas o homem,
aves e outros animais também podem ser
infectados por esta bactéria. As infecções
humanas podem ser originadas quando da
manipulação de aves, répteis e produtos à
base de ovos (13).
Microscopia
A análise microscópica direta do material
fecal é muito útil, pois pode se ter
uma noção do que será encontrado na coprocultura.
A presença de numerosos leucócitos
polimorfonucleares (PMN) sugere
um processo inflamatório invasivo (Figura
1) envolvendo o cólon (como a exemplo de
infecções por Shigella ou Campylobacter).
Colites ulcerativas e a colite associada à
antibioticoterapia (relacionada ao C. difficile)
estão quase sempre associadas a um
exsudato fecal contendo leucócitos. No
Quadro 4. Classificação das espécies e subespécies de Salmonella
Quadro 5. Leucócitos PMN em infecções intestinais
Salmonella enterica subespécie enterica (I): inclui a maioria dos sorotipos
S. enterica subespécie salamae (II)
S. enterica subespécie arizonae (IIIa)
S. enterica subespécie diarizonae (IIIb)
S. enterica subespécie houtenate (IV)
S. enterica subespécie indica
Salmonella bongori (antigamente denominada subespécie V)
Presentes Variáveis Ausentes
Shigella,
Campylobacter,
E.coli invasora (EIEC)
Salmonella, Yersinia,
Vibrio parahaemolyticus,
Clostridium difficile
Figura 1. Gram: Diarréia muco-sanguinolenta
por Shigella (numerosas hemácias, leucócitos
PMN e acentuada presença de bacilos Gramnegativos;
microbiota intestinal normal
praticamente inexistente).
Vibrio cholerae, E.coli toxigênica
(ETEC), E.coli enteropatogênica
(EPEC), Staphylococcus aureus
[toxina], Bacillus cereus [toxina]
entanto, deve-se ter em mente que nem
todos os processos diarréicos causados
por bactérias irão produzir leucócitos nos
espécimes fecais. Para a realização do exame,
coloca-se uma pequena quantidade
do material fecal em uma lâmina de vidro
limpa e desengordurada, misturando uma
gota de água destilada estéril (ou salina) e
uma gota de azul de metileno sob lamínula.
Observar ao microscópio com aumento
de 400x (13).
Isolamento
Grande parte dos métodos de identificação
no laboratório ainda é demorada e requer
uma bateria de meios de cultura, apesar
do constante progresso no desenvolvimento
de novos métodos rápidos de diagnóstico.
Assim, o período decorrido entre a entrada
do material no laboratório de Microbiologia
e a identificação e antibiograma dos agentes
isolados pode demorar vários dias para uma
completa análise (13).
A qualidade dos insumos utilizados
por muitos fabricantes é questionável e
muitas vezes ruim, levando a um alto grau
de inconsistência de resultados lote a lote
de um mesmo meio de cultura (24). Portanto,
deve-se dar preferência para meios de
cultura de fabricantes idôneos, seja em pó
ou em placas/tubos prontos para uso. Desconfie
de meios muito baratos, oferecidos
comumente no mercado. Geralmente são
de baixa qualidade e colocarão em cheque
a qualidade dos serviços microbiológicos
ofertados pelo seu laboratório.
A metodologia tradicional para a detecção
de patógenos entéricos invariavelmente
emprega a combinação de meios de cultura,
geralmente um meio seletivo em placa e
um caldo de pré-enriquecimento. A necessidade
de mais de uma placa é defendida
por alguns autores, motivados pelo conhecimento
de que se um meio é altamente
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NewsLab - edição 86 - 2008

Protocolos de Microbiologia Clínica
inibitório para alguns membros da família
Enterobacteriaceae (isto é, os coliformes da
microbiota normal intestinal), poderá haver
uma concomitante perda de sensibilidade
na detecção de patógenos verdadeiros, tais
como a Shigella. Os meios de cultura para o
isolamento de patógenos entéricos utilizados
atualmente ou são muito inibitórios para Shigella
ou não suficientemente inibitórios para
a microbiota intestinal normal. Além disso, a
diferenciação das colônias não é tão boa o
suficiente para evitar o subcultivo de muitos
não patógenos os quais não fermentam a lactose,
tornando-se um trabalho que demanda
tempo e maior custo, especialmente em
laboratórios que analisam muitos espécimes
diariamente (10, 13).
Os meios de cultura em placa mais
utilizados para o isolamento de Salmonella
e Shigella em laboratórios clínicos são:
• Eosina-Azul de Metileno (EMB),
MacConkey (baixa seletividade)
• Xilose-Lisina-Desoxicolato (XLD),
Salmonella-Shigella (SS), Hektoen Enteric,
Citrato-Desoxicolato (média seletividade)
(Figuras 2, 3, 4, 5, 6)
• Verde Brilhante, Bismuto-Sulfito (alta
seletividade)
No entanto, os meios de alta seletividade
só servem para o isolamento
seletivo de Salmonella e foram adaptados
de forma incorreta da microbiologia de
alimentos para a microbiologia clínica
humana. Infelizmente, também, muitos
são os laboratórios clínicos brasileiros que
utilizam de forma completamente equivocada
combinações de meios de cultura
que nada acrescentam para a realização
de uma coprocultura de boa qualidade.
Exemplo disso é a utilização de meios
como ágar manitol hipertônico, ágar CLED,
ágar sangue, dentre outros.
O surgimento de meios cromogênicos
e fluorogênicos tem permitido avanços
significativos na formulação dos meios
de cultura diferenciais, os quais detectam
caracteres fenotípicos bacterianos, manifestos
pela ação de enzimas características
de certos grupos taxonômicos, orientando
a sua identificação presuntiva. Estes meios
incluem em sua composição compostos
cromogênicos e/ou fluorogênicos, habitualmente
incolores, os quais servem como
substrato de enzimas específicas. Quando
a enzima atua sobre o substrato, este sofre
uma mudança estrutural, formando um
novo composto colorido (cromóforo) ou
fluorescente (12). Nos últimos anos surgiram
diversos meios cromogênicos úteis
para o isolamento e identificação presuntiva
de Salmonella spp. (CHROMagar, SMID,
Rambach, ABC, etc.); no entanto, até o
momento, nenhum meio cromogênico
foi desenvolvido para o isolamento e a
identificação presuntiva de Shigella. O ágar
Rambach (Figura 7) foi o primeiro meio
cromogênico disponível comercialmente,
seguido pelo SMID.
Muitos estudos demonstraram altos
índices de sensibilidade e especificidade,
mas as investigações foram baseadas essencialmente
no uso de culturas puras (estoque)
de Salmonella. Estudos posteriores
indicaram que a presença da microbiota
intestinal normal, não inibida previamente
por caldos de pré-enriquecimento, atrapalhava
sobremaneira a performance destes
meios (3). O ágar Rambach permite a
identificação de salmonelas não-tifóides,
gerando colônias de cor vermelha no meio.
Os coliformes aparecem como colônias
azuis, verdes, violetas ou incolores. Uma
vez que as características bioquímicas usadas
neste meio são altamente específicas
Figura 2. Ágar Hektoen: Aspecto colonial de
Shigella sonnei.
Figura 3. Ágar SS: Aspecto colonial de
Shigella sonnei.
Figura 4. Ágar XLD: Aspecto colonial de
Shigella sonnei.
Figura 5. Ágar Hektoen: Aspecto colonial de
Salmonella spp. (ausência de fermentação dos
carboidratos do meio e produção de H 2
S).
Figura 6. Ágar SS: Aspecto colonial de
Salmonella spp. (lactose-negativa e produção
de H 2
S).
Figura 7. Ágar Rambach: Aspecto colonial
de Salmonella não-tifóide (fermentação do
propilenoglicol).
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para salmonelas não-tifóides (fermentação
do propilenoglicol e ausência de betagalactosidase),
somente poucos resultados
falsos-positivos são encontrados.
O maior problema deste meio é a incapacidade
de isolamento de Salmonella
enterica sorotipo Typhi, pois estas não
fermentam o propilenoglicol (17). No meio
SMID, as colônias de Salmonella são também
distintas das demais pela formação
de coloração vermelha intensa (devido à
formação de ácido a partir do glicuronato e
ausência de beta-galactosidase), enquanto
outras bactérias acompanhantes aparecem
como colônias azuis, violetas ou incolores.
Este meio possibilita o isolamento e a
identificação presuntiva de todos os sorogrupos
de Salmonella. Já o ágar ABC (ágar
alfa-beta-cromogênico) explora o fato das
salmonelas poderem ser diferenciadas dos
membros da família Enterobacteriaceae
pela presença da enzima alfa-galactosidase,
na ausência da atividade da enzima
beta-galactosidase (10).
Um total de 1.022 cepas de Salmonella
spp. e 300 outros bacilos Gram-negativos
foram inoculados neste meio. Destas,
99,7% das cepas de Salmonella produziram
colônias com uma coloração verde
característica, ao passo que somente uma
cepa de Escherichia coli atípica (0,33%)
também produziu colônias verdes (100%
de sensibilidade e 90,5% de especificidade)
(10). Atualmente, outros meios
cromogênicos para Salmonella já estão
disponíveis comercialmente e quase todos
eles (com exceção dos meios Rambach e
ABC) detectam a atividade de esterase (Figura
8), positiva para todas as salmonelas.
Figura 8. Ágar cromogênico: Aspecto colonial
de Salmonella spp. (utilização do substrato
cromogênico através da enzima esterase)
Porém, estes meios possuem custo elevado
e são específicos somente para Salmonella.
Outros meios em ágar, invariavelmente,
devem ser usados em conjunto para o isolamento
de outros enteropatógenos, onerando
muito o custo final da coprocultura.
Estes meios obtiveram excelente aceitação
em laboratórios de controle de qualidade,
os quais pesquisam somente Salmonella
(em amostras de águas e alimentos).
Quando qualquer meio de cultura
desidrata, o potencial de oxi-redução (eH)
é alterado, as concentrações dos agentes
inibidores são aumentadas e o efeito
mais visível disso é o pouco ou nenhum
crescimento de colônias. Nos laboratórios
clínicos, onde é freqüente a prática de se
confeccionar meios de cultura para uma
ou mais semanas de trabalho, este efeito
pode ser minimizado embalando as placas
em sacolas plásticas ou, preferencialmente,
envoltas por plástico-filme de PVC (o
mesmo utilizado em cozinha). Mesmo
um tempo razoavelmente curto de duas
semanas sob refrigeração é suficiente para
promover efeitos deletérios nos meios em
placa sem proteção, proporcionando resultados
aberrantes nas análises (13).
Isenberg et al. (6) estudaram vários
meios de cultura seletivos (ágares SS, XLD,
Hektoen) na tentativa de avaliar o grau de
supressão da microbiota intestinal normal
em espécimes fecais, permitindo o crescimento
dos reais patógenos significativos.
Salmonella e Shigella, isolados de espécimes
clínicos humanos, foram misturados
com Escherichia, Klebsiella, Enterobacter,
Serratia e Proteus. Foram feitas diferentes
diluições destas misturas e então semeadas
nas placas de ágar. Os resultados
demonstraram um maior grau de inibição
de Shigella utilizando o ágar SS, ao passo
que os ágares XLD e Hektoen permitiram
o isolamento normal desta bactéria (bem
como de Salmonella), suprimindo consideravelmente
a microbiota intestinal normal
acompanhante.
Vários estudos (5, 25, 26) comprovaram
a inibição de Shigella por microrganismos
pertencentes à microbiota intestinal
normal. Os primeiros estudos mostraram
que Klebsiella/Enterobacter inibia o crescimento
de Shigella em culturas mistas,
indicando que uma possível competição
por fontes de carboidratos fermentáveis
seria a causa principal. Outros estudos
comprovaram parcialmente esta teoria,
uma vez que também foram relatadas inibições
do crescimento de Shigella quando
em presença de Klebsiella/Enterobacter,
mesmo em meios aerados e com excesso
de glicose. No entanto, estes estudos também
provaram que a produção de ácidos
acético e fórmico por estas bactérias (e
também por E. coli) fazia com que as
Shigella entrasse em fase logarítmica de
morte, comprovando que a produção de
ácidos voláteis com a concomitante redução
acentuada do meio eram os principais
mecanismos de inibição do crescimento de
Shigella em culturas mistas.
Os caldos de enriquecimento seletivo
são utilizados para diminuir a quantidade
de bactérias da microbiota intestinal normal
no espécime fecal, inibindo de alguma
forma seu metabolismo e propiciando o
desenvolvimento franco dos verdadeiros
enteropatógenos. Estes caldos devem ser
sempre utilizados como uma etapa prévia,
uma vez que a semeadura direta das fezes
em meios sólidos geralmente leva a um
supercrescimento da microbiota normal,
em detrimento às poucas colônias que
podem ser formadas pelos verdadeiros
patógenos (13).
Deve ser observado que cada caldo
possui suas próprias características e seu
uso deve ser criterioso, seguindo todas as
informações dadas pelos fabricantes para
uma melhor performance. No entanto, em
muitos laboratórios clínicos estes caldos
são usados de forma equivocada, muitas
vezes sem o real conhecimento científico
de sua utilidade. Muitos são os caldos para
o pré-enriquecimento seletivo utilizados em
microbiologia: tetrationato segundo Muller-
Kauffmann, Rappaport-Vassiliadis, selenito
segundo Leifson, selenito-cistina e GN
segundo Hajna. No entanto, com exceção
dos dois últimos, estes meios foram adaptados,
incorretamente, da microbiologia
de alimentos para a microbiologia clínica
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Figura 9. Caldo GN Hajna: 1) meio inoculado
com espécime fecal; 2) meio não inoculado
humana, pois são utilizados somente para
o isolamento de Salmonella. Eles possuem
diversas substâncias tóxicas para as outras
bactérias (especialmente E. coli e Shigella)
e, portanto, não devem ser utilizados em
espécimes fecais (9, 11, 14, 15).
Mesmo muito utilizado em microbiologia
clínica, o caldo selenito-cistina
também é bastante inibidor para o desenvolvimento
de Shigella, especialmente
pelo contato prolongado das células com
o selenito de sódio (este caldo deve ser
incubado por 24 horas antes do repique
em meios sólidos). Já o caldo GN (Gram-
Negative), idealizado por Hajna em 1955
(4), continua sendo o melhor meio para o
pré-enriquecimento seletivo tanto para o
isolamento de Salmonella quanto de Shigella,
a partir de espécimes fecais humanos
(Figura-9). O meio deve ser inoculado
com pequena porção de fezes, incubado
por até 8 horas em estufa bacteriológica e
repicado para meios em placa (o tempo
ideal para a incubação é de 6 a 8 horas).
O citrato e o desoxicolato de sódio presentes
em sua formulação impedem o rápido
crescimento da microbiota intestinal
normal, possibilitando a multiplicação
dos verdadeiros enteropatógenos. No
entanto, após 8 horas de incubação, esta
capacidade inibitória começa a se perder
e as bactérias intestinais acompanhantes
começam a se multiplicar normalmente.
Portanto, nunca devemos utilizar o caldo
GN após 8 horas de incubação pois,
dessa forma, é praticamente como se
estivéssemos semeando o espécime fecal
diretamente nas placas (10, 13).
Taylor e Schelhart (21) compararam caldos
de pré-enriquecimento e três meios em
placa durante a análise de 1.405 espécimes
fecais com o intuito de escolherem a melhor
combinação caldo/placa para o isolamento
de Shigella. Os caldos GN e selenito foram
semeados em ágar EMB, SS e XLD. Com
o uso dos caldos de pré-enriquecimento,
obteve-se o dobro de isolamentos de Salmonella
e Shigella em comparação com a
semeadura direta em placas das amostras
fecais. Todos os três caldos obtiveram
resultados ótimos no pré-enriquecimento
seletivo de Salmonella; no entanto, o caldo
GN possibilitou o isolamento de quase três
vezes mais Shigella do que o caldo selenito
(Tabela 1). A comparação entre os meios em
placa mostrou que o ágar XLD foi muito
mais eficiente que os ágares SS e EMB para
o isolamento de ambos os gêneros bacterianos
(Tabela 2), indicando que a combinação
GN/XLD foi a mais eficiente.
Quatro meios de cultura em placa
(MacConkey, citrato-desoxicolato, XLD e
verde brilhante) foram inoculados diretamente
com amostras fecais e também após
o pré-enriquecimento seletivo usando os
caldos selenito, GN e tetrationato, em
um estudo conduzido por Taylor e Schelhart
(22) com 1.117 espécimes fecais na
tentativa de isolamento de Salmonella e
Shigella. O ágar XLD foi claramente superior
na detecção destas bactérias (Tabela
3) e o uso do caldo GN mostrou-se de
Tabela 1. Performance dos caldos de pré-enriquecimento no isolamento de Salmonella e Shigella
Bactéria Semeadura direta Caldo GN* Caldo Selenito*
Salmonella 160 332 260
Shigella 57 118 38
Total 217 450 298
* pré-enriquecimento com posterior semeadura em placa
Tabela 2. Performance dos meios em placa no isolamento de Salmonella e Shigella
Bactéria EMB XLD SS
Salmonella 235 (47%) 497 (99%) 343 (68%)
Shigella 103 (73%) 137 (96%) 75 (53%)
Total 338 (52%) 634 (98%) 418 (65%)
Tabela 3. Total de amostras positivas para Salmonella e Shigella usando caldos de pré-enriquecimento seletivo
Bactéria Semeadura direta Caldo GN* Caldo Selenito* Caldo Tetrationato*
Salmonella 157 250 257 164
Shigella 53 77 66 27
Total 210 327 323 191
* pré-enriquecimento com posterior semeadura em placa
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Protocolos de Microbiologia Clínica
Tabela 4. Total de amostras positivas para Salmonella e Shigella utilizando os meios em placa
Bactéria MC XLD CD VB
Salmonella 178 (55%) 305 (94%) 115 (35%) 230 (71%)
Shigella 66 (75%) 78 (89%) 24 (27%) 55 (63%)
Total 244 (59%) 383 (93%) 139 (34%) 285 (69%)
MC: MacConkey; XLD: Xilose-lisina-desoxicolato; CD: Citrato-desoxicolato; VB: Verde brilhante.
Tabela 5. Distribuição dos resultados falsos-positivos (H 2
S+ não Salmonella) nos meios em placa
Bactéria XLD SS Hektoen
Citrobacter freundii 27 (6,7%) 82 (9,5%) 361 (36,5%)
Proteus vulgaris/mirabilis 122 (30,1%) 359 (41,6%) 244 (24,7%)
Total 149 (36,8%) 441 (51,1%) 605 (61,2%)
fundamental importância para a detecção
de ambos os patógenos, especialmente
Shigella (Tabela 4).
Vassiliadis et al. (24) reportaram que
105 Shigella foram isoladas em ágar citratodesoxicolato
quando semeadas diretamente
mas somente 16 foram recuperadas após
o uso do pré-enriquecimento com caldo
selenito, das quais 13 de 25 foram S. sonnei
e somente três de 78 foram S. flexneri.
Dois caldos de enriquecimento e quatro
meios em placa foram avaliados por Taylor e
Schelhart (23), comparando a eficiência de
detecção de Salmonella e Shigella a partir
de 1.597 espécimes fecais. Todas as 17
Shigella foram isoladas no ágar XLD após
o enriquecimento prévio em caldo GN.
A semeadura direta das fezes nos quatro
meios em placa permitiu o isolamento de
somente 92 das 170 Salmonella (54%); da
mesma forma, somente 10 das 17 Shigella
(59%) foram recuperadas. Os caldos de
pré-enriquecimento se mostraram efetivos
para a recuperação de todos os patógenos
pesquisados, sendo que o caldo GN proporcionou
o isolamento de 87% das Salmonella
e 100% das Shigella e o caldo selenito 97 e
76%, respectivamente.
Foi observado que o ágar XLD produziu
mais resultados positivos para ambos
os patógenos em comparação com os
outros três meios. O ágar XLD recuperou
3%, 12% e 99% mais Salmonella que os
ágares Hektoen, SS e EMB, respectivamente.
Para Shigella, o ágar XLD produziu
13%, 33% e 44% mais isolamentos que
os ágares Hektoen, SS e EMB, respectivamente.
Neste mesmo estudo, os autores
observaram que o número de resultados
falsos-positivos na observação preliminar
das placas (colônias H 2
S+ que não foram
identificadas como Salmonella) foi maior
nos meios SS e Hektoen (Tabela 5).
A vantagem do ágar XLD sobre os outros
meios seletivos avaliados neste estudo
(SS e Hektoen) provavelmente seja um
sistema de diferenciação de colônias com
maior poder de discriminação (a xilose,
presente no XLD, é fermentada por muito
mais membros da família Enterobacteriaceae
do que a salicina, presente no Hektoen).
Portanto, todas as colônias salicina(-) de não
fermentadores ou fermentadores tardios de
lactose/sacarose são uma fonte de possíveis
resultados falsos-positivos no ágar Hektoen.
No entanto, a maioria destes microrganismos
fermenta rapidamente a xilose,
possibilitando uma maior discriminação no
ágar XLD. Já o ágar SS, não possuindo nem
xilose nem salicina como características diferenciais
(somente lactose), é dependente
quase que exclusivamente do maior efeito
inibitório de sua formulação.
King e Metzger (7, 8) desenvolveram o
meio de cultura Hektoen Enteric em 1968
como um modo de melhorar a performance
de isolamento de patógenos intestinais,
obtendo bom crescimento de Shigella e
Salmonella através da utilização de proteosepeptona
e a adição da salicina como um
terceiro carboidrato fermentável, além de
melhorar o sistema indicador da produção
de H 2
S. Durante o estudo, comparando a
performance do recém-criado meio Hektoen
Figura 10. Ágar XLD: Aspectos coloniais de
Citrobacter freundii (Cf), Proteus mirabilis
(Pm) e Escherichia coli (Ec)
Enteric com os ágares SS e EMB, somente Salmonella
e Shigella foram pesquisados a partir
da semeadura de 2.855 espécimes fecais.
Os autores relataram que o meio Hektoen
possibilitou mais isolamentos de Shigella que
os demais. Do total de 98 Shigella isoladas
de todos os três meios, 97 foram isoladas em
Hektoen e somente 40 no ágar SS.
Citrobacter freundii, bacilo Gramnegativo
pertencente à família Enterobacteriaceae,
membro da microbiota intestinal
normal da grande maioria das pessoas
sadias, lactose(-) e produtor de H 2
S, não
tem o seu crescimento inibido nos ágares
EMB, MacConkey, Hektoen e XLD, mas o
ágar SS mostra-se bastante inibidor para
esta espécie. Conseqüentemente, C. freundii
está entre as causas menos freqüentes
de resultados falsos-positivos no ágar SS.
No ágar XLD esta espécie geralmente não
causa resultados falsos-positivos pois,
devido ao sistema diferencial daquele
meio, as colônias de C. freundii tornam-se
amarelas (Figura-10), semelhantes àquelas
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Protocolos de Microbiologia Clínica
dos coliformes da microbiota intestinal
normal, mesmo as cepas fermentadoras
tardias de lactose são xilose(+) e lisina(-).
O ágar Hektoen, entretanto, não possui
nenhum sistema inibidor nem diferencial
para distinguir C. freundii de Salmonella,
uma vez que ambos podem ser lactose/
sacarose/salicina(-) e H 2
S(+). Portanto, C.
freundii também é a causa mais freqüente
de resultados falsos-positivos quando se
usa este meio de cultura em amostras fecais
(13) (Figura 11).
Os efeitos de temperaturas de incubação
diferentes (20, 35 e 40 o C), longos
períodos de transporte, caldos de préenriquecimento
e meios em placa foram
determinados por análises exaustivas,
pesquisando Salmonella e Shigella, em 132
amostras fecais (20). Estes espécimes foram
semeados diretamente em ágares SS, XLD e
EMB, meios de transporte Cary-Blair (CB) e
salina e caldos de pré-enriquecimento GN
e selenito. Os melhores resultados dos caldos
na recuperação de Salmonella foram
GN > selenito > salina > CB > semeadura
direta. Para Shigella, GN > salina > semeadura
direta > CB > selenito, provando
que o caldo selenito não é adequado para
o isolamento de Shigella. A eficiência dos
meios em placa, tanto para Salmonella
quanto para Shigella, foi: XLD > EMB > SS.
Além disso, 10 das 39 Shigella não foram
isoladas a partir da combinação selenito/
SS. As temperaturas de incubação não
afetaram as taxas de recuperação de Salmonella;
no entanto, somente metade das
Shigella foi isolada a 40 o C e os isolamentos
a 20 e 35 o C foram equivalentes. A análise
das placas com crescimento de Salmonella
Figura 11. Ágar Hektoen: Aspecto colonial de
Citrobacter freundii (ausência de fermentação
dos carboidratos do meio e produção de H 2
S).
e Shigella revelou que a semeadura direta
das amostras fecais deve ser desencorajada,
uma vez que o supercrescimento da
microbiota intestinal normal atrapalha o
desenvolvimento daquelas colônias dos
verdadeiros patógenos, principalmente
através da competição por nutrientes.
Tem sido provado por diferentes
autores (2, 10, 13, 14, 16,) que a combinação
de pré-enriquecimento com caldo
selenito e semeadura posterior em ágar SS
é excessivamente inibidora para Shigella.
Taylor e Schelhart (23) mostraram que 19
das 39 cepas de Shigella não cresceram em
nenhuma das 78 replicatas por espécime
em placas de ágar SS e 20 não foram isoladas
dos 48 subcultivos de caldo selenito
com Shigella. Cinco de seis S. flexneri não
cresceram em ágar SS, quatro de seis não
cresceram em selenito, nenhuma das cinco
cepas de S. dysenteriae foi detectada na
combinação selenito/SS e somente uma
cresceu em ágar SS. Desta forma, somente
10 das 39 cepas de Shigella puderam
ser isoladas da combinação selenito/SS,
mesmo com 16 replicatas de cada amostra
fecal. Os autores concluíram que é altamente
insatisfatória a combinação destes
meios, embora eles sejam utilizados por
muitos laboratórios clínicos para a realização
de coproculturas.
Em um estudo conduzido por Pollock
e Dahlgren (16), em um período de 12
meses, vários meios em placa (MacConkey,
XLD, SS, Hektoen) e caldos de pré-enriquecimento
(selenito, tetrationato) para o
isolamento de Salmonella e Shigella foram
comparados, utilizando 455 amostras fecais.
Destas foram isolados 53 patógenos,
dos quais 56% foram S. sonnei e 13%
foram S. flexneri. Destes isolados, 90%
foram recuperados em ágar XLD, 87% em
ágar Hektoen e 80% em ágar MacConkey,
mas somente 28% em ágar SS. Menos da
metade das Shigella foi isolada a partir do
pré-enriquecimento em caldo selenito e
somente duas foram isoladas à partir do
caldo tetrationato. O ágar XLD mostrouse
o melhor meio para o isolamento tanto
de Salmonella quanto de Shigella, seguido
pelo ágar Hektoen. Ambos possuem formulações
que evitam a combinação de
ingredientes sabidamente responsáveis
pela baixa eficiência na recuperação de
várias cepas de Shigella, como ocorre no
ágar SS (sais biliares + citrato).
Dunn e Martin (2) avaliaram cinco
meios de transporte, oito meios em placa
e três caldos de enriquecimento seletivo
para o isolamento de Salmonella e Shigella
em oito laboratórios de diferentes regiões
dos Estados Unidos, os quais submeteram
para análise 490 espécimes fecais de suas
rotinas nos meios de transporte fornecidos
pelos autores. Os resultados sugerem a
utilização de mais de um meio de cultura
para o isolamento primário aliado ao uso
de um caldo de pré-enriquecimento seletivo
e a obrigatoriedade de utilização de
swabs com meios de transporte nos casos
onde as amostras “in natura” não puderem
ser inoculadas imediatamente. Os autores
concluíram, também, que o uso de ágar
XLD em conjunto com o caldo GN como
pré-enriquecimento seletivo foi a melhor
combinação para o isolamento de Salmonella
e Shigella.
Embora um número bastante grande
de meios de transporte tenha sido descrito,
eles possuem as mesmas funções básicas:
manter o status quo da população bacteriana
no espécime clínico, bem como prevenir
o supercrescimento de uma população
bacteriana em particular (como as enterobactérias
da microbiota normal intestinal).
Swabs retais podem ser utilizados, desde
que adequada e racionalmente. Deve-se dar
preferência para a inoculação das amostras
“in natura” mas, nos casos onde a inoculação
destas amostras no laboratório não
seja possível (como nos casos de envio de
espécimes para laboratórios de referência
localizados em outras cidades), os swabs
podem e ser utilizados. No entanto, jamais
utilizar swabs “secos”, ou seja, sem meios
de transporte. Atualmente os swabs comerciais
possuem preços bastante acessíveis a
qualquer laboratório e devem ter preferência.
Colocando os custos diretos e indiretos
na ponta do lápis, os swabs confeccionados
no próprio laboratório elevam substancialmente
o valor final do teste (13).
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Protocolos de Microbiologia Clínica
Alguns estudos relataram a importância
da utilização de meios conservantes para
espécimes fecais com a finalidade de realização
de coproculturas. Stuart (19) foi o
primeiro a publicar um meio quimicamente
definido para a preservação de células bacterianas
até o momento da inoculação em
meios apropriados no laboratório, inclusive
para amostras destinadas ao cultivo de Salmonella
e Shigella. Seu estudo concluiu que
as evidências sugeriam que os swabs retais
preservados no meio de transporte proposto
não possuíam performance inferior aos espécimes
fecais “in natura” para o isolamento
de Salmonella e Shigella após um ou dois
dias de transporte. Posteriormente, Cary e
Blair (1) reportaram o desenvolvimento de
um novo meio de transporte para amostras
fecais, indicando que Salmonella e Shigella
poderiam ser isoladas por até 49 dias, Vibrio
cholerae por até 22 dias e Yersinia pestis por,
pelo menos, 75 dias quando armazenadas
neste novo meio.
No entanto, estudos mais recentes,
comparando a eficiência na manutenção
de células viáveis de Shigella em meios
de transporte comumente utilizados em
laboratórios clínicos (Cary-Blair e salina
glicerinada tamponada), questionaram a
real utilidade dos swabs com meios de
transporte no isolamento de patógenos
entéricos mais delicados e que morrem
rapidamente quando há demora no seu
isolamento. Em um estudo (1), 376 espécimes
fecais de pacientes envolvidos
em surtos de diarréia por Shigella foram
analisados utilizando swabs com meio de
transporte Cary-Blair e salina glicerinada
tamponada. A duração do transporte das
amostras até o laboratório variou de um a
seis dias. Os maiores índices de isolamento
foram obtidos em espécimes refrigerados
ou congelados, em ambos meios de transporte,
em comparação com os meios em
temperatura ambiente. Esta diferença foi
mais evidente na análise dos espécimes
deixados à temperatura ambiente por mais
de três dias. Os autores concluíram que a
salina glicerinada tamponada é melhor
para o transporte e posterior isolamento
de Shigella do que o swab com Cary-Blair,
mas o grau de superioridade é dependente
da temperatura de transporte.
Baseado nas informações anteriores
e ainda na nossa experiência prática,
sugerimos a utilização do caldo GN (com
incubação a 35-37 o C por 6 a 8 horas)
e repique deste para placas de ágares
MacConkey e XLD, para uma ótima recuperação
de Salmonella, Shigella e outros
enteropatógenos bacterianos. No entanto,
a análise destes últimos será tema da Parte
2 deste protocolo de coprocultura. •
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