Dragoş Lucian Gorgan - Editura Bioflux

3.2.1.2. Compararea mai multor probe…………………………………60
3.3. Reacţia de amplificare genică prin polimerizare în lanţ (PCR)……………….61
3.3.1. Principii generale…………………………………………………………….61
3.3.2. Ciclurile de replicare………………………………………………………...63
3.3.2.1. Denaturarea……………………………………………………..63
3.3.2.2. Alinierea primerilor……………………………………………...64
3.3.2.3. Extensia………………………………………………………….64
3.3.2.4. Condiţiile de reacţie…………………………………………….65
3.3.3. Componentele PCR…………………………………………………………65
3.3.4. Amplificarea genică la reprezentanţi ai familiei Cyprinidae…………….65
3.3.4.1. Amplificarea genei care determină sinteza citocromului B…66
3.3.4.2. Amplificarea regiunii de control mitocondrial…………………68
3.3.4.3. Amplificarea genei care codifică subunitatea 4L a
dehidrogenazei (ND4L)………………………………………………69
3.4. Testarea produşilor PCR prin electroforeză……………………………………70
3.5. Purificarea produşilor PCR………………………………………………………71
3.6. Cuantificarea produşilor PCR……………………………………………………72
3.6.1. Prepararea gelului de cuantificare…………………………………………72
3.6.2. Pregătirea probelor pentru cuantificare…………………………………...72
3.6.3. Cuantificarea probelor………………………………………………………72
3.7. Reacţia de secvenţiere……………………………………………………………73
3.7.1. Reacţia de secvenţiere a citocromului B………………………………….74
3.7.2. Reacţia de secvenţiere a regiunii de control mitocondrial………………75
3.7.3. Reacţia de secvenţiere a ND4L……………………………………………75
3.8. Precipitarea in etanol a probelor pentru secvenţiere………………………….75
3.9. Analiza secvenţelor……………………………………………………………….76
4. Studiul relaţiilor filogenetice……………………………………………………………77
4.1. Evaluarea uniformităţii populaţiilor………………………………………………77
4.2. Testarea obţinerii produşilor PCR prin electroforeză orizontală în gel de
agaroză…………………………………………………………………………….82
4.3. Cuantificarea produşilor PCR……………………………………………………87
4.4. Secvenţierea genelor utilizate în studiile de filogenie…………………………95
4.5. Compararea secvenţelor nucleotidice ale citocromului B provenite de la
indivizi aparţinând genului Cyprinus…………………………………………….96
4.5.1. Caracterizarea haplotipului CY01I…………………………………………99
4.5.1.1. Frecvenţele tipurilor de asocieri nucleotidice………………..99
4.5.1.2. Translaţia şi caracterizarea catenei polipeptidice…………...99
4.5.2. Caracterizarea haplotipului CY04I……………………………………….102
4.5.2.1. Frecvenţele tipurilor de asocieri nucleotidice………………102
4.5.2.2. Translaţia şi caracterizarea catenei polipeptidice………….102
4.5.3. Caracterizarea haplotipului CY0104N…………………………………...103
4.5.3.1. Frecvenţele tipurilor de asocieri nucleotidice………………103
4.5.3.2. Translaţia şi caracterizarea catenei polipeptidice………….104
4.5.4. Caracterizarea haplotipului CY03M……………………………………...105
4.5.4.1. Frecvenţele tipurilor de asocieri nucleotidice………………105
4.5.4.2. Translaţia şi caracterizarea catenei polipeptidice………….106
4.5.5. Caracterizarea haplotipului CY06M……………………………………...107
4.5.5.1. Frecvenţele tipurilor de asocieri nucleotidice………………107
4.5.5.2. Translaţia şi caracterizarea catenei polipeptidice………….107
2