1. Úvod

1. Úvod 

Úvod 

Od poloviny 19. století je známo 1 , že se nabité částice v roztoku pohybují pod vlivem 

elektrického pole. Protože rychlost takovýchto částic závisí na různých parametrech, 

mnoho vědců během posledních několika dekád používalo tohoto jevu pro 

charakterizaci a separaci různých nabitých částic pro analytické i preparativní účely. 

Takovéto experimenty však vyžadovaly přístroj, jehož separační část musela být 

vyrobena z materiálů s vysokou izolační schopností. Bohužel na počátku 20. století 

takovéto materiály nebyly k dispozici a navíc v té době nebyl vyvinut dostatečně 

citlivý detekční systém. Teprve s rozvojem chromatografických separačních technik, 

které vyžadoval chemický průmysl po druhé světové válce, se objevily izolační 

materiály a detekční systémy vhodné pro konstrukci elektroforetických přístrojů. 

Navíc se v této době začal rozvíjet elektronický průmysl. 

Izotachoforéza náleží mezi elektroforetické techniky, které jsou založeny na migraci 

nabitých částic v elektrickém poli. Specifikem izotachoforézy je přítomnost ostrých 

zónových rozhraní oddělujících separované zóny jednotlivých složek vzorku, které 

migrují za sebou stejnou rychlostí (odtud plyne název z řečtiny; ισο = stejný, ταχοσ = 

rychlost, φορεεσθαι = být tažen, vlečen). Je to metoda relativně nová, přestože její 

teoretické základy položil v roce 1897 německý fyzik Kohlrausch 2 . V roce 1923 

popsal Kendall 3 jako první separaci látek (prvky vzácných zemin) na 

izotachoforetickém principu. Po zhruba 30leté pauze Longsworth 4 ukázal na možnost 

využití izotachoforézy jako separační analytické metody. Na Tiseliově kapilárním 

přístroji (pohyblivé rozhraní) separoval směs Ba ++ , Ca ++ a Mg ++ . Vzhledem ke krátké 

separační kapiláře Tiseliova přístroje použil Longsworth protiproudu vedoucího 

elektrolytu, aby dosáhl úplné separace kationtů. K rychlému rozvoji izotachoforézy 

dochází v šedesátých letech. V roce 1963 popsali Konstantinov a Ošurkova 5 

separaci kationtů ve skleněné kapiláře s refraktometrickou detekcí. Nezávisle na tom 

v témž roce zahájil Everaerts společně s Martinem systematickou (teoretickou 

i°experimentální) práci na rozvoji kapilární izotachoforézy. Schumacher 6 v roce 1964 

separoval izotachoforézou na papíře 10 karboxylových kyselin a pro kvantitativní 

CITP v analýze potravin 1


vyhodnocení použil závislost délky zóny na analyzovaném množství. V roce 1967 

uveřejnil Martin a Everaerts práci popisující izotachoforetický analyzátor, v němž 

separace probíhá ve skleněné kapiláře a zóny jsou on-line detegovány 

termočlánkem. Toto zařízení se stalo základem pro první komerční izotachoforegraf 

vyráběný švédskou firmou LKB Produkter AB. V roce 1969 zavedli Everaerts a 

Verheggen z Technické university v Eidhovenu (Holandsko) kapilární izotachoforézu 

na pracoviště prof. Vacíka působícího na Karlově universitě v Praze. 

V roce 1970 existovalo mnoho názvů pro stejnou elektroforetickou techniku na 

principu izotachoforézy – ion migration, moving boundary method, displacement 

electrophoresis, steady-state stacking, cons electrophoresis, omegaphoresis, steadystate 

electrophoresis, transphoresis, multiphasic electrophoresis, cascade stacking, 

ionophoresis a další, což se stalo značně nepřehledným. Proto Haglund 7 zavedl 

název izotachoforéza a , který je používán dodnes. 

Je potěšitelné, že se řada pracovišť z Československa patřící ke světové špičce již 

od počátku podílela zásadním způsobem na rozvoji kapilární izotachoforézy. Patří 

sem zejména tato pracoviště: 

� Katedra fyzikální a makromolekulární chemie Přírodovědecké fakulty UK v Praze 

� Ústav analytické chemie ČAV v Brně 

� Katedra analytické chemie Univerzity Komenského v Bratislavě 

� Ústav organické chemie a biochemie ČAV v Praze 

� Katedra analytické chemie Přírodovědecké fakulty Palackého university 

v Olomouci 

� Katedra analytické chemie Farmaceutické fakulty UK v Hradci Králové 

K rozvoji izotachoforézy v Československu přispěla výrazným způsobem výroba 

potřebné instrumentace v Ústavu rádioekológie a využitia jadrovej techniky ve 

Spišské Nové Vsi (dvoukapilárový analyzátor vyvinutý ve spolupráci s Katedrou 

analytické chemie Univerzity Komenského v Bratislavě) a v JZD Odry Krmelín 

(jednokapilárový analyzátor vyvinutý na Katedře analytické chemie Palackého 

universitě). 

a Původně zavedl výraz izotachoelektroforéza, ale ujal se kratší název izotachoforéza 

2 CITP v analýze potravin


K významným zahraničním pracovištím, která přispěla k rozvoji izotachoforézy, patří 

zejména skupina Dr. Everaertse na Technické universitě v Eidhovenu, dále pak 

pracoviště prof. T. Hirokawi z university v Hirošimě a pracoviště prof. E. Kenndlera na 

Ústavu analytické chemie University ve Vídni. 

TABULKA 1 

Přehled sympózií ITP a publikovaných sborníků 

1. symposium "ITP´79", 4.-5. 5. 1979, 

Belgie 

2. symposium ITP´80, 9.-11. 9. 1980, 

Holandsko 

3. symposium ITP´82, 1. – 6. 6. 1982, 

Německo 

4. symposium ITP´84, 2. – 6. 9. 1984, 

Československo 

5. symposium ITP´86, 3. –5. 9. 1986, 

Holandsko 

6. symposium ITP´88, 21. –23. 9. 

1988, Rakousko 

7. symposium ITP´90, 2. –4. 10. 1990, 

Československo 

8. symposium ITP´92, 6. – 9. 10. 

1992, Itálie 

9. symposium ITP´94, 5.-7.10. 1994, 

Maďarsko 

10. symposium ITP´96, 17. – 20.9. 

1996, ČR 

11. symposium ITP´98, 4. –7. 10. 

1998, Itálie 

Biochemical and biological applications of isotachophoresis, 

Proceedings of the First Int. Symp., Eds.: A. Adam, C. Schots, 

Anal. Chem. Symp. Series, Vol. 5, Elsevier, Amsterdam, 1980. 

Analytical isotachophoresis, Proceedings of the 2nd Int. Symp. on 

Isotachophoresis, Ed.: F.M. Everaerts, Anal. Chem. Symp. Series, 

Vol. 6, Elsevier, Amsterdam, 1981. 

Analytical and preparative isotachophoresis, Proceedings of 3rd 

Int. Symp. on Isotachophoresis, Ed. C.J. Holloway, Walter de 

Gruyter, Berlin, 1984. 

J. Chromatogr., 320 (1985) 








Kapilární izotachoforéze je věnováno několik pravidelných sympózií. Nejstarší z nich, 

série ITP sympózií, se poprvé konala v Belgii v květnu roku 1979, druhé 

následujícího roku v září v Holandsku a od roku 1982 jako bienále. Několik prvních 



ročníků bylo věnováno výhradně izotachoforéze. Rostoucí význam ostatních 

kapilárně elektroforetických metod však způsobil, že v současnosti jsou konference 

ITP otevřeny všem metodám kapilární elektroforézy. Sborníky prvních tří sympózií 

vyšly jako knihy, ostatní byly publikovány ve specializovaných číslech Journal of 

Chromatography (viz TABULKA 1). Z národních akcí věnovaných izotachoforéze lze 

jmenovat jednodenní konference Pokroky v HPCE pořádané sekcí pro elektroforézu 

a chromatografii ČCHS (Dr. Z. Prusík a Dr. V. Kašička). O kapilární izotachoforéze 

byly dosud vydány následující monografie: 

1. Everaerts F.M., Beckers J.L., Verheggen T.P.E.M.: Isotachophoresis: Theory, 

Instrumentation and Applications, Elsevier, Amsterdam 1976 

2. Boček P., Deml M., Gebauer P., Dolník V.: Analytická kapilární isotachoforéza, 

Pokroky chemie, Academia Praha (1987) 

3. Boček P., Deml M., Gebauer P., Dolník V.: Capillary isotachphoresis, VCH 

Publishers, Weinheim (1987) 

Práce z oboru kapilární izotachoforézy jsou nejčastěji publikovány v časopisech 

Analytical Chemistry, Journal of Chromatography, Electrophoresis, Journal of 

Microcolumn Separation a od roku 1994 začal vycházet i specializovaný časopis 

Journal of Capillary Electrophoresis. 

Kapilární izotachoforéze je rovněž věnována elektronická konference 8 CZE-ITP, 

která byla zřízena laskavostí výpočetního střediska Masarykovy university v Brně. 

Jednacím jazykem je angličtina a do konference se lze přihlásit na elektronické 

adrese listserv@vm.ics.muni.cz. V roce 1998 založil další elektronickou konferenci 

Doc. Gaš z Přírodovědecké fakulty University Karlovy na téma chromatografické a 

elektromigrační separace a lze se do ní přihlásit na adrese chrom-el@natur.cuni.cz. 

V analýze potravin nalezla kapilární izotachoforéza uplatnění v sedmdesátých letech 

zejména pro stanovení organických kyselin ve víně a konzervačních látek. Později se 

rozšířila i na další analyty (glutamová kyselina, anorganické anionty v pitné vodě 

apod.) a stala se tak významnou separační analytickou metodou komplementární 

k chromatografickým technikám. 


2. Základy kapilární izotachoforézy 

Základy kapilární izotachoforézy 

1, , , , 

V této „teoretické“ kapitole 9 10 11 12 je vysvětlena elektroforetická koncepce 

pohyblivosti iontů, jsou stručně popsány principy elektroforetických technik a 

podrobně je zde pojednáno o izotachoforéze, včetně matematického modelu. 

V závěru kapitoly jsou v přehledu uvedeny jevy provázející izotachoforetickou 

analýzu. 

2.1 Principy elektroforetických technik 

Jak již bylo zmíněno v úvodní části, patří izotachoforéza mezi elektroforetické 

techniky, které jsou založeny na migraci (pohybu) nabitých částic v elektrickém poli. 

Částice se v poli o intenzitě b E (V.m -1 ) pohybuje rychlostí v (m.s -1 ) podle rovnice 

v = m ⋅ 

E 

(rovnice 1), 

kde m je efektivní pohyblivost částice (m 2 V -1 s -1 ) závislá na řadě faktorů, které 

budou probrány později. 

TABULKA 2 

Pojmenování elektroforetických technik (* ponechány anglické názvy) 

Agaroforéza Slab gel electrophoresis * 

Cataforéza Pore gradient electrophoresis * 

Cons elektroforéza Elektrochromatografie 

Continuous flow electrophoresis * Papírová ionografie 

Dielektroforéza Steady-state stacking * 

Ion focusing * Technika pohyblivého rozhraní 

Ionoforéza Disková elektroforéza 

Izoelektrická fokuzace Gelová elektroforéza 

Izotachoforéza Zónová elektroforéza 

Omegaphoresis * Elektroreoforéza 

Density gradient electrophoresis * Imunoelektroforéza 

Deviation electrophoresis * Transphoresis * 

Multiphasic electrophoresis * Papírová elektroforéza 

Endless belt electrophoresis * Mikroelektroforéza 

Vytěsňovací elektroforéza Preparativní elektroforéza 

Vysokonapěťová elektroforéza Ion migration technique * 

b Intenzita elektrického pole je dána rozdílem elektrického potenciálu na jednotkové vzdálenosti 



Rozdíly v efektivních pohyblivostech způsobují rozdíly v rychlosti pohybu a tím 

mohou být nabité částice separovány. Separační techniky založené na tomto 

principu se nazývají elektroforetické techniky. Elektroforetické (elektromigrační) 

metody je možné klasifikovat podle různých kritérií. V minulosti se pod pojmem 

elektroforéza rozumělo dělení koloidních částic v elektrickém poli, zatímco separace 

iontů se nazývala ionoforéza. Jestliže si uvědomíme, že elektrickým polem vyvolaná 

migrace nabitých částic se týká iontů, biopolymerů, buněk či koloidních částí, pak by 

obdobně pro separaci každého druhu nabité částice existovalo různé pojmenování. 

Z tohoto důvodu nemá rozdělení elektromigračních metod na elektroforézu a 

ionoforézu smysl. Dalším kritériem může být množství separované látky, tzn. že 

rozlišujeme analytickou, mikropreparativní či preparativní elektroforézu, podle 

vloženého napětí nízkonapěťovou nebo vysokonapěťovou elektroforézu a nebo 

podle způsobu antikonvekční stabilizace známe papírovou, gelovou či kapilární 

elektroforézu. Klasifikace elektromigračních metod podle uvedených kritérií vede 

jednoznačně k nepřehlednosti (viz předchozí kapitola a TABULKA 2). V současnosti 

se uplatňuje nový přístup pro klasifikaci elektroforetických metod, který je umožňuje 

jednoduše třídit. Toto třídění vychází z počátečních a okrajových podmínek pokusu a 

předpokládá rozdělení separační jednotky (zařízení, ve kterém probíhá dělení) na tři 

části, a to: separační, katodová a anodová (Obrázek 1). Podle složení roztoků, 

kterými jsou jednotlivé části vyplněny na začátku pokusu, můžeme rozlišit čtyři 

základní elektroforetické techniky, a to zónovou elektroforézu, techniku pohyblivého 

rozhraní, elektrofokuzační techniky a izotachoforézu. Z uvedeného je zřejmé, že 

v dané separační jednotce mohou být realizovány všechny elektroforetické techniky. 

+ - 

Separační prostor 

anodový prostor katodový prostor 

Obrázek 1 

Obecné schéma zařízení pro elektroforetickou separaci 


2.1.1 Zónová elektroforéza 


Z uvedených elektroforetických technik je zónová elektroforéza v praxi 

nejrozšířenější. Je analogií eluční chromatografie a jejím hlavním rysem je, že celý 

systém (katodový, anodový i separační prostor) je vyplněn roztokem stejného 

elektrolytu, který se nazývá základním nebo nosným elektrolytem. Tento roztok 

obecně tlumí pH a jeho koncentrace je obvykle podstatně vyšší, než jsou 

koncentrace složek analyzované směsi. Důsledkem je konstantnost pH a gradientu 

napětí podél celého separačního prostoru. 

I 

+ 

II 

A - 

B + 

+ A - 

Obrázek 2 

B + 

X - 

dX 

Y - 

A - 

B + 

dY 

Z - 

S 

X, Y, Z a W 

dZ 

S 

Separace směsi aniontů X, Y a Z a kationtu W zónovou elektroforézou. Všechny části 

systému jsou vyplněny nosným elektrolytem AB. Vzdálenosti dX, dY, dZ a dW se používají pro 

identifikaci iontů X, Y, Z a W. (I) počáteční stav analýzy (II) je situace po rozdělení směsi; S 

= místo dávkování vzorku 

CITP v analýze potravin 7 

dW 

A - 

B + 

W + 

A - 

B + 

A - 

B + 

- 

-


Jednotlivé zóny putují stále stejnou rychlostí, takže se v průběhu separace od sebe 

neustále vzdalují. Ionty vzorku se po určité době separují, jestliže jsou rozdíly v jejich 

efektivních pohyblivostech dostatečně velké. Vlivem difúze se zónová rozhraní 

s časem rozmývají. Situaci na začátku separace a po rozdělení směsi ilustruje 

Obrázek 2. Podobně jako je tomu např. u papírové chromatografie, i zde se používá 

k identifikaci jednotlivých iontů hodnota RF definované vztahem 

R = 

F 

d 

d 

i 

s 

(rovnice 2), 

kde di je migrační vzdálenost středu zóny i-tého iontu od startu a ds je vzdálenost pro 

standard za daných podmínek. Zónová elektroforéza se nejčastěji realizovala na 

papíru nebo gelu. V současnosti se velmi rychle rozvíjí zónová kapilární elektroforéza 

ve spojení s fyzikálními metodami detekce on-line. Kritériem separovatelnosti dvou 

iontů je jejich relativní rozdíl efektivních pohyblivostí nazývaný jako selektivita a 

definovaný 

m 

m 

− m 

∆m 

A B A, 

B 

∆ r = = 

(rovnice 3). 

mA 

mA 

Dosažitelná vysoká účinnost dělení zónovou kapilární elektroforézou vedla k vzniku 

pojmu vysokoúčinná zónová elektroforéza (HPCE). 

2.1.2 Technika pohyblivého rozhraní 

Tato technika se v anglosaské literatuře nazývá „moving boundary electrophoresis“ a 

nebo v analogii s frontální chromatografií také frontální elektroforéza. V minulosti se 

hojně využívala pro dělení bílkovin. Na počátku analýzy (např. aniontů) je anodová a 

separační část naplněna roztokem vedoucího elektrolytu PL, jehož anion L má větší 

pohyblivost než jakýkoliv z aniontů vzorku. Protiion P tvoří zpravidla s aniontem L 

pár, který má pufrační schopnost. Katodová část je naplněna vzorkem (viz Obrázek 

3). Po určité době od vložení elektrického pole se dosáhne částečného rozdělení 

směsi aniontů X, Y a Z do diskrétních zón. Čistou složku obsahuje pouze zóna (X), 



která následuje po vedoucí zóně L. Efektivní pohyblivost aniontu X je větší než Y a Z 

(a menší než pohyblivost vedoucího aniontu L). 

I 

+ 

+ 

II 

Obrázek 3 

L - 

P + 

L - 

P + 

L - 

P + 

X - 

P + 

L - 

P + 

X - + Y - 

X - + Y - + Z - 

Separace směsi aniontů X, Y a Z a kationtu W technikou pohyblivého rozhraní. Anodová a 

separační část je naplněna vedoucím elektrolytem PL a katodová část vzorkem. (I) počáteční 

stav analýzy (II) je situace po rozdělení směsi. 

Každá další zóna je už směsná, tzn. že za čistou zónou X následuje směsná zóna X 

a Y (anion Y má efektivní pohyblivost menší než X, ale větší než Z) a jako poslední 

směsná zóna X, Y a Z. Protože tato technika nedokáže úplně rozdělit směs analytů, 

ztratila analytické využití v separaci a analýze bílkovin. 

2.1.3 Elektrofokuzační techniky 

Charakteristikou elektrofokuzačních metod je migrace a zakoncentrování látek do 

zón, ve kterých nabývají nulové pohyblivosti. Vytvořené experimentální podmínky 

kompenzují vliv difúze a systém zón je po rozdělení časově a prostorově stabilní do 

takové míry, jakou zaručuje časová a prostorová stabilita parametru definujícího pro 

danou látku oblast nulové pohyblivosti. Vedle elektrofokuzace kationtů kovů 13 


P + 

P + 

X - 

Y - 

Z - 

X - 

Y - 

Z - 

- 

W + 

- 

W +


v gradientu komplexotvorného činidla c , které nenabylo širšího analytického uplatnění, 

je významnou zejména izoelektrická fokuzace (IEF) amfolytů v gradientu pH. 

V průběhu IEF se vytváří gradient pH a jednotlivé separandy (nejčastěji bílkoviny či 

peptidy) se v gradientu pH umístí do polohy odpovídající jejich izoelektrickému bodu 

pI. 

I 

+ - 

II 

Obrázek 4 

S 

A C 

C 

B 

X, Y, Z 

+ - 

S 

A C X C Y C Z C B 

4 6 8 

Izoelektrická fokuzace směsi amfolytů X, Y a Z o izoelektrickém bodě pI 4, 6 a 8 v gradientu 

pH (S je místo dávkování vzorku). Anodová část je naplněna kyselým a katodová část 

alkalickým elektrolytem. Separační část je naplněna nosným amfolytem zajišťujícím gradient 

pH. (I) počáteční stav analýzy (II) je situace po rozdělení směsi. 

c Gradient se realizuje umístěním alkalického roztoku komplexotvorného činidla do katodového a minerální 

kyseliny do anodového prostoru. Po určité době od zapnutí elektrického proudu se vytvoří gradient pH a tím 

díky rostoucí protonizaci i gradient koncentrace ligandu. 

10 CITP v analýze potravin 

pH


Zde je jejich efektivní pohyblivost nulová, a proto se s časem nemění jejich poloha. 

Princip ilustruje Obrázek 4. Šířka zóny je úzká, neboť proteiny, které oddifundovaly, 

se vracejí elektromigrací zpět. Je několik způsobů, jak vytvořit pH gradient. Nejčastěji 

se používá směsi amfolytů, jejichž izoelektrické body se v daném intervalu pH 

kontinuálně mění. Migrací v elektrickém poli mezi alkalickou katodou a kyselou 

anodou doputují všechny amfolyty do místa svého izoelektrického bodu, a tak vytvoří 

pH gradient. Tato technika se realizuje na tenké vrstvě gelu (polyakrylamid, agarosa) 

s následnou imunochemickou nebo chemickou detekcí rozdělené směsi 

s fotometrickém vyhodnocením. V kapilárním uspořádání 14 s on-line detekcí je 

nedílnou součástí separace mobilizace. Cílem mobilizace je průchod fokuzovaných 

amfolytů detektorem. Lze toho dosáhnout např. aplikací tlaku, který vytlačí amfolyty 

ven z kapiláry přes detektor. Pokud to použité instrumentace dovolují, provádí se tato 

mobilizace za současné aplikace napětí na kapiláru, což zaručuje, že amfolyty 

zůstanou fokuzovány a nedojde k případnému difúznímu rozmytí fokuzovaných zón. 

Jiným způsobem je tzv. chemická mobilizace, která se může provádět dvěma 

způsoby. Záměnou báze v elektrodové nádobce katody za kyselinu nebo záměnou 

kyseliny v elektrolytové nádobce anody za bázi. Druhým způsobem chemické 

mobilizace je pak záměna jedné z elektrolytových nádobek za roztok soli (např. 

NaCl). Pokud se roztokem soli nahradí anolyt, probíhá mobilizace směrem k anodě a 

naopak. Celá metoda kapilární IEF má tedy dvě fáze, a sice fázi vlastní fokuzace a 

fázi detekce, která je v tomto případě vlastně synonymem mobilizace. Existují i 

postupy, kdy se celý proces provádí v jednom kroku. Jedná se o současné vložení 

napětí a tlaku na kapiláru, případně se využívá elektroosmotické mobilizace. 

Vzájemná separovatelnost dvou látek je dána minimálním rozdílem jejich pI (∆pH) 

hodnot vedoucí k rozlišení R=1. 

∆pI = 4⋅ 

( pH ) 

d 

Di 

dx 

dm 

d 

( ) E 

i 

⋅ 

pH 

(rovnice 4) 



Z rovnice vyplývá, že vysoké rozlišovací schopnosti IEF je dosaženo minimalizací 

d( 

pH ) 

směrnice pH gradientu v separační části, aplikací vysokých intenzit 

dx 

elektrického pole (E), fokuzací látek s nízkým difúzním koeficientem (Di) nebo 

snížením difúze vlivem stabilizujícího prostředí (gel) a velkou změnou pohyblivostí v 

okolí svého izoelektrického bodu 

proteiny lišící se o 0,005 pI jednotek. 

2.1.4 Izotachoforéza 

dmi . Ve určitých případech je možné rozlišit 

d( 

pH ) 

Při izotachoforéze se používají dva základní elektrolyty, vedoucí (leading) a koncový 

(terminating). Vedoucí elektrolyt obsahuje vedoucí ion, který má větší efektivní 

pohyblivost (v absolutní hodnotě) než všechny analyzované ionty vzorku. Koncový 

(zakončující) elektrolyt obsahuje koncový ion, který má menší efektivní pohyblivost 

než kterýkoliv ion vzorku. V jedné analýze je možné separovat pouze jeden druh 

iontů, tj. anionty nebo kationty. Při separaci aniontů je na začátku experimentu 

anodový a separační prostor vyplněn vedoucím elektrolytem (viz Obrázek 5). Tento 

elektrolyt obsahuje kromě vedoucího aniontu (bývá používán nejčastěji chloridový 

anion, pro kationické analýzy draselný či amonný kation) kation, tzv. protiion, který 

spolu s vedoucím aniontem tvoří pH tlumící směs. Katodová část je vyplněná 

roztokem zakončujícího elektrolytu. Roztok obsahující analyzovaný materiál se 

vkládá mezi vedoucí a koncový elektrolyt. Vložením stejnosměrného elektrického 

proudu se anionty začnou pohybovat k anodě. Vzhledem k tomu, že v době startu 

analýzy se nacházejí všechny anionty vzorku v oblasti shodné intenzity elektrického 

pole E pohybují se podle rovnice (1) různými rychlostmi, které jsou úměrné jejich 

efektivním pohyblivostem. Vedle rovnice (1) podmiňující separaci iontů A a B musí 

být v každém místě separačního prostoru splněny čtyři podmínky: 

1. Ohmův zákon 

E ⋅κ = 

i 

(rovnice 5) 



kde κ je specifická vodivost elektrolytu a i (= I/S) je proudová hustota, která je 

konstantní pro daný separační prostor o průřezu S a hnacím proudu I. 

Obrázek 5 

A 

+ 

B 

+ 

C 

+ 

D 

R,E,t 

L - 

P 

+ 

L - 

P 

L - 

P 

L - 

L - 

P 

L - 

P 

A 

P 


A 

B 

S 

- 

T - 

xL xAB xT 

Izotachoforetická separace aniontů A a B, pro které platí m L > m A > m B > m T; (A) stav na 

začátku analýzy (vzorek nadávkován mezi vedoucí L a koncový elektrolyt T, P je protiion ve 

vedoucím a Q v zakončujícím elektrolytu); S je místo dávkování vzorku; (B) po určitém čase 

se vytvoří zóna složky A a směsné zóny podle principů pohyblivého rozhraní; (C) stav po 

dosažení ustáleného stavu; (D) průběh elektrického odporu (R), intenzity elektrického pole 

(E), teploty (t) a koncentrace (c) podél separačního prostoru v ustáleném stavu. 

B 

P 

T - 

P 

A 

P 

A 

B 

P 

B 

P 

T - 

P 

P 

Q 

- 

T - 

Q 

- 

T - 

Q 

c


2. Podmínka elektroneutrality 

n 

∑ 

i= 

1 

i ⋅ c z 

i 

= 0 

(rovnice 6), 

která vyjadřuje samozřejmý požadavek, že součet nábojů kationtů a aniontů musí být 

v každém makroskopickém objemu stejný 

3. Rovnice kontinuity 

∂ 

∂t 

ci ∂ci 

= sign ⋅ z ⋅ mi 

⋅ E ⋅ 

i 

∂x 

(rovnice 7) 

popisující časové změny koncentrace jednotlivých iontů v daném místě separační 

trasy (souřadnice x). 

4. Kohlrauschova regulační ω-funkce v nejobecnějším tvaru, platná pro silné jedno- i 

ω 

vícemocné elektrolyty a pro slabé jednomocné elektrolyty 

( x) 

= 

c 

( x) 

n 

i 

∑ 

i= 1 mi 

⋅ z 

i 

(rovnice 8), 

kde sumace se provádí přes všechny látky (n) přítomné v daném místě o délkové 

souřadnici x. Rovnice vyjadřuje, že v každé „fázi“ (tj. části zařízení naplněné daným 

elektrolytem) má ω-funkce v závislosti na složení a koncentraci svou vlastní a 

konstantní hodnotu v místě souřadnice x. Tato konstantní hodnota se v každém 

místě dané souřadnicí x udržuje i v průběhu separačního procesu, tzn. že migrující 

zóny kopírují profil původního rozložení regulační funkce. Význam regulační funkce 

tedy tkví v tom, že vystihuje existenci diskontinuit. Na počátku izotachoforetické 

analýzy (viz Obrázek 5 ad A) jsou přítomny tři diskontinuity (zóny, fáze) s různou 

hodnotou regulační ω-funkce – zóna zakončujícího elektrolytu (T), vzorku (A,B) a 

vedoucího elektrolytu (L). Podle rovnice (8) se v průběhu separace migrující zóny 

vzorku musí koncentračně přizpůsobit původní hodnotě ω-funkce v zóně vedoucího 

elektrolytu. Podobně migrující zóna zakončujícího iontu se musí v oblasti xA,B 



přizpůsobit původní hodnotě regulační ω-funkce v místě vzorku a v oblasti xL původní 

hodnotě určené složením a koncentrací vedoucího elektrolytu (viz Obrázek 5, D). Po 

určité době se dosáhne rozdělení směsi aniontů A a B do těsně za sebou jdoucích 

zón, které se na rozdíl od počátku separace pohybují stejnou rychlostí (viz Obrázek 

5, C, D). Bylo dosaženo tzv. ustáleného stavu. Od tohoto okamžiku se všechny zóny 

pohybují stejnou a konstantní rychlostí (plyne odtud i název techniky – viz Kapitola 1) 

a pro tento stav typický pro izotachoforézu je charakteristické: 

� 

� 

� 

� 

� 

� 

� 

� 

� 

� 

každá ze zón obsahuje pouze jeden druh aniontů (pokud bylo dosaženo úplné 

separace) 

ve všech zónách je přítomen stejný protiion shodný s protiiontem vedoucího 

elektrolytu 

koncentrace příslušného aniontu je podél zóny konstantní a mimo ni nulová 

zóny jsou uspořádány v pořadí klesající efektivní pohyblivosti od vedoucího 

k zakončujícímu iontu (kromě případu inverze pohyblivosti) 

fyzikální vlastnosti (koncentrace, elektrická vodivost, intenzita elektrického pole, 

pH, teplota) se mění od zóny k zóně skokem a toto dovoluje použití fyzikálně- 

chemických metod detekce pro vyhodnocení separace 

Izotachoforéza může být realizována na stabilizujících nosičích (papír, gel) nebo ve 

volném roztoku, v analytickém či preparativním uspořádání. Uspořádání 

izotachoforézy ve volném roztoku v kapiláře je velmi výhodné pro využití v chemické 

analýze. Přednosti kapilárního uspořádání jsou zejména: 

dělení a vyhodnocení analýzy se provádí ve volném roztoku, což eliminuje 

nedefinované interakce analytu s nosičem 

kapilára o vnitřním průměru 100 až 1000 µm vykazuje antikonvekční stabilizující 

efekt (podobně jako gel či papír) 

elektroosmotický tok (viz kapitola 2.4.1) se potlačuje použitím vhodných materiálů 

na výrobu kapilár a aditiv do vedoucího elektrolytu 

on-line vyhodnocení analýzy (kvalitativní i kvantitativní) pomocí fyzikálních metod 

detekce 

volbou vhodných podmínek analýzy (průměr kapiláry, koncentrace elektrolytů) lze 

dosáhnout velmi nízkých detekčních limitů 



� 

� 

použitím kapilár malých průměrů se dá vzhledem na dobrý odvod tepla aplikovat 

vysoká proudová hustota, a tím urychlení analýzy 

celý proces analýzy v kapilárním uspořádání lze automatizovat 

V dalších kapitolách bude až na vyjímky věnována pozornost výhradně kapilárnímu 

uspořádání analýzy. 

2.2 Elektroforetická koncepce pohyblivosti 

Každá volná, elektricky nabitá částice se v elektrickém poli pohybuje ve směru 

daném znaménkem náboje a orientací elektrického pole. Rychlost tohoto pohybu je 

závislá na náboji částice a odporu prostředí. Malé částice s velkým nábojem se 

budou pohybovat rychleji než částice objemné, nesoucí pouze malý náboj. Tuto 

vlastnost popisuje veličina zvaná elektroforetická pohyblivost (electrophoretic 

mobility), která vyjadřuje rychlost pohybu částice nebo iontu v jednotkovém 

elektrickém poli. Hodnota pohyblivosti je pro daný ion charakteristická a za určitých 

experimentálních podmínek konstantní. Jednotkou pohyblivosti je m 2 V -1 s -1 , případně 

cm 2 V -1 s -1 . Hodnotě pohyblivosti se přisuzuje znaménko odpovídající náboji 

příslušného iontu. Hydroxoniový (H3O + ) ion má nejvyšší pohyblivost ze všech iontů a 

při 25 °C je to 362,5 X 10 -9 m 2 V - 1 s -1 , draselný kation 76,2 x 10 -9 m 2 V -1 s -1 , 

hydroxylový anion (OH - ) -205,5 x 10 -9 m 2 V -1 s -1 a chloridový anion -79,1 x 10 -9 m 2 V -1 

s -1 . Při hodnotách E ~ 10 4 V m -1 (běžně aplikované intenzity elektrického pole 

v současné kapilární izotachoforéze) je migrační rychlost iontů v řádu jednotek cm 

min -1 . 

Pro rychlost pohybu nabité částice platí rovnice 1. Tato rovnice je zdánlivě 

paradoxní, neboť konstantní hnací síle (E) odpovídá konstantní rychlost pohybu 

nabité částice. Ve smyslu fyzikálních zákonů by však nabitá částice měla mít 

konstantní zrychlení, tj. rovnoměrný, zrychlený pohyb. Zdánlivý rozpor tkví v tom, že 

(rovnice 1) popisuje chování makrosystému. Nabitá částice se pod vlivem 

elektrického pole pohybuje roztokem zrychleným pohybem nikoliv po přímce, nýbrž 

po klikaté dráze složené z velkého počtu krátkých přímkových úseků. Je to vlastně 

obdoba Brownova pohybu. Přitom ovšem trvalý účinek potenciálového rozdílu 



zajišťuje to, že se ionty v průměru posunují ve směru pole. Elektrickou sílu 

způsobující tento pohyb lze vyjádřit 

F = z ⋅e 

⋅ E 

1 

(rovnice 9), 

kde z je počet nábojů iontu, e je elementární náboj iontu a E je intenzita vloženého 

elektrického pole. Proti elektrické síle působící na ionty je namířen především frikční 

odpor kladený rozpouštědlem. Přestože není rozpouštědlo spojitým prostředím, 

užívá se k odhadu tohoto účinku většinou Stokesova zákona 

F = f c ⋅v 

= −6 

⋅π 

⋅η 

⋅ r ⋅v 

2 

(rovnice 10), 

kde η je viskozita rozpouštědla, r je poloměr iontu a v je výsledná rychlost postupu 

iontů ve směru pole. Pro nekulové částice je tzv. frikční faktor fc přímo úměrný 

viskozitě rozpouštědla, ale je nutné zavedení korekčního faktoru zohledňující tvar, 

velikost a orientaci nabité částice. 

Vedle tohoto tzv. viskozitního efektu je nutné přihlédnout ještě ke dvěma významným 

elektrickým jevům. Ion je v klidové poloze obklopen opačně nabitou iontovou 

atmosférou. Při pohybu iontu vlivem elektrického pole se tento snaží táhnout opačně 

nabitou „aureolu“ s sebou. Iontová atmosféra má však jistou setrvačnost a nemůže 

se proto okamžitě přizpůsobit nové poloze svého středového iontu. Tím se atmosféra 

kolem pohybujícího se iontu stává asymetrickou, jak je znázorněno na Obrázku 6. Za 

iontem se vytváří efektivní přebytek opačného náboje, který způsobuje 

elektrostatické brzdění, a zpomaluje tak postup iontů ve směru elektrického pole. 

Toto brzdění (F3) se označuje jako relaxační d efekt. Vzhledem k jeho podstatě se 

tento efekt uplatňuje tím více, čím je vyšší koncentrace iontů. Druhé elektrostatické 

působení snižující pohyblivost iontů se nazývá elektroforetický efekt (F4). Ionty 

vytvářející atmosféru kolem daného středového iontu se totiž vlivem vnějšího 

elektrického pole samy také pohybují, a to právě opačným směrem. Protože jsou 

však solvatovány, snaží se unášet molekuly rozpouštědla s sebou, čímž dochází 

d tento efekt je také označován jako asymetrický 



k výslednému toku rozpouštědla v opačném směru, než jakým se pohybuje daný 

středový ion. 

- 

Obrázek 6 

- 

- 

+ 

- 

- 

- 

I II 

- - 

+ 

+ 

- - 

- 

- - 

Relaxační (asymetrický) efekt; (I) iontová atmosféra kolem iontu v klidové poloze; (II) 

asymetrický oblak kolem pohybujícího se iontu v elektrickém poli 

Tento ion je vlastně nucen plout „proti proudu“. Pro stacionární stav e pohybu iontu 

platí, že součet výše uvedených sil musí být roven nule, takže platí 

F 

1 

nebo 

+ F + F + F 

2 

z c 

3 

4 

3 

= 0 

⋅e ⋅ E − f ⋅v 

+ F + F 

4 

= 0 

takže rychlost pohybu lze vyjádřit vztahem 

z e E F3 

F4 

v 

f 

+ + ⋅ ⋅ 

= 

c 

(rovnice 11) 

(rovnice 12), 

(rovnice 13) 

Z této obecné rovnice je zřejmý vliv asymetrického a elektroforetického efektu f , 

velikosti (a tvaru) částice a použitého rozpouštědla na rychlost pohybu částice. 

Jinými slovy je při stacionárním stavu pohybu iontu elektrická hnací síla rovna součtu 

e nabitá částice dosáhne tohoto stacionárního stavu asi za 10 -13 s 

f tyto síly působí proti pohybu iontu, a mají tedy v absolutním vyjádření záporné znaménko 



frikčního, asymetrického a elektrostatického brzdění. Je-li tedy elektrická hnací síla 

větší než součet všech brzdících sil, je rychlost pohybu nabité částice (iontu) 

popsána rovnicí 1. Z hlediska elektroforetických separačních technik potřebuje pojem 

pohyblivosti (m) iontu či nabité částice zpřesnění. Jak se bude chovat v elektrickém 

poli látka neúplně disociovaná nebo látka distribuovaná do několika iontových forem? 

Je možné rozlišit jednotlivé iontové formy? Jaká bude výsledná rychlost migrace? 

Pro zodpovězení těchto otázek musíme uvažovat o tom, jaký je charakter kinetiky, tj. 

rychlost ustalování rovnováhy mezi jednotlivými iontovými formami v závislosti na 

změně okolních podmínek (teplota, složení roztoku aj.). V zásadě jsou možné dva 

krajní případy: 

1. Rovnováhy mezi jednotlivými iontovými formami se ustavují rychle (kineticky 

labilní rovnováhy) a látka, tj. směs všech přítomných iontových forem, bude 

v elektrickém poli migrovat jako jeden homogenní celek. Příkladem jsou 

acidobázické rovnováhy vícesytných kyselin či bází, kdy není možné odlišit 

jednotlivé disociační stupně. 

2. Rovnováhy mezi jednotlivými iontovými formami se ustavují pomalu (kineticky 

stabilní rovnováhy) a látka bude migrovat ve vzájemně oddělených iontových 

formách a z hlediska separační techniky se bude jevit jako směs. 

2.2.1 Absolutní, aktuální a efektivní pohyblivost iontů 

Fyzikálně-chemickou konstantou iontu, závislou pouze na teplotě a použitém 

rozpouštědle, je absolutní (tzv. limitní) iontová pohyblivost g 0 

m . Je definovaná jako 

střední rychlost pohybu iontu v jednotkovém elektrickém poli v daném rozpouštědle 

při tzv.nekonečném zředění. Za těchto podmínek není rychlost ovlivněna iontovou 

silou ani stupněm disociace. Hodnoty absolutních pohyblivostí jsou tabelovány 

svůj mimořádný význam, neboť z nich můžeme přibližně vypočítat skutečnou 

pohyblivost iontu za určitých podmínek. Absolutní pohyblivosti některých iontů 

shrnuje TABULKA 3. Můžeme je získat i z jiných tabelovaných hodnot, a to 

0 

z limitních iontových vodivostí Λ . Platí vztah 

g v angličtině ionic mobility nebo net mobility 

i 


i 

15 pro


Λ = z ⋅ F ⋅ m 

0 

i 

0 

i 

(rovnice 14), 

kde z je počet elementárních nábojů nesených iontem, F je Faradayova konstanta 

(96 487 C mol -1 ). 

Pro odhad limitní pohyblivosti (10 -9 m 2 V -1 s -1 ) menších iontů lze použít Joklovy 

rovnice, která má tvar 

m 

0 

= 

z 

⋅ 

485 

M 

− 

9, 

6 

(rovnice 15), 

kde M je molekulová hmotnost. Chyba odhadu se zpravidla pohybuje okolo ± 10 %, 

pro některé ionty je však vyšší (pro octan 25 %, pro dusičnan 30 %). 

Teplotní závislost iontové pohyblivosti je způsobena především závislostí viskozity na 

teplotě a může být popsána vztahem 

( 1+ 

⋅∆T 

) 

mT = mT 

α 

2 

1 

(rovnice 16), 

kde ∆T = T2 - T1 a koeficient α, který se poněkud liší pro různé ionty, má pro vodné 

roztoky průměrnou hodnotu 0.02 K -1 . Jinými slovy lze říci, že vzrůst teploty o 1 K 

způsobí vzrůst pohyblivosti o 2%. 

V reálných podmínkách však nepracujeme při nekonečném zředění a už při relativně 

nízkých koncentracích řádu µmol/l se pohyblivost iontů významně liší od limitní 

tabelované hodnoty díky vzájemným interakcím mezi ionty. Velikost odchylky je dána 

koncentrací iontu, velikostí náboje a vlastnostmi rozpouštědla. Z uvedeného je 

zřejmé, že pohyblivost iontu ovlivňují acidobázické a komplexační rovnováhy a 

použité rozpouštědlo. Z hlediska elektroforetické separace látek a její optimalizace je 

výhodné rozdělit parametry ovlivňující pohyblivost do dvou skupin, a to: 

a) faktory ovlivňující pohyblivost iontových forem 

b) faktory ovlivňující rozdělení do jednotlivých iontových forem 



Podle těchto faktorů rozlišujeme pojem aktuální (skutečné) a efektivní pohyblivosti h , 

přičemž vztah mezi jednotlivými pohyblivostmi pro ion i můžeme psát ve tvaru 

m = α ⋅ β ⋅γ 

⋅ m 

i 

0 

i 

0 

mi i 

kde je absolutní iontová pohyblivost, 

(rovnice 17), 

m je efektivní pohyblivost, α je koeficient 

charakterizující distribuci jednotlivých acidobázických forem, β charakterizuje 

distribuci do jednotlivých komplexních forem a γ charakterizuje velikost 

elektroforetického a asymetrického efektu, přičemž míra retardace vlivem těchto 

efektů je dána nábojem a koncentrací iontů a protiiontů. 

0 

γ ⋅ mi 

mi 

Výraz (označovaný jako ) je aktuální pohyblivost příslušné iontové formy 

za daných podmínek. Z uvedeného vyplývá, že je-li ion i v roztoku přítomný 

v několika acidobazických a komplexních formách, kterým přísluší rozdílné aktuální 

pohyblivosti, a jestliže se tyto rovnováhy rychle ustavují, pak ion migruje v jediné 

zóně s výslednou efektivní pohyblivostí 

m i . 

Změny molárních vodivostí, případně iontových pohyblivostí v závislosti na 

koncentraci elektrolytu byly popsány několika vztahy. Kohlrausch formuloval 

empirický vztah pro roztoky silných elektrolytů 

Λi i 

= Λ − A⋅ 

0 

c 

(rovnice 18), 

kde A je empirická konstanta a c je molární koncentrace. Obecné vyjádření této 

závislosti je možné uvést jako 

Λ c 

= Λ 

0 

− f ( c, 

a) 

(rovnice 19). 

Problém tohoto vztahu spočívá v nalezení správných hodnot konstant Λ0 a a. 

h v angličtině actual ionic mobility a effective ionic mobility 



TABULKA 3 

Absolutní iontové pohyblivosti 1, 10, 16 0 

m vybraných látek při 25 °C 

Kation 

H3O + 

K + 

NH4 + 

Na + 

Li + 

Mg ++ 

Ca ++ 

Sr ++ 

Ba ++ 

Cd ++ 

Cu ++ 

Co ++ 

Zn ++ 

Pb ++ 

Ni ++ 

Mn ++ 

Fe ++ 

BALA + 

EACA + 

KREAT + 

HIS + 

IMID + 

TRIS + 

AMMED + 

ETHAMIN + 

0 9 2 - -1 m . 10 [m V 1 s ] Anion 0 9 2 -1 -1 m . 10 [m V s ] 

362,5 OH - 

76,2 Cl - 

76,1 F - 

51,9 Br - 

38,7 HSO4 - 

53,0 SO4 2- 

59,3 NO3 - 

60,0 H2PO4 - 

63,8 HPO4 2- 

54,0 PO4 3- 

54,5 CN - 

51,0 HCO3 - 

54,0 CO3 2- 

71,5 HCOO - 

50,5 CH3COO - 

52,0 CH3(CH2)4COO - 

54,0 GLUTAM - 

36,7 GLUTAM 2- 

28,8 MES - 

37,2 CITR - 

29,6 CITR 2- 

52,0 CITR 3- 

29,5 LACT - 

29,5 BENZ - 

- 205,5 


-79,1 

-57,4 

-81,0 

-52,0 

-82,9 

-74,1 

-35,1 

-64,5 

-71,5 

-80,9 

-46,1 

-71,8 

-56,6 

-42,4 

-30,2 

-28,9 

-49,6 

-28,0 

-28,7 

-54,7 

-74,4 

-36,5 

-33,6 

44,3 SORB -33,4 

Nejznámějším řešením korekce iontové pohyblivosti na iontovou sílu je tzv. 

Onsangerova rovnice. 

Onsanger odvodil teoretickou rovnici, platnou pro uni-univalentní elektrolyty, která se 

dá obecně vyjádřit jako

Λ = Λ 

0 

⎡ 5 

3 

8, 

204 ⋅10 

8, 

250 ⋅10 

⎤ 

− ⎢ Λ + ⎥ 

3 0 

1 

⎢⎣ 

( ε rT 

) 2 ( ε rT 

) 2η 

⎥⎦ 



c 

r 

(rovnice 20), 

kde číselné hodnoty veličin jsou v jednotkách [Λ] = S cm 2 mol -1 , [η] = mPa s a cr je 

relativní koncentrace udávající počet molů disociované rozpuštěné látky na dm 3 . 

Jedním z možných tvarů Onsangerovy rovnice, ve kterém figurují namísto molárních 

vodivostí iontové pohyblivosti, je 

m 

A 

= 

m 

0 

A 

− 

( 0, 

23 

m 

0 

A 

z 

A 

⋅ z 

R 

+ 

31, 

43 

⋅10 

−9 

z 

A 

) 

1 

+ 

µ 

µ 

(rovnice 21). 

Veličina mA je tzv. skutečná pohyblivost iontu A, někdy nazývaná také aktuální 

0 

pohyblivostí, m je limitní pohyblivost téhož iontu. Symboly zA 

a zR jsou počty 

A 

elementárních nábojů iontu A a protiiontu R. Veličina µ je tzv. iontová síla definovaná 

jako 

µ = 0, 

5 

⋅ 

n 

∑ 

i= 

1 

c 

i i z 

2 

(rovnice 22). 

Při použití Onsangerovy rovnice je nutno vzít v úvahu omezení na uni-univalentní 

zředěné elektrolyty do koncentrace 10 -3 mol dm -3 . Jinou možností výpočtu aktuálních 

pohyblivostí je např. využití tzv. relativních pohyblivostí, definovaných jako 

r = 

m 

i 

i 

mref 

(rovnice 23). 

V tomto případě se zvolí vhodný referenční ion, u něhož je známá závislost jeho 

pohyblivosti mref na iontové síle. Tuto závislost lze extrapolovat vhodným


matematickým výrazem, např. pro sodík 

m Na 

1 

⎡ 2 

= 51 , 92 − 42, 

88µ 

+ 52, 

25µ 

− 30, 

24µ 

⎢⎣ 


3 

2 

⎤ 

⎥⎦ 

(rovnice 24), 

kde výsledná aktuální pohyblivost sodíku je dána v jednotkách 10 -5 cm 2 V -1 s -1 . 

Pokud jsou k dispozici relativní pohyblivosti iontů (předpokládá se nezávislost 

relativních pohyblivostí na koncentraci), lze pro tyto ionty vypočítat aktuální 

pohyblivost za dané iontové síly. 

U slabých elektrolytů existují v roztoku nejméně dva druhy částic - neionizované 

molekuly a příslušné ionty. Každý druh částice má jinou hodnotu iontové pohyblivosti 

(neionizované částice mají pohyblivost nulovou). Vzhledem k tomu, že jednotlivé 

částice jsou navzájem svázány rychlými acidobázickými rovnováhami, jeví se jejich 

soubor v elektrickém poli navenek jako jediná látka. Efektivní pohyblivost lze 

definovat následovně: látka, přítomná v roztoku ve více formách, které jsou navzájem 

v rychlé dynamické rovnováze (komplexační i jiné chemické rovnováhy), migruje 

elektrickým polem jako jediná látka o určité efektivní pohyblivosti 

m 

A 

= 

1 

c 

k 

∑cimi= ∑ 

A i= 

0 i= 

0 

k 

x m 

i 

i 

(rovnice 25), 

kde ci jsou koncentrace jednotlivé formy látky A, která je přítomná v roztoku o 

celkové analytické koncentraci c A a xi jsou molární zlomky jednotlivých forem látky 

A. 

2.3 Matematický model izotachoforézy 17 

Problémem v izotachoforetické analýze je volba vhodného elektrolytového systému, 

v němž po nástřiku vzorku obdržíme od všech analyzovaných látek stabilní zóny. Při 

výběru vhodného elektrolytového systému může pracovník vycházet ze zkušenosti, 

z°určitých všeobecných pravidel o migraci látek nebo z publikovaných 

izotachoforetických dat. Pokud se mu nepodaří nalézt v literatuře vyzkoušený 

elektrolytový systém vhodný pro separaci, je nucen ho hledat zkoušením různých


elektrolytových systémů. Mnohem operativnější je simulace izotachoforetické 

separace na počítači a podle výsledků simulace se lze rozhodnout, zda jím navržený 

elektrolytový systém použije, či nikoliv. Základní fyzikálně-chemický model 

izotachoforézy umožňuje matematický popis izotachoforetických zón a výpočet jejich 

složení a vlastností. Pro analytické účely vystihuje tento model izotachoforézy 

skutečný stav většinou dostatečně přesně. Z matematického hlediska představuje 

popis izotachoforetických zón pro definovaný vedoucí elektrolyt soustavu 

nelineárních rovnic, které lze řešit numericky. Níže uvedený model je koncipovaný 

pro jeden protiion (pufrující) a jeden koprotiion (komplexující). Matematický model 

ustáleného stavu (viz kapitola 2.1.4) může být vyjádřen pomocí rovnic popisujících 

� dynamické rovnováhy v roztocích 

� obecnou izotachoforetickou podmínku 

� hmotnostní bilanci protiiontu 

� princip elektroneutrality 

� modifikovaný Ohmův zákon 

V uvedeném matematickém modelu je zanedbán vliv teploty na disociační konstanty 

a pohyblivosti. 

2.3.1 Obecné rovnice 

Dynamické rovnováhy v roztocích 

Při popisu matematického modelu ustáleného stavu je uvažována analýza aniontů, 

přičemž pro analýzu kationtů platí obdobné vztahy. Ve vedoucí zóně připadají 

v°úvahu následující disociační rovnováhy: 

zL 

−i 

+ 

z L − j 

[ H L] 

↔ H + [ H L] 

n − i 

L 

n − j 

zB 

−i 

+ 

zB 

− j 

[ H B] 

↔ H + [ H B] 

n − i 

B 

L 

n − j 

zM 

−i 

+ 

[ M ( OH ) ] H O ↔ H + M ( OH ) 

i 

+ 2 

B 

zM 

− j 

[ ] 

(rovnice 26), 

(rovnice 27), 


j 

(rovnice 28). 

V rovnicích (22 až 24) nabývají indexy i hodnot od 0 do nL -1, nB -1 a nM -1 a indexy j


hodnot i+1. Symboly n a z jsou počty disociovatelných vodíků a maximální náboj 

vedoucího aniontu L, protiiontu B a koprotiiontu M. 

V zóně vzorku připadají v úvahu kromě rovnováh popsaných rovnicemi 26 až 28 

ještě následující disociační rovnováhy: 

zS 

−i 

+ 

zS 

− j 

[ H S ] ↔ H + [ H S ] 

n − i 

S 

n − j 

S 

(rovnice 29), 

kde nabývají indexy i a j stejných hodnot jako v předcházejících rovnováhách a 

M 

Z 

zS 

− j 

zM 

+ zS 

− j 

[ H S] 

↔ [ MH ] 

M 

+ 

nS 

− j 

nS 

− jS 

(rovnice 30), 

kde index j nabývá hodnot od 1 do nS .Ve vedoucí zóně se tvorba komplexu 

nepředpokládá. 

Obecná izotachoforetická podmínka 

V ustáleném stavu se všechny zóny pohybují stejnou rychlostí v, shodnou s rychlostí 

vedoucí zóny. Platí,že 

v = E ⋅ m = E ⋅ m 

L 

L 

S 

S 

(rovnice 31). 

Symboly EL a ES jsou potenciálové spády ve vedoucí zóně a zóně vzorku, symboly 

mL a mS efektivní pohyblivosti vedoucího aniontu a aniontu v zóně vzorku. 

Hmotnostní bilance protiiontu 

Hmotnostní bilance protiiontu je vyjádřením Kohlrauschovy regulační funkce. Slovně 

se dá popsat tak, že množství protiiontu, které vstupuje do zóny, musí být v 

ustáleném stavu rovno množství, které ze zóny vystupuje. Platí rovnice 

t 

[ mL 

( mS 

+ mB, 

S )] = cB, 

L[ 

mS 

( mL 

+ mB 

L )] 

t 

c B, 

S 

, 

t 

c B, 

S 

t 

c B, 

L 

(rovnice 32), 

kde a jsou celkové koncentrace protiiontu v zóně vzorku a ve vedoucí 



zóně, m S a L m efektivní pohyblivosti aniontu vzorku a vedoucího aniontu a B S 

a m B, 

L efektivní pohyblivosti protiiontu v zóně vzorku a ve vedoucí zóně. 

Princip elektroneutrality 

Každá zóna musí být navenek elektroneutrální. Musí tedy platit 

c 

+ 

H , L 

n 

M 

∑ 

i= 

0 

− c 

OH , L 

+ 

L 

∑ 

i= 

0 

( z − i) 

⋅ c = 0 

M 

n 

Z 

M 

B 

( z − i) 

⋅ c + ( z − i) 

L 

−i, 

L 

pro vedoucí zónu a 

c 

+ 

H , S 

n 

S 

∑ 

i= 

0 

− c 

OH , S 

+ 

B 

∑ 

i= 

0 

Z −i 

L 

n 

∑ 

i= 

0 

B 

⋅ c 

Z −i, 

L 

M 

S 

( z − i) 

⋅ c + ( z − i) 

⋅ c + ( z − i) 

( z + z − i) 

⋅ c = 0 

M 

S 

n 

MS , z 

M 

Z −i, 

S 

B 

+ z −i 

S 

c −i 

n 

∑ 

i= 

0 

M 


B 

Z 

M 

−i, 

S 

+ 

n 

∑ 

i= 

0 

S 

⋅ c 

Z −i 

S 

m , 

(rovnice 33) 

+ 

(rovnice 34) 

pro zónu vzorku, kde v rovnici (33) je koncentrace vedoucího aniontu L s 

Z L 

c −i, L 

c −i, 

L 

nábojem z - i, je koncentrace iontu B s nábojem z - i v zóně L, je 

Z B 

c H , L c OH , L 

koncentrace iontu M s nábojem z - i, a jsou koncentrace 

Z M 

+ 

H a 

v°zóně L. Symboly v rovnici (30) s indexem s jsou obdobné jako v rovnici (24) a platí 

pro zónu vzorku S, přičemž je koncentrace komplexu s nábojem z 

i v zóně S. 

Modifikovaný Ohmův zákon 

OH 

c , z + z −i 

M + zS - 

MS M S 

V izotachoforéze se pracuje s konstantní proudovou hustotou J. Platí rovnice 

J = E ⋅κ 

= E ⋅κ 

L 

L 

S 

S 

− 

(rovnice 35), 

kde EL a ES jsou potenciálové spády a κL a κS specifické vodivosti ve vedoucí zóně a


v zóně vzorku. Specifická vodivost κL ve vedoucí zóně může být vyjádřena vztahem 

⎛ 

κ L = ⎜ 

⎜c 

⎝ 

+ 

nM 

∑ 

i= 

0 

z 

M 

H , L 

m 

+ z 

H 

S 

+ c 

OH , L 

− i ⋅ c 

m 

Z M −i 

OH 

m 

+ 

Z M −i 

nL 

∑ 

i= 

0 

z 

L 

⎞ 

⎟ ⋅ F 

⎠ 

− i ⋅ c 

/ 1000 

a specifická vodivost κS v zóně vzorku 

⎛ 

κ S = ⎜ 

⎜c 

⎝ 

+ 

nM 

∑ 

i= 

0 

z 

M 

H , S 

m 

H 

− i ⋅ c 

+ c 

ZM −i 

OH , S 

m 

m 

ZM −i 

OH 

+ 

+ 

nS 

∑ 

i= 

0 

nL 

∑ 

i= 

0 

z 

M 

z 

S 

− i ⋅ c 

+ z 

S 

Z L −i 

Z S −i 

− i ⋅ c 

mH a mOH jsou aktuální pohyblivosti iontů 

m 

m 

Z −i 

L 

Z S −i 


+ 

+ 

nB 

∑ 

i= 

0 

nB 

∑ 

i= 

0 

MS , Z M + Z S −i 

m 

z 

z 

B 

B 

− i ⋅ c 

− i ⋅ c 

MS , Z M + Z S −i 

Z B −i, 

L 

Z B −i 

m 

⎞ 

⎟ ⋅ F 

⎠ 

m 

Z B −i 

Z B −i 

/ 1000 

+ 

(rovnice 36) 

+ 

(rovnice 37), 

+ − 

H a OH a F je Faradayova konstanta. 

Vydělením hodnotou 1000 se v rovnicích (36) a (37) převádí koncentrace z mol.l 

mol.cm -3 proto, aby specifická vodivost měla rozměr S.cm -1 . 

2.3.2 Výpočet parametrů zón v ustáleném stavu 

Cílem výpočtu je nalézt parametry zón, ze kterých je možné usoudit, zda za 

zvolených podmínek (složení vedoucího elektrolytu) jsou všechny složky vzorku 

separovány. Výpočet je založen na znalosti 

� všech iontových pohyblivostí a všech disociačních (případně komplexačních) 

konstant látek zahrnutých do uvažovaného izotachoforetického systému 

� úplného složení vedoucího elektrolytu, tj. koncentrací vedoucího iontu a 

protiiontu (případně koprotiiontu) nebo koncentrací vedoucího iontu a pH 

vedoucího elektrolytu 

Při výpočtu se postupuje tak, že se na základě výše uvedených údajů nejdříve 

vypočítají parametry vedoucí zóny a potom parametry zón vzorku. 

-1 na

Výpočet vedoucí zóny 


Ze zadaných hodnot disociačních konstant a celkových koncentrací vedoucího iontu 

a koprotiiontu se vypočtou koncentrace jejich iontových forem podle rovnice 

c 

Z M −i, 

L 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

i 

⎞ ⎡ 

⎟ / ⎢1 

+ 

⎟ 

⎠ ⎢⎣ 

M 

t 

= cM 

, L ∏ K M , j / cH 

, L ∑ ∏ 

j= 

1 

n 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

p 

p= 

1 j= 

1 

K 

M , j 


/ c 

H , L 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

⎠⎥ 

⎦ 

(rovnice 38), 

kde KM,j je disociační konstanta pro rovnováhu popsanou rovnicí (28) a je 

celková koncentrace koprotiiontu. Nahrazením indexu M v rovnici (34) za L nebo B 

dostaneme příslušné rovnice pro ion L nebo B. Celková koncentrace protiiontu se 

vypočítá z bilance elektroneutrality rovnice (33), kde jsou jednotlivé koncentrace 

iontových forem nahrazeny celkovými koncentracemi. 

c 

t 

B, 

L 

+ c 

⎧ 

⎪⎡ 

/ ⎨⎢z 

⎪⎩ 

⎢⎣ 

⎧ 

⎪ 

= ⎨c 

⎪⎩ 

t 

M , L 

B 

⎡ 

⎢z 

⎢⎣ 

+ 

OH , L 

M 

n 

− c 

H , L 

nM 

⎛ i 

+ ∑ ( z − ) ⋅ ⎜ 

M i 

⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎝ j= 

1 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

+ c 

⎡ 

⎢z 

⎢ 

⎣ 

nL 

⎛ i 

+ ∑ ( z − ) ⋅ ⎜ 

L i 

⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎝ j= 

1 

⎞⎤ 

⎟ 

⎠⎥ 

⎦ 

B 

( z − i) 

⎜ K / c ⎟⎥ 

/ ⎢1 

+ ( z − i) 

B 

∑ B ∏ 

i= 

1 j= 

1 

i 

t 

L 

L 

B, 

j 

M , j 

H , L 

/ c 

H , L 

⎡ 

⎢⎣ 

⎞⎤ 

⎡ 

⎟⎥ 

⎟ 

/ ⎢1 

+ 

⎠⎥ 

⎦ ⎢⎣ 

n 

L, 

j 

n 

/ c 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

M 

∑ ∏ 

i= 

1 j= 

1 

⎛ 

⋅⎜ 

⎜ 

⎝ 

H , L 

∑ B ∏ 

i= 

1 j= 

1 

i 

i 

⎞⎤ 

⎡ 

⎟ 

⎥ / ⎢1 

+ 

⎠⎥⎦ 

⎢⎣ 

K 

M , j 

K 

B, 

j 

/ c 

/ c 

n 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

L 

∑ ∏ 

i= 

1 j= 

1 

H , L 

H , L 

i 

⎞⎤⎫ 

⎟ 

⎪ 

⎥ 

⎟ ⎬ / 

⎠⎥ 

⎦⎪⎭ 

⎞⎤⎫ 

⎟ 

⎪ 

⎥ 

⎟ ⎬ 

⎠⎥ 

⎦⎪⎭ 

K 

L, 

j 

t 

c M , L 

/ c 

H , L 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

+ 

⎠⎥ 

⎦ 

(rovnice 39). 

Znalost celkové koncentrace protiiontu ve vedoucí zóně je potřebná k určení 

koncentrace protiiontu v ostatních zónách. Je to koncentrace protiiontu, která spolu 

s°vedoucím iontem tvoří pufr o zvoleném pH. Aby vypočtená koncentrace protiiontu 

odpovídala skutečné koncentraci, musíme všechny termodynamické konstanty 

použité při jejím výpočtu korigovat na iontovou sílu. Pomocí iontové síly se vypočítají 

aktivitní koeficienty podle Debye-Hückelových rovnic 18 

µ 

log γ − , = −0. 

509⋅ 

z − i ⋅ 

ZL i L 

L 

1+ 

µ 

(rovnice 40). 

Výměnou indexu L za B a M dostaneme obdobné vztahy pro protiion a koprotiion.


Iontová síla µ ve vedoucí zóně se spočítá podle vztahu 

⎡ nL 

⎛ 

µ = 0. 

5 ⋅ ⎢ ⎜ 

⎜∑ 

cZ 

L i L ⎟ ⎜∑ 

⎢⎣ 

⎝ i= 

0 

⎠ ⎝ i= 

0 

Podle vztahu 

n ⎞ ⎛ B 

2 ( z − i) 

⎟ + ⎜ c ( z − i) 

⎞ 

⎟ + c 

⎠ 

2 

− B −i 

B 

H L + c 

L 

, OH , L 

K = Kc 

⋅γ 

H ⋅γ 

Z − j, 

L / γ Z −i, 

L 

a L 

L 

se vypočítá korekce disociační konstanty a podle 

K = K ⋅γ 

/ γ / γ 

S , kor S Z + Z − j Z − j 

M 

S 

S 

Z 

M 


⎤ 

⎥ 

⎥⎦ 

(rovnice 41) 

(rovnice 42) 

(rovnice 43) 

korekce konstanty stability. Koncentrace jednotlivých iontových forem potřebné pro 

výpočet iontové síly se zjistí dosazením do rovnice (38). Efektivní pohyblivosti 

vedoucího iontu, protiiontu a koprotiiontu se vypočítají podle vztahu 

m 

L 

⎡ nL 

⎛ i 

⎤ ⎡ n ⎞ 

L ⎛ i 

= ⎢m 

⎜ 

⎟⎥ 

⎢ + ⎜ 

Z + ∑ mZ 

⋅ L −i 

⎢ 

⎜∏ 

K L, 

j / cH 

, L ⎟ 

/ 1 ∑ 

⎥ ⎢ ⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎣ 

⎝ j= 

1 ⎠ i= 

1 ⎦ ⎣ ⎝ j= 

1 

mZ m −i 

L, 

j 

/ c 

H , L 

⎞⎤ 

⎟ 

⎥ 

⎠⎥⎦ 

(rovnice 44), 

kde a jsou aktuální pohyblivosti vedoucího iontu s nábojem z a z - i. Pro 

L 

Z L 

anionty je m rovna nule. Nahrazením indexu L za B nebo M dostaneme obdobné 

rovnice pro protiion a koprotiion. Pro určení potenciálového spádu v zóně L je nutné 

nejdříve vypočítat specifickou vodivost podle rovnice (36). Potenciálový spád může 

být potom vyjádřen jako 

E = J / κ 

L 

Z 

L 

L 

kde J je proudová hustota i v separačním prostoru. 

i hnací proud vztažený na průřez separační kapiláry 

(rovnice 45),

Výpočet parametrů zóny vzorku 


Parametry zóny vzorku se vypočtou iteračně splněním podmínek ustáleného stavu. 

Hirokawa vychází při výpočtu zóny vzorku z efektivní pohyblivosti pro ion vzorku 

m 

S 

⎡ 

/ ⎢1 

+ 

⎢⎣ 

⎡ 

= ⎢m 

⎢⎣ 

n 

Z 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

S 

i 

+ 

S 

∑ ∏ 

i= 

1 j= 

1 

n 

⎛ 

⋅ ⎜ 

⎝ 

S 

∑ mZ 

S −i 

∏ 

i= 

1 j= 

1 

K 

S , j 

/ c 

H , S 

i 

⎞ 

⎟ 

+ c 

⎠ 

K 

Z 

S , j 

M 

, S 

/ c 

H , S 

⎞ 

⎟ 

+ c 

⎠ 

Z , S 

S 

nS 

nS 

⎛ i 

⋅∑ 

m ⋅∑ 

⋅ ⎜ 

Z S , S K MS, 

j ⎜∏ 

K 

i= 

1 i= 

1 ⎝ j= 

1 

K S , j 

K MS, 

j 

nS 

⎛ i 

⋅∑ 

m ⋅ ⋅ ⎜ 

MS, 

Z M + Z S −i 

K MS, 

i ⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎝ j= 

1 


S, 

j 

/ c 

H , S 

⎞⎤ 

⎟ 

⎥ 

⎠⎥⎦ 

S , j 

/ c 

H , S 

⎞⎤ 

⎟ 

⎥ / 

⎠⎥⎦ 

(rovnice 46), 

kde je disociační konstanta vzorku S, konstanta stability komplexu MS, 

c , koncentrace koprotiiontu M s maximálním nábojem zM 

, koncentrace 

Z S 

S 

protonu v zóně vzorku a m je absolutní pohyblivost. V rovnici (46) je koncentrace 

koprotiiontu neznámá a může být vyjádřena jako 

c 

Z M , S 

⎡ 

⎢1 

+ 

⎢⎣ 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

M 

t 

= cM 

, S ∑ ∏ 

n 

p 

p= 

1 j= 

1 

K 

M , j 

t 

c M , S 

/ c 

H , S 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

⎠⎥ 

⎦ 

c H , S 

(rovnice 47) 

Celková koncentrace je řízena rovnicí odvozenou z hmotnostní bilance 

popisující koprotiion vstupující a vystupující ze zóny vzorku 

[ mS 

( mL 

+ mM 

L )] [ mL 

( mS 

mB 

S )] 

t t 

c M , S = cM 

, L 

, / + , 

(rovnice 48), 

kde m M , L je efektivní pohyblivost koprotiiontu v zóně L, vypočtená z (rovnice 44) a 

m , je efektivní pohyblivost koprotiiontu v zóně vzorku, která může být vyjádřena 

M S 

jako


m 

M , S 

⎡ 

/ ⎢1 

+ 

⎢⎣ 

⎡ 

= ⎢m 

⎢⎣ 

n 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

Z 

i 

M 

S 

∑ ∏ 

i= 

1 j= 

1 

+ 

K 

n 

⎛ 

⋅ ⎜ 

⎝ 

S 

∑mZM −i 

∏ 

i= 

1 j= 

1 

M , j 

/ c 

H, 

S 

i 

⎞ 

⎟ 

+ c 

⎠ 

Z 

S 

K 

M , j 

/ c 

H, 

S 

⎞ 

⎟ 

+ c 

⎠ 

Z , S 

nS 

nS 

⎛ i 

⋅∑ 

m ⋅∑ 

⋅ ⎜ 

ZS 

, S K MS, 

j ⎜∏ 

K 

i= 

1 i= 

1 ⎝ j= 

1 

S 

nS 

⎛ i 

⋅∑ 

m ⋅ ⋅ ⎜ 

MS, 

ZM 

+ ZS 

−i 

KMS, 

i ⎜∏K 

i= 

1 ⎝ j= 

1 


S, 

j 

/ c 

H, 

S 

⎞⎤ 

⎟ 

⎥ 

⎠⎥⎦ 

S, 

j 

/ c 

H, 

S 

⎞⎤ 

⎟ 

⎥ / 

⎠⎥⎦ 

(rovnice 49). 

V rovnice (48) se opět objevuje m S . Kombinací rovnic (46), (47) a (48) může být 

získáno komplikované kvadratické vyjádření pro m S , což však není pro iterační 

výpočet nutné. Hirokawa uvádí, že jestliže jsou známé počáteční hodnoty pH zóny a 

dílčí koncentrace koprotiiontu v zóně vzorku , nebo jeho celková koncentrace v 

t 

c M , S 

téže zóně , může být celková koncentrace koprotiiontu použita k°získání 

počáteční hodnoty 

S 

c , S 

Z M 

m rovnice (46) a v následujících krocích iterace je určena 

rovnicí (47) a (48) může být použita pro další výpočet 

c , S 

Z M 

m S . Stejně tak je nezbytné pro 

výpočet efektivní pohyblivosti koprotiiontu m M , S znát dílčí, nebo celkovou 

koncentraci iontu vzorku. Celková koncentrace protiiontu může být vyjádřena rovnicí 

(32), odvozenou z látkové bilance. Při odvození rovnice pro celkovou koncentraci 

volného iontu vzorku se vychází z rovnice (33) pro elektroneutralitu. Koncentrace 

c 

komplexu , která v této rovnici figuruje, se vyjádří pomocí celkové koncentrace 

MS 

c 

t 

M 

koprotiiontu a celkové koncentrace iontu vzorku jako 

c 

MS , Z M + Z S −i 

⎡ 

⋅ ⎢1 

+ 

⎢⎣ 

n 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

= c 

p 

S 

∑ ∏ 

p= 

1 j= 

1 

K 

Z M 

M , j 

⋅ c 

ZS 

/ c 

⋅ K 

H , S 

MS , i 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

⋅ K 

⎠⎥ 

⎦ 

⎛ 

⋅ ⎜ 

⎝ 

i 

∏ 

j= 

1 

MS , j 

K 

⎛ 

⋅ ⎜ 

⎝ 

S , j 

p 

∏ 

j= 

1 

/ c 

K 

H , S 

M , j 

⎞ ⎡ 

⎟ 

= ⎢1 

+ 

⎠ ⎢⎣ 

/ c 

H , S 

⎞ 

⎟ 

⎠ 

n 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

c 

p 

t 

S 

S 

∑ ∏ 

p= 

1 j= 

1 

K 

S , j 

/ c 

H , S 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

⋅ 

⎠⎥ 

⎦ 

(rovnice 50). 

Celková koncentrace separovaného iontu se vypočítá podle rovnice, která vychází 

z°bilance elektroneutrality v zóně vzorku

c 

t 

S 

− c 

⎧ 

⎪⎡ 

nB 

⎛ i 

/ ⎨⎢∑( 

z − ) ⋅ ⎜ 

S i 

⎪⎩ 

⎢ 

⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎣ ⎝ j= 

1 

⎡ 

⎢1 

+ 

⎢⎣ 

⎪⎧ 

= ⎨c 

⎪⎩ 

t 

M , S 

n 

OH, 

S 

⎡ nM 

⎛ i 

⎢∑( 

z − ) ⋅ ⎜ 

M i 

⎢ 

⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎣ ⎝ j= 

1 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

p 

M 

∑ ∏ 

p= 

1 j= 

1 

− c 

K 

H , S 

M , j 

+ c 

/ c 

S, 

j 

H , S 

t 

B, 

S 

nL 

⎛ i 

∑( z − ) ⋅ ⎜ 

B i 

⎜∏ 

K 

i= 

1 ⎝ j= 

1 

/ c 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

⋅ 

⎠⎥ 

⎦ 

M , j 

H , S 

n 

S 

∑ 

i= 

1 

/ c 

⎞⎤ 

⎡ 

⎟⎥ 

⎟ 

/ ⎢1 

+ 

⎠⎥ 

⎦ ⎢⎣ 

( 

z 

H , S 

M 

⎞⎤ 

⎡ 

⎟⎥ 

⎟ 

/ ⎢1 

+ 

⎠⎥ 

⎦ ⎢⎣ 

+ z 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

M 

∑ ∏ 

p= 

1 j= 

1 

S 

n 

) 

B, 

j 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

M 

∑ ∏ 

− i ⋅ K 

p= 

1 j= 

1 

p 

n 

/ c 

K 

p 

S, 

j 

MS, 

i 

H , S 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

⎞ ⎡ 

⎟ 

/ ⎢1 

+ 

⎠ ⎢⎣ 


⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

+ c 

⎠⎥ 

⎦ 

⎞⎤⎫ 

⎟ 

⎪ 

⎥ 

⎟ ⎬/ 

⎠⎥ 

⎦⎪⎭ 

⎡ 

/ ⎢1 

+ 

⎢⎣ 


K 

/ c 

i 

∏ 

M , j 

H, 

S 

j= 

1 

K 

/ c 

S, 

j 

n 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

B 

∑ ∏ 

p= 

1 j= 

1 

H , S 

/ c 

p 

t 

M , S 

H , S 

K 

⎞⎫ 

⎟ 

⎪ 

⎟⎬ 

⎠⎪⎭ 

B, 

j 

/ c 

n 

H , S 

⎛ 

⎜ 

⎝ 

S 

∑ ∏ 

p= 

1 j= 

1 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

− 

⎠⎥ 

⎦ 

p 

K 

S, 

j 

/ c 

(rovnice 51). 

Při známém pH zóny vzorku může být využito dílčích koncentrací k výpočtu iontové 

síly v zóně. V rovnici (41) je nutno nahradit index L za S. Specifická vodivost zóny 

vzorku je vyjádřena rovnicí (37). Potenciálový spád se vypočítá podle rovnice (35). 

Postup výpočtu vlastností zóny vzorku předpokládá znalost pH v této zóně. Ve 

skutečnosti však pH zóny známo není a je jiné než ve vedoucí zóně. V separovaném 

systému je však konstantní proudová hustota a musí platit, že 

J = EL 

⋅κ 

L = ES 

⋅κ 

S = Q 

H , S 

⎞⎤ 

⎟⎥ 

⎟ 

/ 

⎠⎥ 

⎦ 

(rovnice 52). 

V ustáleném stavu musí platit rovnice (31) a míru ustáleného stavu vyjadřuje 

závislost 

RFQ = QL 

/ QS 

−1 

= mS 

⋅κ 

L / mL 

⋅κ 

S −1 

(rovnice 53) 

Výrazy QL a QS jsou veličinami Q z rovnice (52) pro zónu L a S. Možný tvar funkce 

RFQ(pH) ukazuje Obrázek 7. Funkce má zpravidla dva kořeny (pH1 a pH2), avšak 

fyzikální smysl má pouze jeden z nich a ten je skutečným řešením. V praxi je první 

stupeň iteračního výpočtu proveden použitím několika předpokladů: 

1. pH zóny vzorku je stejné jako ve vedoucí zóně 

2. iontová síla zóny vzorku použitá pro korekci pohyblivostí a pK je stejná jako ve 

vedoucí zóně


3. celková koncentrace koprotiiontu v zóně vzorku je stejná jako ve vedoucí zóně. 

0 

RFQ 

pH1 

Obrázek 7 

Možný tvar závislosti funkce RFQ na 

pH zóny 

Výpočet probíhá tak, že při 

aniontové analýze se pH zvyšuje 

(u kationtové snižuje) o určitý krok, 

přičemž probíhá výpočet 

způsobem uvedeným v této 

kapitole. Při každé iteraci se 

spočítá hodnota funkce RFQ a 

iterační výpočet se ukončí tehdy, 

až náboj prošlý zónou L se rovná 

náboji prošlému zónou vzorku S, jinými slovy tehdy, až je hodnota funkce RFQ 

nulová, případně tak malá, aby její absolutní hodnota byla menší než zvolená 

přesnost (zpravidla 10 -5 ). 

pH2 

pH 

2.4 Jevy doprovázející kapilární ITP 

Kapilární izotachoforézu doprovází několik jevů, které vycházejí jednak z principu 

metody jako takové a jednak z použité instrumentace. Společným působením těchto 

jevů je zpravidla zhoršení kvality separace, případně opakovatelnosti stanovení. 

Potlačení těchto jevů proto bývá často významnou součástí optimalizace metody. 

2.4.1 Elektroosmóza 

Elektroosmóza se vztahuje k pohybu celého objemu roztoku v kapiláře po vložení 

potenciálového spádu na tuto kapiláru. Po naplnění kapiláry roztokem dochází 

v°závislosti na pH tohoto roztoku k ionizaci funkčních skupin, které jsou vázány na 

vnitřní stěnu kapiláry. V kapilární izotachoforéze se používají především teflonové, 

v některých případně potahované křemenné kapiláry. Podstatu elektroosmózy 

vysvětlíme nejlépe na křemenné kapiláře, která má na svém povrchu vázány 



silanolové skupiny. Tyto se chovají jako středně silná kyselina, a ionizují podle 

schématu 

− + 

Si −OH ↔Si − O + H 

Znamená to, že vnitřní stěna kapiláry naplněné 

vodným roztokem elektrolytu nese negativní 

náboj. Tento náboj je kompenzován kationty 

přítomnými v roztoku, které jsou elektrostaticky 

přitahovány ke stěně kapiláry. 

Obrázek 8 

Schéma 19 disociace silanolových skupin na vnitřní 

straně křemenné kapiláry. 

stěna 

kapiláry 

- ---------- 

Ψ δ 

Ψ 0 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

ζ 

+ 

+ + 

+ 

+ 

+ 

+ + 

+ 

roztok 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

+ 

difusní vrstva 

pohyblivá vrstva 

Sternova vrstva 

vzdálenost 

-Si- 

-Si- 

-Si- 

-Si- 

-Si- 

(rovnice 54). 

stěna kapiláry roztok elektrolytu 


O - 

O - 

O - 

O - 

O - 

H + 

K SiOH 

H + 

H + 

H + 

H + 

H + 

Vytváří se tak elektrická dvojvrstva, 

jejíž vnitřní část tvoří kationty pevněji 

elektrostaticky vázané na stěnu 

kapiláry a vzniká tzv. Sternova vrstva. 

Vnější část elektrické dvojvrstvy, 

kterou tvoří kationty slaběji vázáné a 

difúzně vyměňované s roztokem 

představuje tzv. difúzní vrstvu. 

Obrázek 9 

Představa elektrické dvojvrstvy v 

křemenné kapiláře podle Sterna. 

Kompaktní Sternova vrstva, přes kterou 

klesá potenciál od hodnoty ψ0 po ψδ, je v 

rovnováze s difúzní vrstvou, přes kterou 

klesá potenciál od hodnoty ψδ k nule. 

Po vložení napětí na kapiláru


prochází roztokem elektrolytu elektrický proud a současně dochází k 

hydrodynamickému toku kapaliny v kapiláře, v našem případě směrem ke katodě. 

Rychlost toku kapaliny v kapiláře vEOF lze určit pomocí tzv. Smoluchowského rovnice 

vEOF E =−εζ 

η 

(rovnice 55), 

kde ε je permitivita roztoku, ζ tzv. elektrokinetický potenciál (zeta-potenciál), který 

vyjadřuje potenciál mezi vnitřním roztokem a rovinou oddělující vnitřní a vnější část 

elektrické dvouvrstvy a η představuje viskozitu roztoku. Analogicky se vztahem pro 

rychlost pohybu iontů v elektrickém poli lze zavést veličinu elektroosmotická 

pohyblivost mEOF, definovanou jako 

m EOF 

εζ 

= − 

η 

(rovnice 56). 

Zeta-potenciál je nejen závislý na pH roztoku, ale i na jeho iontové síle. Tato 

závislost může být popsána vztahem 

m EOF = 

k 

µ 

(rovnice 57), 

kde k je konstanta. Elektroosmotický tok, jak je tento hydrodynamický tok nazýván, 

má v otevřené kapiláře pístový profil a v uzavřených systémech, ve kterých je 

kapilára uzavřena polopropustnou membránou, dochází ke vzniku hydrodynamické 

smyčky. 

Obrázek 10 

Hydrodynamický tok způsobený 

elektroosmózou v uzavřené kapiláře – vznik 

hydrodynamické smyčky. 



Fenomén elektroosmotického toku je v°kapilární izotachoforéze potlačován. Naopak 

v kapilární elektroforéze je často využíván při optimalizaci analýz (ovlivnění rychlosti 

stanovení a rozlišení). V CITP je nutné elektroosmózu redukovat vzhledem k tomu, 

že jejím vlivem dochází k deformaci izotachoforetických zón, jak je znázorněno na 

Obrázku 11. Elektroosomotický tok má při CITP negativní vliv v tom směru, že 

způsobuje deformaci rozhraní mezi zónami a tím jeho rozostření. Tento negativní vliv 

je markatnější při anionické analýze, jak je patrné z obrázku. Redukovat 

elektroosmózu lze buď zvýšením viskozity roztoku přídavkem vhodného aditiva 

(různé deriváty celulóz), či snížením elektrokinetického potenciálu přídavkem 

neionogenního smáčedla (PVA, PEG, Triton), nebo modifikací vnitřního povrchu 

1 

2 

2 

kapiláry (coating = potahování). 

Obrázek 11 

Deformace rozhraní mezi zónami vlivem 

elektroosmózy při aniontové (1) a při kationtové (2) 

izotachoforetické analýze (L je vedoucí ion, T je 

zakončující ion a A je ion analytu). 

Elektroosomotiocký tok závisí na druhu materiálu, 

ze kterého je vyrobena separační kapilára, a na 

pH elektrolytu. Na Obrázku 12 je tato závislost 

demonstrována. V kyselé oblasti je elektroosmotický tok minimální a se zvyšujícím se 

pH roste. Jak je z obrázku zřejmé, platí tato závislost pro všechny uvedené materiály. 

Obrázek 12 

1 

Závislost elektroosmotického toku druhu materiálu 

kapiláry a pH elektrolytu 20 

Například pro teflon, který je běžně používaný na 

výrobu kapilár pro CITP, je velikost 

elektroosmotického toku v oblasti pH 3 až 6 

srovnatelná s křemennou kapilárou. Ve skleněné 



kapiláře (pyrex) je elektroosmotický tok výrazně větší než ve výše uvedených 

materiálech a jeho závislost na pH není tak strmá. 

2.4.2 Joulovo teplo 

Průchodem elektrického proudu roztokem dochází k produkci Joulova tepla a tím 

k°ohřevu roztoku v kapiláře. Joulovo teplo P produkované jednotkovým objemem za 

sekundu lze vyjádřit jako 

2 

P EI I 

= = 

S κS 

2 

(rovnice 58). 

Joulovým teplem se zvyšuje teplota uvnitř kapiláry, což způsobuje změny všech 

veličin závislých na teplotě (aktuální pohyblivosti, ionizační rovnováhy) a navíc může 

působit i destrukci termolabilních látek. Vliv nežádoucího ohřevu se proto omezuje 

odvodem vznikajícího tepla termostatováním, případně se pracuje za takových 

podmínek, kdy je produkce Joulova tepla únosná z hlediska vlivu na kvalitu 

separace. Pro střední teplotu zóny T platí, že 

T = T0 

+ q ⋅ E ⋅ I 

(rovnice 59), 

kde je termostatovací teplota. Maximální pracovní proud lze odhadnout ze 

vztahu 

I 

max 

T0 I max 

= 

( 

T 

max 

T − 

0 

q 

) 

T S ⋅ ⋅κ 

(rovnice 60), 

kde T max je nejvyšší přípustná střední teplota zóny, κ T je měrná vodivost zóny 

s nejvyšší teplotou (tj. zóny zakončujícího iontu) a S je průřez kapiláry. Uvedený 

vztah platí za předpokladu, že kvocient q je konstantní po celé délce kapiláry (tj. 

stejně účinné temperování podél kapiláry). Kvocient q se pro konkrétní zařízení 

stanovuje experimentálně. Pro různé termostatovací teploty se měří procházející 



proud kapilárou (naplněnou vhodným elektrolytem, např. 0,1 mol l -1 KCl) v závislosti 

na vloženém napětí. Kvocient q , který vyjadřuje účinnost chlazení 

izotachoforetického aparátu, se určí ze závislosti vodivosti na elektrickém výkonu 

vztaženým na jednotkovou délku pro různé termostatovací teploty. V případě 

ideálního termostatování by střední teplota zóny byla rovna termostatovací teplotě a 

kvocient q by byl roven nule. Boček 21 nalezl pro izotachoforetický analyzátor LKB 

2127 Tachophor s teflonovou kapilárou o vnitřním průměru 0,8 mm hodnotu q = 1,36 

K.m.W -1 . Dále experimentálně ukázal, že rozdíl mezi teplotou zóny ve středu kapiláry 

a na vnitřní stěně činí 0,44 K (pro běžné analytické podmínky). Tento rozdíl teplot je 

asi 10x nižší než rozdíl mezi teplotou uvnitř kapiláry a okolní, tj. termostatovací 

teplotou. Takže s přihlédnutím k rovnici (16) plyne, že tento radiální gradient teploty 

způsobí zanedbatelné (asi 1 %) rozdíly v pohyblivosti iontů silných elektrolytů 

v radiálním směru. Na druhé straně však zvýšení střední teploty elektrolytu vzhledem 

k okolí zanedbáno být nemůže, neboť ovlivňuje kvalitativní vyhodnocení (viz kapitola 

3.2). 

Skoková změna tepelné vodivosti stěny kapiláry (např. rozhraní různých materiálů – 

teflon/organické sklo) má za následek rozdílný tepelný tok v daném místě, který 

způsobuje zředění nebo zakoncentrování elektrolytu 22 . Závažnější dopad na 

praktickou analýzu má axiální gradient teploty. Tento rozdíl teplot pramení jednak 

z principu kapilární izotachoforézy (viz kapitola 2.1.4) a dále z tepelného toku podél 

kapiláry. Od vedoucího elektrolytu směrem k zakončujícímu roste gradient 

elektrického potenciálu a tedy roste i produkované teplo v zónách, a tím i teplota zón. 

Příliš velké teplotní rozdíly v zónách často způsobují potíže při kvalitativním 

vyhodnocení izotachoforegramu, zvláště u krátkých zón. 

Jestliže totiž mezi zónou vedoucího a koncového iontu putuje krátká zóna analytu, 

pak její teplota bude ovlivněna teplotou vedoucího a koncové zóny a nebude 

odpovídat ustálené teplotě, jakou by měla dostatečně dlouhá zóna. Například podél 

zóny bromičnanu dlouhé 10 mm, putující mezi bromidem (5 mmol l -1 ) a jodičnanem 

při hnacím proudu 350 µA (kapilára vnitřního průměru 0,8 mm) je teplotní gradient 4 

K, což způsobuje 10 % rozdíl v pohyblivosti bromičnanu uvnitř jeho vlastní 



zóny.Tento axiální gradient způsobuje to, že se jedna látka může jevit jako zóny 

různých látek nebo je zóna obtížně detegovatelná. Pro identifikaci je proto potřeba 

pracovat za podmínek, kdy jsou zóny dostatečně dlouhé nebo kdy lze axiální 

gradient teploty vlivem Jouleova ohřevu zanedbat. 

Druhou příčinou vzniku axiálního teplotního gradientu je, jak teoreticky i 

experimentálně ukázal Gaš, různá teplotní závislost převodových čísel iontu, 

případně koiiontu a protiiontu. 

odezva detektoru (V) 

odezva detektoru (V) 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

100 µ A EACA 

+ 

NH4 700 720 740 760 780 800 

čas (s) 

100 µ A 

+ 

NH4 Obrázek 13 

1 

2 

3 

700 720 740 760 780 800 

čas (s) 

4 

EACA 

A 

B 

200 µ A EACA 

+ 

NH4 340 360 380 400 420 

čas (s) 

200 µ A 

+ 

NH4 340 360 380 400 420 

čas (s) 


1 

4 

2 

? 

3 

EACA 

Vliv axiálních tepelných efektů na ITP analýzu (separace směsi 4 kationtů o koncentraci 100 

µmol/l při různém hnacím proudu); vedoucí elektrolyt: 10 mM-NH4OH + 20 mM-MES; 

zakončující elektrolyt: 10 mM-EACA + 5 mM-HAc; kapilára dlouhá 90 mm o vnitřním 

průměru 0,8 mm I.D. 23 ; A – rozhraní elektrolytů, B –standard 100 µmol/l


Tyto faktory způsobují oscilace koncentrace na rozhraní zón. Praktický dopad 

axiálního tepelného toku dokumentuje Obrázek 13. Je zde uvedena kationická 

analýza směsi 1-methyl-histidinu (1), histidinu (2), 3-methyl-histidinu (3) a kreatininu 

(4). Na izotachoforegramu rozhraní elektrolytů (A) jsou při hnacím proudu 200 µA 

jasně zřetelné oscilace koncentrace na rozdíl od záznamu při proudu polovičním. 

V případě analýzy standardů (B) jsou při hnacím proudu 100 µA zřetelně čitelné 

všechny vlny a jsou viditelné určité náznaky koncentračních oscilací rozhraní mezi 

kreatininem a koncovým kationtem. Zvýšení hnacího proudu na dvojnásobek má za 

následek: 

a) deformaci zóny kreatininu do té míry, že již není na izotachoforegramu čitelná 

b) zřetelný výskyt koncentračních oscilací na rozhraní mezi kreatininem a koncovým 

kationtem 

Díky menšímu gradientu teploty mezi předním a zadním okrajem zón pohyblivějších 

kationtů (1-MH, HIS a 3-MH) a tedy i nižšímu tepelnému toku podél zón jsou jejich 

vlny zřetelné i při vyšším hnacím proudu. 

Pro potřeby analytické kapilární izotachoforézy se dají zformulovat některé závěry, 

které souvisí s tepelnými efekty: 

- pro kapiláru daného vnitřního průměru a daný operační systém elektrolytů 

existuje optimální hodnota hnacího proudu, která je kompromisem mezi snahou 

po rychlém rozlišení komponent na jedné straně a snahou po minimalizaci 

tepelných efektů v kapiláře 

- vnitřní průměr kapiláry, když se nevyžaduje větší separační výkon, by měl být 

minimalizovaný 

- použití zředěnějšího vedoucího elektrolytu dovoluje v té samé kapiláře aplikovat 

relativně větší proudové hustoty (větší rychlost migrace) 

- teplotní rozdíl roztoku v ose kapiláry a při její stěně při dané geometrii kapiláry je 

nezávislý na teplotě termostatu 

2.4.3 Vliv gravitace a difúze 

Separační kapilára může být orientována vertikálně nebo horizontálně. Při 

vertikálním uspořádání musíme zamezit, aby případný rozdíl hustot elektrolytů 



nevyvolal deformaci rozhraní zón vlivem gravitace. Toto nebezpečí existuje v případě 

směsných nebo organických rozpouštědel použitých na přípravu elektrolytů a hlavně 

na rozhraní vedoucí elektrolyt-vzorek-zakončující elektrolyt. Musíme dbát na to, aby 

platilo: 

ρ ≤ ρ ≤ ρ 

TE 

Vz 

LE 

(rovnice 61). 

Je-li hustota koncového elektrolytu (TE) větší než vedoucího, pak se TE „propadá“ 

(tj. proudí středem kapiláry) do vedoucího elektrolytu a analýza je znehodnocena. 

Obdobně to platí i o vzorku. Při horizontálním uspořádání toto nebezpečí nehrozí, 

avšak při velkém rozdílu hustot vzorku a elektrolytů (např. při analýze 

koncentrovaného roztoku cukru) může zóna vzorku pronikat do okolních zón po dně 

kapiláry. 

Při neideálním chlazení se v zónách objevují hustotní nehomogenity a vlivem 

gravitačního působení dochází k proudění elektrolytu, které může zdeformovat 

rozhraní zón. Tyto efekty se však v kapilárním uspořádání nijak výrazně neprojevují. 

Na rozhraní mezi izotachoforetickými zónami se koncentrace látek mění skokem: ve 

svých vlastních zónách mají látky adjustované koncentrace, v sousedních zónách 

koncentraci nulovou. Výsledkem tohoto stavu je difúzní tok ve směru klesající 

koncentrace. Proti vzniklému difúzního toku působí tzv. samozaostřující efekt. Účinek 

tohoto efektu si můžeme kvalitativně vysvětlit následovně: když se ion o určité 

efektivní pohyblivosti dostane v důsledku difúze do předcházející zóny, poklesne 

rychlost jeho migrace, protože intenzita elektrického pole je v této zóně nižší (zóna 

pohyblivější komponenty viz rovnice (31). Pokles rychlosti migrace má za následek 

návrat iontu do příslušné zóny. Analogicky, když ion difunduje do zóny komponenty o 

nižší efektivní pohyblivosti, vyšší intenzita elektrického pole v této zóně zrychlí jeho 

migraci a ion se vrátí do vlastní zóny. Jako výsledek obou protichůdně působících 

dějů má rozhraní mezi izotachoforetickými zónami reálný podélný rozměr nazývaný 

šířka rozhraní. Analýzou rovnic popisujících jednorozměrně dělící proces 

v izotachoforéze Moore došel k závěru, že šířka rozhraní je za obvyklých 

experimentálních podmínek asi 0,01 mm. Šířku rozhraní je možné ovlivnit řadou 



faktorů, např. koncentrací elektrolytů, hnacím proudem aj. U zón dostatečně 

dlouhých můžeme šířku rozhraní zanedbat. Avšak při kvantitativním vyhodnocení 

velmi krátkých zón je šířka rozhraní hlavním zdrojem nepřesností. Pro kapiláru 

vnitřního průměru 0,3 mm je objem hraniční vrstvy odvozený z Mooreových dat cca 

700 pl, což při 10 -2 až 10 -3 M koncentrací představuje látková množství 0,5 až 5 

pmol. Podle koncentrace látky v zóně (za ustáleného stavu) uvedené množství 

představují absolutní detekční limit ideální univerzální detekce pro výše uvedený 

vnitřní průměr kapiláry. 

2.4.4 Vliv čistoty a složení elektrolytů 

Analytická izotachoforéza vyžaduje vysokou čistotu všech chemikálií, z nichž se 

skládá operační systém elektrolytů (včetně rozpouštědel). Vysoké požadavky jsou 

kladeny především na čistotu zakončujícího elektrolytu, jehož objem v rezervoáru (viz 

Obrázek 34) mnohonásobně převažuje objem separačního prostoru. 

Obsahuje-li koncový elektrolyt nečistotu vyšší efektivní pohyblivosti, než má 

zakončující ion (a to i ve velmi malé koncentraci), dochází k její pronikání do zón 

vzorku mechanismem pohyblivého rozhraní. Nečistota, podle své efektivní 

pohyblivosti, začne v některém místě separační kaskády vytvářet vlastní zónu. 

Všechny zóny se před jejím předním rozhraním separují izotachoforeticky, všechny 

zóny za zónou nečistoty jsou směsnými zónami s nečistotou a jejich vyhodnocení je 

zatíženo pozitivní chybou (koncentrace adaptovaná regulační funkcí se skládá 

z příspěvku dané složky a nečistoty). V průběhu analýzy se zóna nečistoty postupně 

prodlužuje. Je-li pohyblivost nečistoty značně větší než pohyblivost koncového iontu, 

dochází k rychlému vyčištění koncového elektrolytu a po několika analýzách 

nečistota z rezervoáru prakticky vymizí. Tento „samočistící“ efekt se v praxi často 

využívá k přečištění koncového elektrolytu. Je-li pohyblivost nečistoty jen o málo 

větší než pohyblivost zakončujícího iontu, koncový elektrolyt se čistí pomalu a 

můžeme ho pak použít jen pro stanovení iontů s pohyblivostí vyšší, než je 

pohyblivost nečistoty. Nečistoty z koncového elektrolytu poznáme tak, že se jejich 

zóny při opakované analýze zkracují. 



Obsahuje-li vedoucí elektrolyt méně pohyblivou nečistotu než vedoucí ion, tvoří 

směsné zóny všechny ionty pohyblivější než nečistota. Nečistoty ve vedoucím 

elektrolytu vedou k reprodukovatelným nadbytečným zónám při opakovaném 

pokusu. Vedoucí elektrolyt s větším obsahem nečistot prostě nelze použít. 

Požadavky na čistotu chemikálií pro přípravu vedoucího elektrolytu jsou méně 

přísné, protože se nečistoty koncentrují jen z relativně malého objemu separační 

kapiláry. Jiná situace je ovšem u látek použitých jako zdroj protiiontu, které nesmí 

obsahovat žádné nečistoty poskytující koprotiionty. Ve vzorku se mohou objevit 

nečistoty pohyblivější než vedoucí nebo méně pohyblivé než zakončující ion. 

Pronikají pak do obou elektrolytů, pohybují se zde mechanismem zónové 

elektroforézy, nelze je izotachoforeticky stanovit, ale separaci ostatních složek 

vzorku neruší. Tohoto jevu se využívá k eliminaci předchozích dlouhých zón (těch, 

které nás nezajímají) volbou méně pohyblivého vedoucího iontu. 

Posledním důležitým aspektem, který vždy musíme uvážit před separací, jsou změny 

ve složení elektrolytů při opakovaných analýzách. To se týká hlavně rezervoáru 

vedoucího elektrolytu (viz Obrázek 34), v němž dochází ke změnám koncentrace 

vedoucího iontu, protiiontu a změnám pH. Vzhledem k tomu, že změny koncentrace 

vedoucího iontu mohou vést prostřednictvím Kohlrauschovy regulační funkce ke 

změnám zón a změny pH vedoucího elektrolytu ke změnám vodivostí zón slabých 

elektrolytů, musíme zjistit, kolik pokusů můžeme provést bez výměny vedoucího 

elektrolytu v rezervoáru. V následující tabulce jsou uvedeny změny ve složení a pH 

vedoucího elektrolytu v rezervoáru v závislosti na počtu provedených analýz. 

Výsledek ukazuje, že změny ve složení elektrolytu HCl/BALA jsou významné po 

zhruba 20 analýzách a změna pHLE v rezervoáru může vyvolat změnu v efektivní 

pohyblivosti složek. Zejména v citlivých případech slabých elektrolytů může zapříčinit 

změnu pořadí separovaných zón i při použití ideálně pufrujícího vedoucího 

elektrolytu. Daleko výrazněji se však projeví změna ve složení elektrolytu při práci 

s vedoucím elektrolytem, jehož pH není v oblasti maximální pufrační kapacity 

protiiontu (tedy pHLE ≠ pKP), jak dokumentují údaje v TABULCE 4 B, kdy je rozdíl 



(pokles j ) pH vedoucího elektrolytu v nádobce již po páté analýze téměř 0,5 jednotky 

pH. 

TABULKA 4 

Vliv počtu analýz na složení a pH vedoucího elektrolytu v nádobce o objemu 5 ml; počítáno 

pro vedoucí elektrolyt o složení (A) 10 mM-HCl + 20 mM-BALA (pHLE ≈ pKBALA=3,55); (B) 

10 mM-HCl + 5.5 mM-BTP, pH 6,2 a analýzu trvající 10 min při hnacím proudu 100 µA 

m = - 80.10 -5 cm 2 V -1 s -1 a m + = 40.10 -5 cm 2 V -1 s -1 , m + = 

(výpočty provedeny pro − 

Cl 

20.10 -5 cm 2 V -1 s -1 , m + + = 40.10 -5 cm 2 V -1 s -1 ) 

A 

BTP 

Počet analýz cBALA + (mM) cBALA + (mM) cCl - (mM) pHLE 

0 10 10 10 3,55 

10 9,45 10,82 10,82 3,49 

20 7,59 11,61 11,61 3,37 

30 6,31 12,46 12,46 3,26 

B 

Počet analýz cBTP + (mM) cBTP ++ (mM) cCl - (mM) pHLE 

0 0,92 4,58 10 6,10 

1 0,81 4,74 10,07 6,03 

5 0,37 5,38 10,70 5,64 

8 0,04 5,86 10,56 4,63 

K velké změně složení elektrolytu dochází též při použití pohyblivějšího koprotiiontu 

v malé koncentraci, který opouští rezervoár rychleji než pufrující protiion. V některých 

případech je nutno vyměnit obsah rezervoáru i po každé analýze. 

j u kationické analýzy jde analogicky o vzestup pH 


BALA 

BTP

Izotachoforetická analýza 

3. Izotachoforetická analýza 

Izotachoforetickou analýzou v užším slova smyslu nazýváme tu část analýzy, která 

zahrnuje nástřik vzorku, separaci a detekci. Po nástřiku vzorku se analyzované ionty 

pohybují v elektrickém poli, nejdříve se separují a poté jsou výsledné separované 

izotachoforetické zóny detegovány. Cílem separačního kroku je úplná vzájemná 

separace všech sledovaných složek vzorku tak, že jsou vytvořeny izotachoforetické 

zóny individuálních látek. Cílem druhého kroku je detekce analyzovaných látek, 

přičemž záznam detekčního signálu musí být dobře kvantitativně a kvalitativně 

vyhodnotitelný. Z parametrů, které charakterizují metodu v užším slova smyslu, jsou 

nejvýznamnější rychlost, citlivost a přesnost analýzy. Obecně je výhodné, lze-li 

uskutečnit separaci i detekci v co nejkratším čase a s minimálním množstvím vzorku. 

V praxi to znamená, že je snahou pracovat s takovým množstvím vzorku, které právě 

ještě postačuje pro dosažení požadované přesnosti analýzy. Rychlost dosažení 

úplné separace je závislá na mnoha pracovních podmínkách, jako např. složení 

vedoucího elektrolytu, použité hodnotě hnacího proudu atd. Důležité je, že sem patří 

i dávkované množství vzorku k analýze, čímž spolu souvisí separace a detekce. 

Tomuto problému je věnována následující část. 

3.1 Rozlišení, separační účinnost, separační kapacita 

Přístup teoretiků k popisu migrace iontů v elektrickém poli je v zásadě orientován 

dvěma směry. První vychází ze základních zákonů popisující transport hmoty, 

chemické rovnováhy a elektroneutralitu. Z nich pak vyvozuje závěry, které jsou 

využitelné pro konkrétní aplikace. Matematický model izotachoforézy (viz kapitola 

2.3) vychází z ustáleného stavu. Druhý směr představuje řešení základních zákonů 

od „počátku“, tj. řeší dynamiku izotachoforetické separace od startu analýzy až po 

dosažení ustáleného stavu. Tento přístup vede k nutnosti řešení parciálních 

diferenciálních a nelineárních rovnic. Ve většině případů nemají tyto rovnice 

analytické řešení, a tudíž jsou řešeny numerickými metodami s využitím počítačů, 

přičemž výsledky jsou získány v numerické i grafické formě. Do první skupiny lze 



zařadit práce Kohlrausche, Everaertse, Beckerse 24 , Bočka 25 , Hirokawi 16 a 

Mikkerse 26 a jiných. Do druhé skupiny patří práce Biera 27 , Gaše 28 a dalších. V této 

kapitole budou zmíněny základní pojmy a vztahy využitelné pro odhad separačního 

výkonu potřebného pro dělení směsi iontů. Obsáhleji se touto problematikou zabývají 

práce 25, 26, 29 . 

Separační kritérium 

Dvě ionogenní látky A a B se budou izotachoforeticky separovat tehdy, jestliže 

rychlosti jejich migrace ve směsné zóně budou odlišné, tzn. že podle (rovnice 1) 

musí být efektivní pohyblivosti ve směsné zóně rozdílné: 

m 

m 

A 

B 

≠ 1 

(rovnice 62). 

Uvažujeme-li o jednosytných slabých kyselinách, pak dvojice látek A, B nebude 

separovatelná, jestliže pH ve směsné zóně bude k 

pH 

mix 

= pK 

Obrázek 14 

HB 

Možná migrační 

pořadí dvou 

⎛ m 

⎜1 

− 

⎜ m 

+ log 

⎜ m 

⎜ 

⎝ m 

HA 

HB 

HB 

HA 

⋅ K 

⋅ K 

− 1 

HB 

HA 

⎞ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎠ 

B 

(rovnice 63). 

Je-li KA>KB platí pro jakékoliv pH 

Je-li KApHmix 

aniontů A, B A,B 

A,B Je-li KAmB 

k analogicky platí pro kationty – viz (rovnice 92). 

A 

A 

B 

Je-li KA


Když má pohyblivější z této dvojice současně i vyšší disociační konstantu, mluvíme o 

„přímém páru“ separovaných složek. Jestliže má naopak nižší hodnotu disociační 

konstanty, jedná se o „obrácený pár“. V prvním případě nezávisí separační 

konfigurace (pořadí zón v ustáleném stavu) na pH, při kterém provádíme analýzu, 

zatímco v druhém případě ano. Schématicky jsou tyto možnosti znázorněny na 

Obrázku 14. Analogické vztahy lze odvodit pro separaci kationtů. 

Rozlišení 

Když je splněno separační kritérium, stává se významnou veličinou čas, který je 

potřebný pro dosažení úplné separace složky ze vzorku. V případě, že zóna dané 

složky obsahuje celé nadávkované množství, hovoříme, že složka je rozlišená. 

Rozlišení Ri definujeme jako poměr vyděleného množství i-té složky do vlastní zóny 

ku nadávkovanému množství 

Ri = (separované množství složky i)/(dávkované množství složky i) 

(rovnice 64) 

Rozlišení tedy roste v průběhu separace od 0 (nerozlišená složka) do 1 (úplně 

rozlišená složka). Úplné rozdělení vzorku je dosaženo tehdy, když pro všechny 

složky je Ri = 1. Snahou je, aby bylo dosaženo rozlišení v nejkratším čase, tedy 

maximalizovat rychlost změny rozlišení ∂ Ri / ∂t 

. Rozlišení i jeho derivace podle času 

jsou komplexní funkcí vlastností separovaných látek a sil určujících jejich efektivní 

pohyblivost. Výpočet je komplikovaný a vyžaduje velkou výpočetní kapacitu. Při 

praktické izotachoforetické analýze je nejčastěji využívaným optimalizačním 

parametrem pH, případně komplexační či asociační rovnováhy, použití nevodných 

rozpouštědel a další (viz kapitola 4.3). Optimalizace by měla vést k maximalizaci 

nebo minimalizaci l poměru m migračních rychlostí látek (viz rovnice (62)). Například 

při separacích slabých kyselin obecně platí, že čím nižší pH, tím lepší poměr 

pohyblivostí a při separaci slabých bází je tomu naopak. 

l podle migračního pořadí 

m při volné elektroforéze jde o maximalizaci rozdílu migračních rychlostí 


Separační proces 


Vzorky, které jsou analyzovány izotachoforézou, obsahují obvykle větší počet složek. 

Fenomenologický popis separace vícesložkové směsi je však málo přehledný. Lze 

provést takové zjednodušení, že vybereme dvojici složek, která se separuje 

nejobtížněji. Tím si problém separace vícesložkového vzorku redukujeme na problém 

separace vybrané dvojice látek; přítomnost ostatních složek vzorku i jejich vliv na 

separaci této dvojice zanedbáváme. 

t0 

t1 

t2 

t3 

t4 

t5 tres 

t6 

rezervoár 

koncového 

elektrolytu 

L 

A*B* 

Obrázek 15 

xdet 

dávkovač Separační kapilára 

T 

T* 

B* A 

Schéma separace směsi dvou aniontů A, B. Na počátku separace v čase t0 je dávkovač 

naplněn směsí aniontů A a B. Separační kapilára a rezervoár pro vedoucí elektrolyt jsou 

naplněny elektrolytem obsahující vedoucí anion L a rezervoár zakončujícího elektrolytu 

elektrolytem se zakončujícím aniontem T. Protiion C zajišťující elektroneutralitu je společný 

pro oba anionty vzorku, vedoucí i zakončující elektrolyt. Změny elektrolytů v rezervoárech 

vlivem elektrolýzy, teplotní a aktivitní vlivy jsou zanedbány. 


xres 

A 

T** 

B 

tdet


Celý proces separace znázorníme na příkladu dělení modelových aniontů slabých 

jednosytných kyselin A a B, které probíhá v kapiláře o konstantním průřezu a 

konstantní koncentraci vedoucího elektrolytu (Obrázek 15). Vedoucím aniontem L je 

anion silné kyseliny, protiiontem C, společným pro všechny separované anionty, je 

slabá jednosytná báze a zakončujícím aniontem T je slabá jednosytná pomalá 

kyselina. Každá oblast (zakončujícího elektrolytu označená dvěma hvězdičkami, 

vzorku označená jednou hvězdičkou a separační kapiláry a rezervoáru vedoucího 

elektrolytu bez hvězdičky) je charakterizovaná svou vlastní regulační ω-funkcí (viz 

kapitola 2.1.4). Od startu analýzy probíhá separace vzorku podle principu 

pohyblivého rozhraní. Všechny charakteristiky zón (koncentrace, pH, vodivost) jsou 

po dobu existence zóny konstantní. V různých časech analýzy (t1 až t5) se vyskytuje 

několik pohyblivých rozhraní A/L, AB/A, B/AB, B/A, T/B, B*/AB*, T*/B*. Rychlost 

pohybu rozhraní je dána lokálními podmínkami. V dávkovači vzorku existují 

stacionární rozhraní AB*/AB, B*/B, T*/T a T**/T*. V čase t3 vzorek opouští dávkovač 

a od tohoto času je celková délka zón konstantní. Vlastnosti směsné zóny 

v separační části jsou dané místní regulační ω-funkcí a povahou vzorku. V čase t5 

(=tres) je dosaženo úplné separace a od tohoto momentu je individuální délka zón 

konstantní. Rozlišení bylo dosaženo v čase tres a délka kapiláry potřebná pro 

rozlišení xres. Detekce zón může začít v čase tdet a detektor může být umístěn na 

kapiláře v místě xdet. Jak již bylo uvedeno, při optimalizaci separačního procesu má 

klíčovou úlohu pH směsné zóny. Mikkers odvodil pro výpočet pH směsné zóny 

kvadratickou rovnici, přičemž pouze jeden kořen má fyzikální význam 

a ⋅ 

10 2⋅ 

pH 

+ b ⋅10 

pH 

+ c = 0 

(rovnice 65). 

Konstanty rovnice jsou pro dvojici slabých jednosytných aniontů a kationtů uvedeny 

v následující tabulce. Po výpočtu pH směsné zóny se za použití rovnic uvedených 

v citované práci Mikkerse počítají všechny charakteristiky separace, jak bude dále 

uvedeno. Ustálený stav je možné simulovat dosazením nuly nebo nekonečna za 

dávkovací poměr ϕ . Techniku pohyblivého rozhraní lze simulovat tak, že se při 

výpočtech kalkuluje s nástřikem velkého množství vzorku. 


TABULKA 5 


Konstanty kvadratické rovnice pro výpočet pH směsné zóny; ϕ je dávkovací poměr 

M 

cB 

definovaný vztahem ϕ = M 

c A 

mi 

, ri je relativní pohyblivost i-té složky definovaná r i = a ki je 

mL 

− rC 

redukovaná pohyblivost daná vztahem ki 

= 

r − r 

1 

. 

b = 

i 

Anionty Kationty 


C 

− pKC 

a = 10 ⋅ ( 1 + ϕ ) 

⎟ ⎞ 

⎞ 

−pK 

⎛ 1+ 

ρ 

−pK 

⎛ 

⎟ 

1+ 

ρ 

A 

B 

a = 10 ⋅ 

⎜ −1 

+ ⋅ ⋅ 

⎜ 

⎟ 

ϕ 10 −1 

⎝rA 

⋅kA 

⎠ ⎝rB 

⋅kB 

⎠ 

⎛ 

( ) ⎜ 1 + ρ ⋅ + ⎟ b = 1 + ρ) 

⎝ r 

A 

1 

⋅ k 

A 

ϕ 

r ⋅ k 

⎞ 

⎞ 

pK ⎛ 1+ 

ρ 

pK ⎛ 1+ 

ρ 

A 

⎟ 

B 

c = 10 ⋅ − + ⋅ ⋅ − ⎟ 

⎜ 1 

⎜ 

⎟ 

ϕ 10 

1 

⎟ 

⎝ rA 

⋅ k A ⎠ ⎝ rB 

⋅ kB 

⎠ 

Separační doba, detekční doba a separační kapacita 

B 

B 

⎞ 

⎟ 

⎠ 

( ⎜ ⎛ 

⋅ 

⎝ r 

A 

1 

⋅ k 

A 

ϕ 

+ 

r ⋅ k 

= 10 ⋅ ( 1 + ϕ ) 

C pK 

c 

Z Obrázku 15 je zřejmé, že čas potřebný na rozlišení složky A může být vyjádřený 

jako funkce rychlosti rozhraní vL/A a vA/A+B podle vztahu 

t 

res 

= 

v 

L / A 

l 

A 

− v 

A / A+ 

B 

takže po vhodných substitucích a úpravách získáme 

⎛ k ⎞ A ⎜1 

+ ϕ ⋅ ⎟ 

n 

⎟ ⎛ 

A ⋅ F ⎜ kB 

r 

t = ⋅ ⎟ ⋅⎜ 

res ⎜ ⎜ 

1− 

M 

I α B rB 

⎟ ⎝ r 

⎜ 

⎜1 

− M ⎟ 

⎝ α A rA 

⎠ 

C 

A 

⎞ 

⎟ 

⎠ 

B 

B 

⎞ 

⎟ 

⎠ 

(rovnice 66), 

(rovnice 67). 

Rovnici je možné dále upravit na tvar umožňující výpočet délky separační kapiláry 

potřebné pro dosažení úplného rozlišení dvojice A a B


x 

res 

⎛ k 

⎜1 

+ ϕ ⋅ 

nA 

⋅ F ⎜ k 

= ⋅ 

⋅ ⎜ M 

O cL 

α B r 

⎜ 

⎜1− 

M 

⎝ α A r 

A 

B 

B 

A 

⎞ 

⎟ 

⎟ ⎛ 

⋅⎜ 

⎟ ⎜ 

⎟ ⎝ k 

⎟ 

⎠ 

A 

1 

⋅r 

A 

⎞ 

⎟ = l 

⎠ 

⎛ k 

⎜1 

+ ϕ ⋅ 

⎜ k 

⋅ 

⎜ M 

α B r 

⎜ 

⎜1 

− M 

⎝ α A r 


A 

A 

B 

B 

A 

⎞ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎠ 

(rovnice 68), 

kde O je průřez separační kapiláry, nA je dávkované množství složky A a cL je 

koncentrace vedoucího iontu ve vedoucím elektrolytu a lA je délka zóny složky A. Pro 

daný elektrolytový a separační systém je xres nezávislé na aplikovaném hnacím 

proudu I, zatímco tres je nepřímo úměrný hnacímu proudu. Z délky potřebné pro 

dosažení separace lze vypočítat separační kapacitu kolony (kapiláry). Z rovnice (67) 

přímo plyne, že pro daný vzorek a separační systém je vydělené množství složky A 

do vlastní zóny dáno vztahem 

n 

separ 

A 

⎛ k 

⎜ + ⋅ 

t ⋅ I ⎜ k 

= 

⎜ M 

F α B r 

⎜ 

⎜1 

− M 

⎝ α A r 

⎞ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎠ 

−1 

A 1 ϕ 

−1 

B 

B 

A 

⎛ r 

⋅⎜ 

⎜ 

1− 

⎝ r 

C 

A 

⎞ 

⎟ 

⎠ 

(rovnice 69). 

Pro efektivní rozlišení složky A a jeho derivaci podle času (rychlost dosažení 

rozlišení) platí vztahy 

t 

R A = a 

t res 

∂RA 

1 

= 

∂t 

t 

res 

(rovnice 70). 

Z rovnice (69) lze odvodit bezrozměrné separační číslo S, jehož výhodou je 

nezávislost na množství vzorku, rozměrech separačního systému a velikosti hnacího 

separ 

proudu. Derivováním separovaného množství n 

podle času a vynásobením F/I 

dostaneme vztah pro separační číslo pro složku A 

A

S 

A 

= 

F 

I 

∂n 

⋅ 

∂t 

A 

⎛ k 

⎜1 

+ ϕ ⋅ 

⎜ k 

= 

⎜ M 

α B r 

⎜ 

⎜1 

− M 

⎝ α A r 

A 

B 

B 

A 

⎞ 

⎟ 

⎟ ⎛ 

⎟ ⋅⎜ 

⎜ 

⎟ ⎝ r 

⎟ 

⎠ 

A 

rA 

− r 

C 

⎞ 

⎟ 

⎠ 


(rovnice 71). 

Fyzikální význam bezrozměrného separačního čísla je ten, že udává účinnost 

separačního procesu a jeho hodnota se pohybuje od 0 do 1. Separační číslo pro 

složku B je vázáno na SA vztahem 

S = χ ⋅ S 

B 

A 

kde χ je molární poměr cB/cA ve vzorku. 

Detekční doba a separační kapacita 

(rovnice 72), 

Z rovnice (68) plyne, že detektor by měl být umístěn ve vzdálenosti xres od místa 

dávkování vzorku. Z Obrázku 15 je však zřejmé, že tomu tak není a detekce může 

začít ještě před dosažením úplného rozlišení. Směsná zóna AB totiž zanikne, než 

dosáhne místa detektoru xdet. Pro minimální vzdálenost umístění detektoru od místa 

dávkování vzorku platí 

x det = t res ⋅ v A / AB 

(rovnice 73), 

kde vA/AB je rychlost pohybu rozhraní mezi zónou čisté složky A a směsné zóny AB. 

Pro čas, kdy detekce musí začít platí 

tdet 

= 

x 

v 

det 

L 

(rovnice 74), 

kde vL je rychlost pohybu vedoucí zóny L. Z těchto vztahů přímo plyne, že doba 

rozlišení bude větší nebo rovna době detekce. Pro poměr doby detekce a rozlišení, 

respektive pro poměr vzdáleností detekce a rozlišení, platí 



x 

x 

det 

res 

t 

= 

t 

det 

res 

k B α 

ϕ ⋅ + 

k A α 

= 

k 

1+ 

ϕ ⋅ 

k 

M 

B 

M 

B 

B 

A 

⋅ r 

⋅ r 

B 

A 

(rovnice 75). 

Pro praktickou analýzu je důležité minimalizovat xdet a tdet postupem obdobným jako 

při optimalizaci rozlišení. Ze vztahu plyne, že pro nízký dávkovací poměr φ a nízký 

poměr pohyblivostí složek může být doba detekce velmi krátká v porovnání s dobou 

rozlišení. Prakticky to znamená, že při analýze směsi obsahující rychlejší složku ve 

velkém přebytku může detekce začít velmi brzy a postačuje tedy krátká separační 

kapilára. Při vysokých dávkovacích poměrech φ je detekční doba blízká době 

rozlišení. Pozice detektoru xdetfix je však pevně daná mechanickými rozměry 

separační části analyzátoru, a proto je účelné určit maximální množství látky A, které 

je možné na daném analyzátoru separovat. Toto množství je dáno vztahem 

n 

max 

A 

= n 

load 

L 

⋅ r 

A 

⋅ k 

A 

M 

α B rB 

1− 

M 

α A r 

⋅ 

kB 

α rB 

ϕ ⋅ + 

k α r 

A 

A 

M 

B 

M 

A 

A 

(rovnice 76), 

load 

kde n je množství vedoucího iontu vyplňujícího separační část od dávkovacího 

L 

místa po detektor. Množství vedoucího iontu souvisí s dobou vstupu první zóny do 

detektoru t 

n 

load 

L 

= x 

detfix nebo se vzdáleností detektoru od dávkovače xdetfix podle vztahu 

det fix 

⋅ O ⋅ c 

L 

L 

= t 

det fix 

⋅ 

F ⋅ 

I 

( 1 − r ) 


C 

(rovnice 77). 

Spojením předchozích dvou rovnic lze vypočítat maximálně separovatelné množství 

jako funkci času nebo geometrických rozměrů separační části analyzátoru. 

Maximální separační kapacita je tedy dosažena při minimální době rozlišení.


Například pro přímý pár složek aniontů plyne, že při nízkém pH operačního systému 

může být dosaženo výrazného zvýšení separační kapacity. 

I když je separační kapacita jenom ilustrativním údajem, je v praxi užívána zejména 

v modifikované verzi, kde mluvíme o daném vzorku a daném objemu, který je možné 

ještě separovat bez překročení separační kapacity pro tento vzorek. Zvětšení 

separačního náboje požadovaného pro úplnou separaci vzorku vede k nároku na 

větší separační kapacitu. Tuto lze zvětšit několika prostředky. Nejjednodušší je cesta 

zvýšení koncentrace vedoucího elektrolytu. Vzhledem k nižší citlivostí detekce je při 

aplikaci tohoto způsobu žádoucí vytvoření koncentrační kaskády (viz kapitola 3.4). 

Nejdéle užívaným postupem je prosté prodloužení kapiláry. Vzhledem k prodlužující 

se době analýzy a nárokům kladeným na zdroj proudu je tento postup vhodný jen u 

nenáročných analýz. 

Technika přídavného objemu je postup, který obdobně jako v předchozím případě 

využívá zvětšení objemu elektrolytu o nezměněné koncentraci, zde však separace 

probíhá v kapiláře o větším průřezu. Na tuto širokou kapiláru navazuje tenčí kapilára 

o původním průřezu, aby byla zachována citlivost detekce. Zvláštním případem je 

dvoukolonová technika, kde na konce širší kapiláry je připojena pomocná elektroda. 

Separační kapacitu lze rovněž zvýšit hydrodynamickým protiproudem vedoucího 

elektrolytu. Elektrolyt teče proti směru izotachoforetické migrace, tím zpomaluje 

rychlost posunu zón, a tak zvětšuje zádrž kolony n . 

Na závěr této kapitoly se ještě zmíním o velmi zajímavé práci 30 profesora Kenndlera 

pojednávající o informační obsažnosti izotachoforézy. Tento autor zjistil, že za 

určitých omezení blízkých reálným podmínkám analýzy, je informační obsažnost 

izotachoforézy 6,7 bitů, což je o 1 bit méně než pro volnou zónovou elektroforézu 

(CZE). Toto, přeloženo do praktických termínů používaných ve zmíněných 

technikách, představuje, že při izotachoforéze je možné maximálně rozlišit mezi 

vedoucím a zakončujícím iontem 2 6,7 (≈ 100) vln, zatímco v CZE je to 2 7,7 (≈ 200 

píků). 

n zádrž kolony se zjistí jako součin hnacího proudu a doby vstupu konce zóny vedoucího iontu do detektoru 



3.2 Kvalitativní analýza 

Izotachoforéza, podobně jako jiné separační analytické metody, není schopna 

poskytnout přímý údaj o kvalitativním složení vzorku. Hovoříme-li v izotachoforéze 

o°kvalitativní analýze, pak máme na mysli kvalitativní analýzu v užším smyslu slova, 

tedy vyloučení či potvrzení identity látky v izotachoforetické zóně obsažené a látky 

předpokládané (standardu), tj. kvalitativní interpretaci izotachoforegramu. Prakticky 

to znamená, že při kvalitativní izotachoforetické analýze budeme vždy vycházet ze 

standardní směsi takového složení, jaké předpokládáme ve vzorku. Vlny 

izotachoforegramu identifikujeme, tj. přiřadíme každé vlně odpovídající standardní 

látku. Potom analyzujeme vzorek a porovnáním izotachoforegramu vzorku a 

izotachoforegramem standardní směsi identifikujeme vlny izotachoforegramu vzorku, 

tj. identifikujeme látky ve vzorku. Mikropreparativním postupem lze sice 

izotachoforeticky separované zóny z kolony vypreparovat a jako izolované látky je 

určit pomocí některé z metod kvalitativní chemické analýzy, ale takovýto postup není 

pro izotachoforézu typický ani běžný. Příkladem může být provedení reakce, která je 

pro danou látku specifická, tj. např. inkubace vzorku s enzymem, pro který je 

analyzovaná látka substrátem, následované analýzou reakčního produktu a 

porovnání s analýzou původního vzorku. Instrumentálně je takový postup náročný a 

znamená zásah do běžné analytické instrumentace. 

V analytické praxi je nejčastěji používaný vodivostní detektor „on-line“ spojený se 

separační částí analyzátoru. Postup vhodný pro kvalitativní analýzu látek z odezvy 

vodivostního, je ilustrován na případu separace dvousložkové směsi (viz Obrázek 

16). Na tomto obrázku je uvedený izotachoforegram získaný pro rozdělenou směs 

neznámé látky X a standardu St. Souřadnice R značí hodnoty měřeného ohmického 

odporu, který je lineární funkcí specifického odporu roztoku nacházejícího se 

v detekční cele. Během analýzy jsou postupně přítomné v detektoru přítomné ionty L 

(vedoucí ion), X a St a ionty T (zakončující ion). 


R 

L 

l X 

X 

h X - hL 

čas 

l St 

St 

h St - hL 

T 

h T - hL 

Obrázek 16 


Izotachoforegram rozdělené dvousložkové 

směsi neznámé látky X a standardu St; R 

je signál detektoru (ohmický odpor), hi je 

výška vln příslušných složek a li je jejich 

délka. 

Pro získání charakteristických údajů o 

látkách (efektivní pohyblivost) za 

daných separačních podmínek je 

vhodné vyjít z poměru signálů, které 

jsou ve vztahu k odpovídajícím 

měrným odporům. 

Pro složky X a St na Obrázku 16 pak platí následující vztahy 

R 

a 

h 

X 

X 

h 

= 

h 

X 

St 

= k ⋅ R 

− h 

− h 

X 

L 

L 

= k ⋅ C ⋅ 

1 

κ 

X 

(rovnice 78) 

(rovnice 79), 

kde RX je relativní výška vlny X vzhledem ke zvolené standardní látce St, hX je výška 

vlny na izotachoforegramu, C je odporová konstanta detekční cely, κX je specifická 

vodivost zóny X a k je konstanta. Jestliže předpokládáme, že odporová konstanta 

detekční cely je během pokusu konstantní, můžeme psát 



RX 

= 

( ) ( ) 

( ) ( ) 1 

1 

−1 

−1 

κ X − κ L 

− 

− 

κ − κ 

St 

L 

(rovnice 80), 

což je přímý vztah mezi údajem z izotachoforegramu (výška vlny hX) a vlastností 

zóny (specifická vodivost κX). Kombinací rovnic popisujících izotachoforetickou 

podmínku a modifikovaný Ohmův zákon (viz kapitola 2.3.1) s rovnicí (80) dospějeme 

ke vztahu 

R 

X 

= 

( ) ( ) 

( ) ( ) 1 

1 

−1 

−1 

mX 

− mL 

− 

− 

m − m 

St 

L 

(rovnice 81). 

Zpravidla známe efektivní pohyblivosti L a St, takže zjištěním poměru RX můžeme 

vypočítat efektivní pohyblivost neznámé složky X. Pro daný operační systém jsou 

efektivní pohyblivosti L a St konstantní a rovnici (81) můžeme psát ve tvaru 

R 

X 

1 

= A − B ⋅ 

m 

X 

kde konstanty A a B jsou dány vztahy 

A 

St 

L St 

= − 

a ( m − m ) ( m − m ) 

L 

m 

St 

B = − 

m 

L 

⋅ m 

St 

(rovnice 82), 

(rovnice 83). 

Uvedený způsob vyhodnocování umožňuje nejen výpočet charakteristického údaje 

o°neznámé látce, ale je vhodný pro studium vlivu různých faktorů na její efektivní 

pohyblivost. 

V praxi se používá relativních hodnot, které lépe eliminují náhodné změny citlivosti 

detektoru (znečištění elektrod vodivostního kontaktního detektoru) i změny teploty 

(závislost pohyblivosti na teplotě a tedy ovlivnění výšky vlny). Pro látku X je za 

daných podmínek analýzy kvalitativním ukazatelem tzv. relativní výška vlny 

definovaná vztahem 


RSH 

X 

= 

h 

h 

X 

T 

− h 

− h 

L 

L 


(rovnice 84). 

Relativní výška vlny (Relative Step Height) se vyjadřuje buď v procentech, nebo jako 

bezrozměrné číslo a je konstantou pro danou látku a daný elektrolytový systém. 

Sama relativní odezva univerzálního detektoru je mnohdy nedostatečnou 

identifikační konstantou. Spolehlivost můžeme zvýšit použitím selektivního detektoru 

(fotometrický, spektrofotometrický, elektrochemický). U fotometrického detektoru je 

další identifikační konstantou absorpční koeficient a u elektrochemického detektoru 

použité pracovní napětí na elektrodách. Máme-li k dispozici pouze univerzální 

detektor, můžeme identifikaci neznámé látky podepřít změnou pracovních podmínek 

– složení vedoucího elektrolytu. Na základě analýz za různých podmínek lze 

odhadnout náboj identifikované látky, její disociační konstantu, případně konstanty 

stability s vhodnými komplexačními činidly. 

3.3 Kvantitativní analýza 

Délka zón se po dosažení ustáleného stavu s časem nemění a je za daných 

podmínek úměrná množství látky v analyzovaném vzorku, protože koncentrace látky 

v zóně je určená koncentrací vedoucího iontu podle Kohlrauschovy regulační ω- 

funkce (viz kap. 2.1.4) a je konstantní podél celé zóny. Protože se zóna pohybuje 

konstantní rychlostí (izotachoforetická podmínka), je čas, po který zóna pobývá 

v detektoru, úměrný její délce, a tím délce vlny na izotachoforegramu (viz Obrázek 

16). Ostrá rozhraní mezi zónami a vysoká přesnost měření času umožňuje velmi 

přesné měření délky zón, a tedy vysokou přesnost výsledků. 

Kohlrauschovu regulační ω-funkci můžeme v ustáleném stavu pro látku X psát ve 

tvaru 

= 

m 

⋅ 

m 

⋅ 

+ m 

X L C 

cX cL 

⋅ 

mL 

mX 

+ mC 

z 

z 

L 

X 

(rovnice 85), 



kde cX a cL jsou koncentrace látky X a vedoucího iontu L ve svých zónách, X m , m L , 

m C jsou efektivní pohyblivosti látky X, L a protiiontu C a zL a zX je počet nábojů 

nesených látkou L a X. Z rovnice vyplývá řada zajímavých důsledků. Vzhledem 

k tomu, že platí / < 1 m m , což je požadavek uspořádání pokusu, pak tedy platí, že 

X 

L 

koncentrace v jednotlivých zónách musí klesat tak, jak klesají pohyblivosti. Dále je 

zřejmé, že v daném vedoucím elektrolytu lze rovnici přepsat 

X 

cX = K ⋅ 

c 

L 

(rovnice 86), 

takže koncentrace separovaného iontu v jakékoliv zóně je jednoznačně určena 

koncentrací vedoucího iontu L. Z rovnice zřejmé také plyne, že dvojmocný ion dané 

pohyblivosti vytvoří dvojnásobně dlouhou zónu než ion jednomocný. Velmi důležitým 

praktickým důsledkem je tzv. „zřeďovací“ nebo „zakoncentrovávací“ efekt. Při 

analýze vzorku obsahujícího sledovanou složku o vyšší koncentraci, než je 

koncentrace v ustáleném stavu, dojde ke snížení koncentrace (naředění) a naopak 

při analýze vzorku o nižší koncentraci složky dojde k zakoncentrování. 

Názorně je tento efekt uveden na následujícím obrázku. 

Obrázek 17 

nX = cX1*VX1 

Koncentrační efekt 

v izotachoforéze. 

Stejné množství nX 

látky X bez ohledu 

na analyzovaný 

objem (VX1 < VX2) 

a koncentraci (cX1 

> cX2) za stejných 

separačních 

podmínek (v 

různých průřezech 

nX = cX2*VX2 nX = cX*VX 

kapiláry) po dosažení ustáleného stavu se bude nacházet ve stejném objemu VX, protože 

koncentrace cX v zóně je určena Kohlrauschovou regulační ω-funkcí. 



V izotachoforéze je běžné 10 3 až 10 5 násobné zakoncentrování. Tento fakt má 

zásadní význam při nasazení izotachoforézy ve stopové analýze nebo jako 

prekoncentrační techniky. 

Nejjednodušší postup při kvantitativní analýze je sestrojení kalibrační přímky, kdy 

získáme grafickou závislost délky vlny (lX viz Obrázek 16) na dávkovaném množství. 

Vztah mezi délkou zóny a množstvím analytu můžeme psát ve tvaru 

I 

n X = konst ⋅ t X = c X ⋅ v X ⋅ S ⋅ t x = c X ⋅ m X ⋅ E X ⋅ S ⋅ t x = c X ⋅ m X ⋅ ⋅ t 

κ 


X 

X 

(rovnice 87). 

Z posledního tvaru rovnice je zřejmé, že doba průchodu detektorem pro dané látkové 

množství nezávisí na průřezu kapiláry S. Tento zdánlivý paradox vyplývá z faktu, že 

průřezu kapiláry je nepřímo úměrná při daném konstantním hnacím proudu I nejen 

délka zóny, ale i proudová hustota, intenzita elektrického pole EX, a tím i rychlost 

migrace vX. Plyne z toho velká přednost kapilární izotachoforézy, a sice že můžeme 

snadno porovnávat výsledky mezi různými laboratořemi získané ve stejném 

vedoucím elektrolytu bez ohledu na použitý analyzátor a průřez kapiláry. Kalibrační 

přímky mají dlouhodobou platnost. Z rovnice (87) dále plyne, že objemová rychlost 

zón všech separovaných látek je stejná. Dále z rovnice (86) plyne, že poměr 

směrnice kalibračních přímek rovnice (87) je v daném operačním systému 

konstantou. Vyjádříme-li veličiny zóny X pomocí parametrů vedoucí zóny, můžeme 

psát 

K 

⋅ c 

⋅ m 

⋅ I 

X 

n X = 

L 

κ L 

L 

⋅ 

t 

X 

(rovnice 88). 

Podobně lze užít k porovnání libovolné vhodné standardní látky St a známe-li 

relativní faktor odezvy 

c 

i i 

K rel = , kde cSt je koncentrace standardní látky můžeme je 

cSt 

použít ke konstrukci kalibračních přímek nebo při metodě standardního přídavku, kdy 

pro získané délky zón platí


X X 

n X = K rel ⋅ ⋅ 

t St 

t 

n 

St 

(rovnice 89), 

kde nSt je známé dávkované množství standardu St. Místo látkových množství lze do 

rovnice (89) dosadit koncentrace, musíme však znát dávkovaný objem. Relativní 

faktory odezvy zjištěné experimentálně platí pro daný operační systém a velmi 

usnadňují práci v laboratoři. Stačí sestrojit jedinou kalibrační přímku vhodného 

i 

standardu a pro i-tý analyt použít hodnot K . 

Kromě použití kalibrační přímky (technika vnějšího standardu) lze v izotachoforéze 

při kvantitativní analýze postupovat technikou vnitřního standardu, nebo technikou 

standardního přídavku. 

Výhodou izotachoforézy je existence dobře propracovaného základního teoretického 

modelu, který umožňuje snadno simulovat všechny potřebné rovnovážné 

charakteristiky zón. Jde zejména o rovnovážné koncentrace látek v čistých zónách, 

které jsou přístupné výpočtu. To umožňuje nahradit kalibrační postupy v kvantitativní 

analýze částečně, nebo úplně výpočtem. Možnost částečného výpočtu spočívá 

v tom, že se experimentální kalibrace provede pouze pro jedinou referentní látku a 

pro ostatní analyty se vypočtou hodnoty rovnovážných koncentrací 

izotachoforetických zón a z nich relativní korekční faktory a kalibrační konstanty. 

Předpokladem je znalost fyzikálně-chemických konstant analytů. Druhá možnost je 

úplné využití výpočtů ustáleného stavu, což po dosazení konkrétních hodnot hnacího 

proudu umožňuje získat vypočtenou kalibrační přímku pro konkrétní podmínky. Takto 

vypočtená kalibrační konstanty jsou tabelovány. 

3.4 Speciální techniky izotachoforetické analýzy 

Kromě standardního uspořádání izotachoforetické analýzy, tj. separace v jednoduché 

kapiláře vybavené univerzálním případně specifickým detektorem, existují speciální 

postupy a techniky, jejichž společným jmenovatelem je zvýšení efektivity 

izotachoforetické analýzy pro daný úkol. Patří sem zejména technika spojování 

objemů a kolon, koncentrační kaskáda, protiproud vedoucího elektrolytu, preparativní 


rel


kontinuální izotachoforéza a další. V následujících kapitolách budou některé 

z technik popsány podrobněji. 

Spojování objemů 

Technikou spojování objemů („volume coupling“) můžeme výrazným způsobem 

zvýšit separační kapacitu při zachování stejných nároků na pracovní napětí a stejné 

meze stanovitelnosti. Separační část je konstruována tak, že část separační kolony 

je konstruována jako vyměnitelná jednotka o volitelném průměru. Ten se volí podle 

požadované separační kapacity, přičemž detekce zón se provádí ve všech případech 

za srovnatelných podmínek. 

Spojování kolon 

Technika využívající dvou spojených kolon („column coupling“, „column switching“) je 

další variantou, při níž je kombinován princip přídavného objemu s užitím pomocné 

elektrody. Tato varianta umožňuje zkrátit čas analýzy a eliminovat z analýzy balastní 

složky vzorku. Zařízení pro spojování kolon se skládá ze dvou kapilár (kolon) 

nestejného průměru. První kolona o větším průměru (separační) umožňuje svou 

velkou separační kapacitou separace dostatečného množství vzorku, zejména 

z hlediska přítomných větších množství balastních látek. 

LE 1 

a) b) c) 

S A+B 

TE 

M 

i i 

D 1 

LE 2 

D 2 

i 


B 

A 

M 

Obrázek 18 

Schéma dvourozměrné separace v 

kapilární izotachoforéze. Na obrázku 

(a) migruje makrosložka M před 

směsnou zónou složek A a B (SA+B). 

Část makrosložky byla oddělena 

mimo separační trasu (obrázek (b)). 

Přepnutím směru proudu byla směsná 

zóna složek A a B nadávkována do 

druhé kapiláry, naplněné vedoucím 

elektrolytem LE2 (obrázek (c)). D1,D2 

= detektor první a druhé kapiláry, i = 

směr hnacího proudu, LE1 = vedoucí 

elektrolyt v předseparační kapiláře, 

TE = koncový elektrolyt.


Na počátku analýzy teče proud mezi koncovou a pomocnou elektrodou (viz Obrázek 

18 a). Po příchodu zóny do detektoru D1 v separační koloně (viz Obrázek b) je hnací 

proud přepnut tak, že nyní teče mezi koncovou a vedoucí elektrodou (viz Obrázek 18 

c). Zóny látek nyní migrují do analytické kapiláry o malém průměru, kde je případně 

dokončena separace a provedena jejich detekce. Při použití techniky spojených 

kolon je možno její přednosti kombinovat s užitím koncentrační kaskády. 

V případě analýz látek, které se nacházejí v komplexní ionogenní matrici na nízkých 

koncentračních úrovních, je zpravidla obtížné provést stanovení metodou kapilární 

elektroforézy bez náročné předúpravy vzorku (např. extrakcí na tuhou fázi). V těchto 

případech je možné využít spojení některých metod kapilární elektroforézy. Jde 

zejména o dvojrozměrnou izotachoforézu (CITP-CITP) a kombinaci izotachoforézy a 

zónové elektroforézy (CITP-CZE). Principem CITP-CITP je separace vzorku, nebo 

jeho části za dvou různých podmínek analýzy (daných vedoucími elektrolyty) během 

jednoho nadávkování. Na volbu těchto vedoucích elektrolytů je kladeno několik 

požadavků 31 . Tyto vedoucí elektrolyty by měly mít nízkou podobnost (rozdílné 

hodnoty pH, přítomnost látek tvořících se separovanými ionty komplexy). 

Obrázek 19 

a) b) c) 

Schéma kombinace kapilární 

izotachoforézy a kapilární zónové 

TE 

elektroforézy CITP-CZE). Směs 

analyzovaných iontů S je 

SA+B zakoncentrována mezi zónami 

makrosložek a zónou koncového 

iontu. Makrosložky jsou odvedeny 

i 

M 

D1 i 

i 

mimo separační trasu a mikrosložky 

jsou přepnutím směru proudu 

nadávkovány do kapiláry naplněné 

základním elektrolytem, kde proběhne 

LE 

1 

BGE 

B 

A 

jejich rozdělení. A, B = analyzované 

složky, BGE = základní elektrolyt, D1, 

M 

D2 = detektory na první a druhé 

kapiláře, i = směr hnacího proudu, LE 

= vedoucí elektrolyt, M = zóny 

D2 makrosložek, S = zóny mikrosložek zakoncentrované do rozhraní mezi zóny makrosložek a 

zónu koncového iontu, TE = koncový elektrolyt. 



Separace dosažená v prvním kroku by neměla být znehodnocena v kroku druhém. 

Tento druhý požadavek se v praktických případech dá splnit zpravidla jen tehdy, 

pokud je do druhého separačního kroku nadávkována pouze část iontů 

separovaných v prvním kroku. 

Výhodou je, pokud je separační kapilára, ve které probíhá druhý rozměr separace, 

vybavena selektivním detektorem, což v některých případech umožňuje dosáhnout 

mnohem vyšší citlivosti. Pro dvourozměrné separace látek je možné v druhém kroku 

použít zředěný vedoucí elektrolyt, a provést tak detekci látek za nižšího hnacího 

proudu, čímž je možné dosáhnout velmi nízkých detekčních limitů i při použití 

univerzální detekce. V kapilární zónové elektroforéze je vždy snahou nadávkovat do 

kapiláry krátkou zónu vzorku s vysokou koncentrací stanovované složky. Toto 

zpravidla není problém v případě analýz modelových směsí. Pokud je ovšem 

prováděna analýza složky nacházející se vedle jiných složek, jež ji koncentračně o 

několik řádů převyšují, může být takováto analýza problematická jak z pohledu 

separačního, tak i z pohledu detekce. Vhodným řešením tohoto separačního 

problému může v řadě případů být použití kapilární izotachoforézy jako předstupně 

kapilární zónové elektroforézy. Kapilární izotachoforéza je ideální technika dávkování 

pro kapilární zónovou elektroforézu 32, 33 . Umožňuje totiž nadávkovat 

v izotachoforetickém kroku velký objem vzorku (10 3 -10 4 krát vyšší), který je 

zakoncentrován (podle složení vedoucího elektrolytu) do izotachoforetických zón. 

Makrosložky komplexní matrice mohou být odstraněny mimo další separační trasu a 

do zónové elektroforézy mohou tak být nadávkovány minimální objemy 

zakoncentrovaných složek, které mají být stanoveny. Ve vhodně zvoleném 

základním elektrolytu (se zpravidla stejným koiontem, jako je koncový ion 

izotachoforetického stupně) se dosáhne účinné separace analyzovaných složek. 

V této souvislosti je vhodné zodpovědět i otázku, jaký je smysl zařazení CZE a proč 

v druhém stupni nebylo použito CITP. Velkou výhodou izotachoforézy je její 

schopnost zakoncentrovat minoritní složky vzorku do zón, které jsou působením 

samozaostřujícího efektu ostré a nejsou zřeďovány difúzí. Vysvětlení tohoto 

zdánlivého protimluvu lze nalézt na Obrázku 20, kde je zobrazena modelová situace 

separace dvou složek aktivních z hlediska použití selektivního detektoru (např. 



absorbující UV záření). V izotachoforéze jsou všechny zóny seřazeny za sebou a 

nejsou odděleny žádným základním elektrolytem. Pokud se složky nacházejí ve 

velmi nízkých koncentracích, jsou zakoncentrovány do zón, jejichž délky mohou být 

kratší, než je schopen zaregistrovat univerzální (např. vodivostní) detektor. Selektivní 

detektor tyto zóny zaregistruje, ale zóny mohou být rozlišeny pouze v případě, pokud 

mezi nimi migruje látka, která z hlediska použitého selektivního detektoru aktivní 

není. 

Obrázek 20 

Elektroforegramy separace dvou látek 

absorbujících světlo vlnové délky 254 nm. Na 

obrázku (a) je separace pomocí kapilární 

izotachoforézy. Na obrázku (b) jsou složky 

separovány kombinací CITP-CZE. 

Pokud jsou ovšem tyto zóny nadávkovány do kapiláry naplněné základním 

elektrolytem (a pokud je tento vhodně zvolen), mohou být rozlišeny. Lze 

předpokládat, že právě kombinace kapilární izotachoforézy a kapilární zónové 

elektroforézy je jedním ze směrů budoucího vývoje kapilární elektroforézy, neboť 

umožňuje analýzy minoritních složek v komplexních matricích 34 a řeší v současné 

době mnohdy poměrně málo uspokojivou koncentrační citlivost kapilární zónové 

elektroforézy. 

Protiproud vedoucího elektrolytu 

Technika protiproudu vedoucího elektrolytu umožňuje zvětšit efektivní migrační 

dráhu zón a tedy i separační kapacitu systému bez zvýšení nároků na pracovní 

napětí a při zachování daných podmínek detekce. Nyní je této techniky málo 

využíváno hlavně z toho důvodu, že přítomný tok výrazně narušuje ostrost rozhraní 

mezi zónami. Tato technika se v současnosti používá v kapilární elektroforéze, kde 

aplikací tlaku proti elektroosmotickému toku v kapiláře lze do určité míry zvětšit 

účinnost separace bez nutnosti změny elektrolytů. Schéma provedení 

izotachoforetické analýzy je na Obrázku 21. Do kapiláry je proti směru migrace zón 


čas


zaveden tok vedoucího elektrolytu o rychlosti vh, který snižuje rychlost migrace 

zónových rozhraní 

Obrázek 21 

Izotachoforéza 

s protiproudem vedoucího 

elektrolytu 10 

z původní rychlosti vel na 

rychlost v = vel - vh. 

V praxi možno aplikovat maximálně takový protiproud, který vede ke snížení migrační 

rychlosti o maximálně 30 %. 

Preparativní izotachoforéza 

Tuto techniku je možné provádět v kontinuálním uspořádání a diskontinuálním. Při 

kontinuální metodě je současně nepřetržitě dávkován vzorek a odebírány 

separované látky. Metoda se provádí ve volně tekoucích „free-flow“ roztocích ve 

štěrbinovém prostoru mezi dvěma chlazenými skleněnými deskami. Tok je v celém 


v 

vel 

vH 

vH 

prostoru homogenní a laminární. 

Obrázek 22 

Kontinuální preparativní 

izotachoforéza. (a) laminární tok 

elektrolytů a vzorku bez průchodu 

elektrického hnacího proudu; (b) 

separace vzorku při průchodu 

elektrického proudu; (c) separace 

vzorku při průchodu elektrického 

proudu po zapojení 

hydrodynamického protiproudu. 

Na části vstupní hrany 

separačního prostoru vtéká 

koncový elektrolyt, částí vzorek a


zbylou částí vedoucí elektrolyt, pak odpovídajícími částmi výstupní hrany tytéž 

roztoky odcházejí nesmíchány s ostatními (viz Obrázek 22). Aplikujeme-li kolmo na 

směr toku stejnosměrné elektrické pole, začne v jeho směru (tj. napříč 

hydrodynamickým polem) probíhat izotachoforetická separace a rozdělené látky se 

na výstupní hraně jímají. Kromě preparace lze toto uspořádání využít pro frakcionaci 

izotachoforeticky rozdělené směsi analytů, dále pro zakoncentrování a oddělení 

složky přítomné ve stopových koncentracích nebo pro předúpravu vzorku před 

stanovením jinou vhodnou analytickou metodou, například HPLC. 

Při diskontinuální mikropreparativní izotachoforéze se do separační trasy zařadí 

frakcionační ventil, jak je znázorněno na Obrázku 23. Výkon takovéhoto zařízení je 

ca 0,1 mg/analýzu. 

Obrázek 23 

Zařízení pro diskontinuální preparativní 

izotachoforézu 35 . 1-rezervoár zakončujícího 

elektrolytu; 2-septum pro dávkování vzorku 

mikrostříkačkou; 3-univerzální dávkovač vzorku 

(ventil s fixním objemem) umožňuje dávkování 

buď kohoutem, nebo stříkačkou, případně oběma 

způsoby; 4-separační kapilára; 5-detektor; 6-plnící 

blok od rezervoáru vedoucího elektrolytu (8) 

oddělený membránou (7); �-elektroda, na kterou 

se připojuje vysokonapěťový zdroj o požadované 

polaritě; g-elektroda, ke které se připojuje druhý 

pól zdroje hnacího proudu; S-místa pro dávkování 

vzorku; le-místo pro plnění separační kapiláry (4) 

roztokem vedoucího elektrolytu přes ventil (9); 10frakcionační 

kohout, jehož tři základní pozice jsou 

uvedeny vpravo; α-pracovní pozice ventilu; 

separovaná látka se nachází v prostoru mezi dávkovačem a tělem frakcionačního ventilu a 

když látka, kterou chceme izolovat, domigruje do těla ventilu (doba se odvodí z odezvy 

detektoru 5), přerušíme hnací proud a otvor v těle ventilu vypláchneme vodou nebo jiným 

vhodným médiem (pozice β); v pozici γ můžeme znovu tělo ventilu naplnit roztokem 

vedoucího elektrolytu (le) a po otočení do pozice α pokračovat ve frakcionaci. 


Ostatní techniky 


Z dalších speciálních postupů izotachoforetické analýzy lze jmenovat techniku 

kontinuálního dávkování vzorku používanou v těch případech, kdy je koncentrace 

analytů ve vzorku velmi nízká. Zařízení pro tuto techniku je konstruováno tak, že do 

separační kapiláry je zaveden takový protiproud vedoucího elektrolytu, aby 

kompenzoval elektromigrační pohyb zón. Současně se přes septum zavádí tok 

vzorku. Analyt ze vzorku se zakoncentrovává na zadním rozhraní vedoucí zóny a 

přebytek rozpouštědla odtéká do komůrky zakončujícího elektrolytu. Po skončení 

dávkování je zastaven protiproud vedoucího elektrolytu a analýzy se normálním 

způsobem dokončí. Zařízení je znázorněno na následujícím obrázku. 

Obrázek 24 

Technika kontinuálního dávkování vzorku 

Při použití koncentrační kaskády je separační kapilára naplněna vedoucím 

elektrolytem o různých koncentracích; od místa dávkování vzorku po speciální ventil 

koncentrovanějším elektrolytem a zbytek kapiláry včetně detektoru zředěnějším 

elektrolytem. Tímto způsobem je možné významným způsobem zvýšit separační 

kapacitu. Nevýhodou této techniky je, že vyžaduje speciální aparaturu. 

Izolovat separované zóny látek vzorku je kromě kontinuální preparativní či 

diskontinuální mikropreparativní izotachoforézy možné technikou eluce z kapiláry, 

která podobně jako technika kontinuálního dávkování vzorku využívá protiproud 

vedoucího elektrolytu. Ve speciální aparatuře je vhodným nastavením poměru 

protiproudu a velikosti hnacího proudu dosaženo kvantitativní eluce látek speciálním 

vývodem ven ze separační kapiláry, kde je možné jímání vhodným sběračem. Pro 

sledování separačního procesu se používá technika mnohakanálové detekce. Podél 

separační kapiláry je umístěno pole snímacích elektrod (např. 256), s jejichž pomocí 

je přes pohyblivý kontakt snímám v krátkých časových intervalech signál z každé 

z nich. Separační proces je ukončen a automaticky vyhodnocen v momentu, když se 

délky všech registrovaných zón nemění. Principem desorpční analytické 



izotachoforézy 36 je zařazení vhodného sorbentu (afinitně aktivní látka či selektivní 

sorbent) do separační trasy. V první fázi analýzy (sorpce) je tento sorbent tvořící 

s analytem labilní komplex promýván vzorkem. V další fázi analýzy je zachycená 

ionogenní složka po odstranění ostatních látek promytím vhodným roztokem 

desorbována elektrickým polem v režimu kapilární izotachoforézy „on-line“ a 

stanovena obvyklým způsobem. Metoda byla použita při stanovení imunochemicky 

aktivních monoklonálních protilátek. 


4. Volba pracovních elektrolytů 

Volba pracovních elektrolytů 

Výběr vhodného elektrolytového systému 37 je problematika velmi komplexní, která 

zahrnuje předběžné znalosti o kvalitativním i kvantitativním složení vzorku, 

požadavky na očekávanou analytickou výpověď, osobní zkušenosti samotného 

pracovníka s volbou elektrolytových systémů i literární data a experimenty. Prvním 

úkolem při izotachoforetické analýze je zvolit pracovní podmínky tak, aby se všechny 

analyty vzorku rozdělily. Podstatnou roli (mimo přístrojové techniky) hraje volba 

správného složení vedoucího a koncového elektrolytu. Pro takové složení vedoucího 

a koncového elektrolytu, které poskytuje optimální výsledky, je používán název 

„operační“ nebo „pracovní systém elektrolytů“. Pro úspěšnou izotachoforetickou 

analýzu je především třeba nalézt vhodný operační systém, v němž po nástřiku 

vzorku obdržíme od všech analyzovaných látek korektně izotachoforetické a 

analyticky stabilní zóny. Tyto zóny musí obsahovat konstantní množství příslušných 

nastříknutých látek a jejich rozhraní musí vykazovat samozaostřující efekt. Postup při 

výběru elektrolytového systému je následující: 

1) Shromáždění předběžných znalostí o možném kvalitativním i kvantitativním 

složení vzorku určeného k analýze a definování požadavků na analytickou 

výpověď, tzn. zda jde o analýzu kationtů či aniontů a které chemické typy látek 

bude třeba analyzovat. 

2) Volba určitého konkrétního vedoucího a koncového elektrolytu. 

3) Testování stability zón analyzovaných látek. 

4) Testování separovatelnosti analyzovaných látek. 

5) Zjištění, zda jsou dotyčné látky separovatelné i v množství potřebném pro 

uspokojivou kvantitativní analýzu a v poměru daném vzorkem, tj. délky všech zón 

jsou dostatečně dlouhé. 

6) Optimalizace analýzy (složení elektrolytů, podmínky analýzy, doba analýzy, 

náklady na analýzu) 

Není-li v krocích 3 až 5 dosaženo uspokojivých výsledky testů, je třeba volit jiný 

systém a postup opakovat. Optimalizace analýzy má význam v případě, kdy 

výsledkem našeho snažení má být rutinní analytický postup. 



4.1 Předběžné úvahy 

Základem pro volbu předběžného elektrolytového systému jsou požadavky, jejichž 

splnění zaručuje vhodné elektromigrační chování analyzovaných látek. Výchozím 

bodem přitom jsou fyzikálně-chemické vlastnosti těchto látek, určitá všeobecná 

pravidla o migraci látek, simulační výpočty 1, 11, 17 , zkušenosti experimentátora, 

publikovaná izotachoforetická data, doporučené elektrolytové systémy, neboť jak 

praví nepsané pravidlo: „Efektivnější je hledání v literatuře než v laboratoři“. Při volbě 

systému pro separaci určité látky nebo skupiny látek je nutné mít na paměti 

požadavek, že látky musí být v uvedeném elektrolytu dostatečně rozpustné, 

chemicky stabilní a ionizované. 

První vlastnost, kterou je třeba vzít v úvahu, je rozpustnost látek, jež mají tvořit 

elektrolytový systém, a samozřejmě též i možná rozpustnost analyzovaných látek 

v jejich zónách. Pro běžně používané koncentrace vodných elektrolytových systémů 

(10 -3 až 10 -2 mol. l -1 ) pro většinu látek nepřináší toto koncentrační rozmezí žádné 

mimořádné obtíže. V případě látek omezeně rozpustných ve vodě je však toto mít na 

paměti zvláště s přihlédnutím k tomu, že během izotachoforetické analýzy dochází 

k zakoncentrování v zónách (adjustace koncentrace dle Kohlrauschovy regulační ω- 

funkce – viz kapitola 2.1.4) jejich adjustované koncentrace v ustáleném stavu, která 

může být vyšší než rozpustnost ve zvoleném rozpouštědle. 

Jako další požadavek je třeba uvážit chemickou stabilitu ionogenních látek k analýze. 

V úvahu připadá nejen oxidace či redukce, která by mohla probíhat mezi 

elektrolytovým systémem a analyzovanými látkami, ale i srážení iontů z roztoku, 

popřípadě elektrodové reakce analytu se senzorem vodivostního detektoru. Např. 

kationtová analýza vzorku obsahujících olovnaté či stříbrné ionty vyžaduje, aby 

protiiontový systém neobsahoval v praxi často užívaný chlorid. 

Velmi důležitým problémem při volbě elektrolytového systému pro jakýkoliv typ 

elektroforézy (a tedy i pro izotachoforézu) je ionizace analyzovaných látek. K jejich 

separaci je třeba, aby byly alespoň částečně disociovány či protonizovány, tj. aby 

jejich efektivní pohyblivost byla dostatečně velká. Z praktického hlediska je ještě 



akceptovatelná minimální pohyblivost 5.10 -9 m 2 V -1 s -1 (to odpovídá jednotkovému 

náboji neseného částicí o relativní molekulové hmotnosti asi 3000). 

Hodnota pH se volí tak, aby se využila optimální pufrační kapacita systému. 

V některých případech (při dělení iontů silných elektrolytů) pufrační schopnost 

protiiontu není nutná, jindy je třeba dvou nebo více pufrujících protiiontů. Koncový 

elektrolyt vhodný pro separaci kationtů má mít nižší pH než vedoucí elektrolyt a při 

analýze aniontů platí opačný požadavek. V izotachoforéze je pufrování zón poněkud 

složitější než v ostatních typech elektroforézy. Není zde žádný základní elektrolyt a 

celé pufrování je úkolem pouze protiiontového systému. Toto pufrování není 

jednoduché, neboť poměry v protiiontovém systému se mění od zóny k zóně. Průběh 

pH od vedoucí zóny ke koncové v izotachoforéze podléhá přesným zákonitostem. 

V aniontové izotachoforéze pH zón ve směru od vedoucí ke koncové zóně stoupá, 

v kationtové klesá. Jednoznačně platí toto pravidlo v případě silných elektrolytů. 

Obecně lze říci, že čím kyselejší je vedoucí elektrolyt při kationtové analýze, tím 

kyselejší jsou zóny vzorku. Při aniontové analýze je situace analogická s tím 

rozdílem, že průběh pH je opačný. 

TABULKA 6 

Obecná pravidla pro volbu elektrolytových systémů 

Parametr Kationtová analýza Aniontová analýza 

Vedoucí ion K + , Na + , NH4 + , H3O + 

Cl - , NO3 - , OH - 

Zakončující ion H3O + , slabá báze OH - , slabá kyselina 

Protiion Slabá kyselina HA Slabá báze BH 

Podmínka ionizace analytů pH ≤ pKBH + 1 pH ≥ pKHA - 1 

Doporučuje se, aby pK látky, jež je zdrojem koncového iontu, bylo vyšší než pK 

nejslabší kyseliny analyzované směsi (jinak by se mohly „ztrácet“ méně kyselé 

komponenty v zakončujícím elektrolytu). 

Při výběru je třeba brát v úvahu i čistotu chemikálií, ze kterých se připravují pracovní 

elektrolyty. Chemikálie p.a. mnohdy nevyhovují a je třeba je dále čistit, nejčastěji 

rekrystalizací nebo destilací. Nejsnáze se odhalí přítomnost nečistot slepým 



pokusem, kdy se nečistota projeví v izotachoforegramu jako vlna mezi vedoucím a 

koncovým iontem. 

Obecná pravidla pro volbu operačního systému shrnuje TABULKA 6. Jako vedoucí 

ion je zpravidla volen rychlý ion plně disociované látky, která je k dispozici ve vysoké 

čistotě. Jako koncové ionty je ve vodných systémech vždy nutné brát v úvahu H3O + 

(kationická analýzy) či OH - (anionická analýza), které musí vždy tvořit potenciálně 

poslední zónu. Vzhledem k tomu, že tyto ionty mají ve vodě nejvyšší pohyblivost ze 

všech iontů, mohou se pohybovat mnohem rychleji a důsledkem může být 

nekontrolovaný pohyb těchto iontů přes izotachoforetická rozhraní, a tím narušení 

38, , , 

izotachoforézy 39 40 41 . 

Podle způsobu, jakým je kontrolována migrace iontů H3O + a OH - rozlišujeme tři typy 42 

operačních systémů, a to: 

� pufrovaný (stabilní) 

� pufru prostý (stabilní) 

� nepufrovaný (nestabilní). 

V pufrovaném systému je použit plně disociovaný anion kyseliny (kation báze při 

kationické analýze) jako vedoucí ion a vhodná slabá báze (slabá kyselina) jako 

pufrující protiion. Migrace OH - (H3O + ) je tedy kontrolována a jako potenciální 

terminátor musí být uvažován OH - (H3O + ). 

V systému bez pufru slouží anion silné kyseliny (kation silné báze) jako vedoucí ion a 

protiiontem je H3O + (OH - ). Systém je silně kyselý (alkalický) a migrace OH - (H3O + ) je 

silně potlačena. Kyselina (báze) s velmi nízkou pohyblivostí je vhodným 

zakončujícím iontem. 

Posledním případem je nepufrovaný systém, ve kterém je použit jako vedoucí anion 

OH - (H3O + ). Jako protiion je použita silná báze (kyselina, alkalický kov) a systém 

nevykazuje pufrační schopnosti. Jako terminátor je použit anion (kation) o nízké 

pohyblivosti. Nekontrolovaná migrace OH - (H3O + ) celým systémem je zdrojem 

nereprodukovatelných výsledků – systém je nestabilní. Tento systém je možné 

použít pouze v případě, že je zajištěna kontrolovaná migrace OH - (H3O + ) ze zóny 

zakončujícího iontu použitím slabé báze (slabé kyseliny). 


TABULKA 7 

Základní doporučené operační systémy 


Anionty – vedoucí anion Cl - (0,002 – 0,02 M-HCl) + protiion + 0,05 – 0,2 % aditivum (HEC, 

HPMC, PVA, PVP) 

pHL Protiion Zakončující anion 

2,0 – 3,0 Glycin Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová 

2,5 – 3,5 Glycylglycin Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová 

3,0 – 4,0 β-alanin Kyselina octová, propionová, kapronová, glutamová 

4,0 – 5,0 EACA Kyselina, kapronová, glutamová, MES 

4,5 – 5,5 Kreatinin Kyselina, kapronová, glutamová, MES 

5,5 – 6,5 Histidin Kyselina, kapronová, glutamová, MES, HEPES 

6,5 – 7,5 Imidazol Kyselina MES, HEPES, TAPS 

7,5 – 8,5 TRIS (TAPS, glycin, β-alanin) + Ba(OH)2 

8,5 – 9,5 AMMED (CAPS, glycin, β-alanin, EACA) + Ba(OH)2 

9,0 –10,0 ETHAMIN (CAPS, EACA, GABA) + Ba(OH)2 

Kationty – vedoucí anion K + - (0,001 – 0,05 M-KOH) + protiion + 0,05 – 0,2 % aditivum 

(HEC, HPMC, PVA, PVP) 

pHL protiion Zakončující kation 

4,0 – 5,5 octová H3O + (octová kyselina), β-alanin, EACA, kreatinin, TBA 

5,5 – 6,5 MES, kakodylová EACA, Histidin, imidazol, kreatinin, TRIS 

6,5 – 7,5 HEPES TRIS, HIS, 

7,8 – 8,8 TAPS TRIS, BICIN, TRICIN 

8,8 – 9,8 boritá TRIS, triethanolamin 

9,0 –10,0 glycin TRIS, lysin, ethanolamin, 

9,8 – 10,8 β-alanin NH4 + , ethanolamin 



Přehled nejběžněji používaných operačních systémů souhrnně uvádí TABULKA 7. 

Jak je z tabulky zřejmé, je v řadě případů možné protiion aniontového operačního 

systému použít jako terminátor v kationtovém systému a naopak. Velmi užitečnou 

pomůckou při volbě operačního systému jsou tabelované hodnoty (zjištěné 

simulačními výpočty) efektivních pohyblivostí pro sérii osvědčených elektrolytových 

systémů v rozmezí pH 3 až 10. V této práci jsou pro 237 aniontů vypočítány 

kvalitativní a kvantitativní parametry izotachoforetických zón. Pomocí těchto 

parametrů lze s poměrně vysokou pravděpodobností zvolit vhodný operační systém 

pro konkrétní úlohu. 

4.2 Určení stability zón a separovatelnosti analytů 

Určení, že sledovaná látka poskytuje ve zvoleném operačním systému stabilní 

individuální zónu, je možné provést teoreticky výpočtem 43 nebo experimentálně. 

Izotachoforetická zóna je stabilní, jestliže obsahuje stále konstantní množství 

analyzované látky rovné jejímu nadávkovanému množství a jestliže obě rozhraní 

vykazují samozaostřující schopnost. Experimentální ověření stability zón v daném 

operačním systému je kalibrační graf, tj. graf závislosti délky vlny na 

izotachoforegramu na dávkovaném množství. Je-li zóna stabilní, pak je kalibrační 

graf přímkový a prochází počátkem. V opačném případě se jedná o nestabilní zóny a 

je nutno zvolit jiný operační systém elektrolytů. Experimentální ověření stability zón 

analyzovaných látek dává jednoznačnou odpověď, avšak je časově náročné. Pro 

rychlou orientaci, které skupiny látek dávají v daném zvoleném operačním systému 

stabilní zóny, byly zavedeny diagramy existence zón (DEZ). V nich je vynášena 

efektivní pohyblivost látky proti pH. Celá problematika je názorně vysvětlena na 

Obrázku 25. Horní kontura a dolní kontura odpovídají korektní migraci, kterou 

vystihují relace uvedené na obrázku. Tyto relace vyjadřují, že vedoucí ion L musí mít 

v zóně X vyšší pohyblivost než látka X sama ve své zóně a že látka X v zóně 

terminátoru musí mít vyšší pohyblivost než terminátor sám ve své zóně. V diagramu 

jsou dva význačné body označené L a T. První odpovídá vedoucí zóně a druhý 

zakončující zóně (terminátoru). Pravá hraniční kontura odpovídá migraci iontů silných 

elektrolytů. V kationtové izotachoforéze jsou obvykle používány kationty alkalických 



kovů (nebo amonný ion) jako vedoucí látky. Bod L na DEZ odpovídá vedoucí zóně a 

tedy maximálnímu pH a pohyblivosti. Bod T určuje minimální pH systému, neboť 

odpovídá potenciálnímu terminátoru H3O + , kde jako zakončující elektrolyt je použita 

volná slabá kyselina (nejčastěji octová). 

m 

m L, 

L 

m T , T 

T 

pHT 

m X , X mL, 

X ≤ 

m T , T ≤ mX 

, T 

Obrázek 25 

Obecné schéma diagramu 

existence zón. 

Pro aniontovou 

izotachoforézu je 

situace analogická. 

Jako vedoucí látka je 

obvykle použit chlorid a 

bod L odpovídá 

nejvyšší pohyblivosti a 

zároveň minimálnímu 

pH. Bod T odpovídá 

potenciálnímu 

terminátoru OH - a pHT 

je maximální v celém systému. DEZ lze vypočítat pro konkrétní vedoucí elektrolyt. 

Kromě hraničních kontur jsou v diagramu znázorněny křivky tvořící síť pro 

parametricky volené pKBH a mBH (pKHA a mHA pro anionickou analýzu). Z takového 

diagramu můžeme rozpoznat, zda daná báze o určitých hodnotách pohyblivosti a 

disociační konstanty dává či nedává korektní izotachoforetickou zónu. Navíc 

můžeme pro zvolenou látku odečíst vlastnosti její zóny ( m X , X a pHBH). Pod pojmem 

separovatelné látky se v izotachoforéze rozumí takové látky, které lze při dostatečné 

separační kapacitě od sebe navzájem oddělit za tvorby jejich vlastních individuálních 

zón. Ověření separovatelnosti složek analyzované směsi není jednoduchý problém. 

Při experimentálním přístupu jde o analýzy několika modelových směsí, z nichž 

každá vždy obsahuje všechny sledované látky, ale v různém koncentračním poměru. 


X 

L 

m < m 

pHL 

L 

pH


Jestliže se kvalitativní charakter záznamů, tj. počet a výška vln, nemění a kalibrační 

přímky sestrojené z těchto záznamů procházejí počátkem, pak lze považovat 

sledované látky za separovatelné. Pro teoretické vyhodnocení separovatelnosti je 

vhodný přístup založený na relacích vyjadřující migrační pořadí zón 44 . 

m 

Obrázek 26 

Diagram existence zón pro 10 

mM-octan draselný jako 

vedoucí elektrolyt a H3O + 

jako terminátor. Čísla 20, 30, 

… 70 u horizontálních čar sítě 

značí hodnoty mobilit mBH a 

čísla 3,4, …. 12 u vertikálních 

čar sítě značí pKBH. 

V diagramu jsou vyznačeny 

body ( m , pH) odpovídající 

zónám β-alaninu (Ala), 

papaverinu (Pap), anilinu 

(Ani), 1,1,1-tris 

(hydroxymethyl)-aminomethanu (Tris), tetrabutylamoniu (TBA), amoniu, sodíku a draslíku. 

Je-li ve zvoleném operačním systému pro dvojici analyzovaných látek A a B možné 

jednoznačně určit migrační pořadí jejich individuálních zón, pak jsou látky v daném 

systému separovatelné. Pro posouzení migračního pořadí platí následující kritéria: 

Látka A migruje před látkou B pokud platí 

m A, 

B > mB, 

B a současně m B, 

A < m A, 

A 

a naopak látka B migruje před A pokud 

m A, 

B < mB, 

B a současně m B, 

A > mA, 

A 

Platí-li současně m A B mB, 

B 

(rovnice 90) 

(rovnice 91). 

, < a m B, 

A < m A, 

A nebo m B, 

A > mA, 

A a m A B mB, 

B 

, > , pak 

látky nejsou separovatelné a tvoří stacionární (stabilní) směsnou zónu. Pro určení 

separovatelnosti celé skupiny látek od určité zvolené jednotlivé látky je výhodné a 



názorné použití DEZ. Na následujícím Obrázku 27 je do kontur DEZ z Obrázku 26 

zakreslen bod B odpovídající bázi o mBH = 3.10-4 cm 2 V -1 s -1 a pKBH = 5 migrující 

mezi vedoucí zónou (10 mM-KAc) a zakončující (H3O + ). Křivka 1 je množinou bodů 

(pHX, X X 

m , ) odpovídající takovým bázím, pro než platí m X , B = mB, 

B , tj. mezní případ 

mezi rovnicí (90) a (91). V oblasti nad křivkou je splněna první podmínka rovnice (90) 

a v oblasti pod křivkou první podmínka rovnice (91). Křivka 2 je množinou bodů 

odpovídajících bázím, pro něž platí m B, 

X = m X , X , a tedy v oblasti nad křivkou je 

splněna druhá podmínka rovnice (90) a pod křivkou druhá podmínka rovnice (90). 

Souhrnně platí, že podmínky rovnice (90) jsou splněny pro báze X, jejichž body leží 

v diagramu nad křivkou 1, a podmínky rovnice (91) jsou splněny pro báze, jejichž 

body leží pod křivkou 2. Je vidět, že klasická představa 45 o tom, že zóny 

v izotachoforéze vytvářejí monotónní sled pohyblivostí a pH, platí pouze pro báze 

z oblastí označených B→X a X→B. Přímky 3 a 4, které tyto oblasti vymezují, 

reprezentují rovnosti m B, 

B = m X , X a pHX = pHB. Ve zbývajících oblastech je migrace 

dvojice zón B a X provázena dvěma druhy inverze: 

1. Inverze efektivních pohyblivostí (inv.m); zóna báze X s parametry v oblasti nad 

křivkou 1 a pod přímkou 3 migruje před zónou báze B, zároveň však 

platí m B, 

B > m X , X , tj. zóna báze s nižší efektivní pohyblivostí migruje před zónou 

m 

báze s vyšší efektivní pohyblivostí. Analogicky, avšak v opačném migračním 

Mix 

Inv.m 

Inv.pH 

Inv.pH 

Inv.m 

Mix 

pořadí bází je tomu 

pro oblast pod 

křivkou 2 a nad 

přímkou 3. 

Obrázek 27 

Diagram existence zón 

pro vedoucí elektrolyt 10 

mM-octan draselný 

s vyznačením zóny báze 

B o mBH=30.10-5 cm2 V- 

1 s-1 a pKBH = 5. Jsou 

vyznačeny oblasti 

migrace B před X 



(X→Y), B za X (Y→X), inverze pH (inv.pH) a inverze pohyblivostí (inv.m) a existence 

směsných zón (Mix). 

2. 

Inverze pH (inv. pH); v oblasti nad křivkou 1 a vlevo od přímky 4 jsou splněny 

podmínky rovnice 

(90), tj. zóna báze X migruje před zónou B; zároveň však platí 

pHB > pHX. 

Zóna o nižším pH tedy migruje před zónou s vyšším pH. Analogicky tomu je pro 

opačné pořadí v oblasti pod křivkou 2 vpravo od přímky 4. Případy inverze 

efektivních pohyblivostí byly pozorovány již dříve a nazývány „vynucená 

izotachoforéza“ (enforced isotachophoresis 1, 9 ). Jak vyplývá z teorie, inverze 

efektivních pohyblivostí je v těchto případech přirozeným jevem a název vynucená 

izotachoforéza není adekvátní. Na základě této teorie lze vytvořit kuriózní operační 

systémy, které vůbec neodpovídají klasickým představám. Na Obrázku 28 (A) je 

v systému 2,8 mM-PapAc (vedoucí elektrolyt) a 5 mM-HAc (zakončující elektrolyt) 

uveden záznam separace směsi anilinu (Ani) a EACA. V tomto neobvyklém 

operačním systému mají vedoucí (Pap + ) i zakončující (H3O + ) ion stejnou efektivní 

pohyblivost ve svých zónách. Anilin vykazuje inverzi efektivní pohyblivosti vzhledem 

k vedoucí zóně a EACA vzhledem k terminátoru. V systému s vedoucím elektrolytem 

2 mM-PapAc a zakončujícím 5 mM-HAc vykazují všechny 

tři složky vzájemnou 

inverzi efektivních pohyblivostí (viz Obrázek 28 B). 

Obrázek 28 

Experimentální ukázka inverze efektivních 

pohyblivostí vzhledem k vedoucí a koncové zóně 

(A) 

a úplné inverzi mobilit (B). 



Tato ukázka zcela neguje klasické představy o pořadí zón v izotachoforéze a 

dokládá existenci operačního systému, ve kterém jsou zóny seřazeny s klesajícím 

gradientem elektrického potenciálu, tj. rostoucími efektivními pohyblivostmi. 

Vynucená izotachoforéza je v těch případech, kdy látka poskytuje v určitém 

operačním systému izotachoforetickou zónu jen díky jiné zóně a samotná by 

v systému izotachoforeticky nemigrovala. Např. 

TBA jako silná, pomalá báze, pro 

kterou neplatí podmínka ostrého rozhraní ( 

m B H mH 

, H 

, > ) její zóny se zakončující 

zónou H3O + a tedy sama nemigruje. Může však migrovat před zónou slabé pomalé 

báze (Ala), která 

přirozeně migruje před terminující H3O + s inverzí efektivních 

pohyblivostí. 

Obrázek 29 

Experimentální záznam nekorektní migrace TBA 

(a) a vynucená korektní migrace přítomností slabé 

báze (b). V obou případech použit 5 mM-KAc + 3 

mM-HAc jako 

vedoucí elektrolyt a 5mM-HAc jako 

terminátor. 

Z Obrázku 27 je vidět, že v DEZ existují ještě 

oblasti označené 

Mix ležící mezi křivkami 1 a 2, kde platí současně m B, 

B > m X , B a 

m X X mB, 

X 

, > . Zde báze B a X tvoří tzv. stacionární (stabilní) 

směsnou zónu, která se 

chová jako zóna jediné látky s efektivní pohyblivostí 

m B, 

mix = m X , mix a jednou určitou 

hodnotou pHmix směsné zóny dané vztahem 26 

pH 

mix 

= pK 

XH 

⎛ m 

⎜1 

− 

⎜ m 

+ log 

⎜ m 

⎜ 

⎝ m 

XH 

BH 

XH 

BH 

⋅ K 

⋅ K 

−1 

XH 

BH 

⎞ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎟ 

⎠ 

(rovnice 92). 



Rovnovážná směsná zóna určité dvojice látek X a B může existovat v celé 

definované oblasti pH vedoucího elektrolytu, přičemž pH směsné zóny zůstává v celé 

této oblasti konstantní. Takové dvojice látek pak nelze z principu samého navzájem 

separovat. Tato podmínka je však splněna pouze při jednom konstantním poměru 

obou látek. To znamená, že při odlišném dávkovacím 

poměru obou látek se ta 

z nich, která je vzhledem k uvedenému poměru v přebytku, odděluje v množství 

odpovídajícímu tomuto přebytku jako čistá zóna. 

Pokud ve zkoušeném operačním systému nejsou splněny všechny požadavky (viz 

kapitola 4), je nutné hledat jiný elektrolytový systém. 

Může nastat případ, že sledované látky jsou z principu separovatelné, ale nelze 

dosáhnout jejich úplné separace v důsledku překročení separační kapacity 

systému. 

V případě, že objem vzorku vzhledem k citlivosti 

již nelze snížit, situaci lze řešit tak, 

že se buď zvýší separační kapacita nebo 

hledá jiný operační systém. 

4.3 Optimalizace analýzy 

Jak již bylo uvedeno dříve, optimalizaci podmínek analýzy provádíme zpravidla 

v případě rutinní analýzy. Pod pojmem optimalizace se rozumí nalezení takových 

podmínek analýzy, za kterých jsou získávány v konkrétních případech reálných 

vzorků spolehlivé výsledky při minimálních nákladech na analýzu. Optimalizace 

separačních podmínek představuje podstatnou část práce při izotachoforetické 

analýze dané směsi látek. Často je výhodnější pracovat se dvěma nebo více 

operačními systémy namísto obtížného hledání jen jednoho systému. Základní 

veličinou rozhodující o míře a kvalitě separace je efektivní pohyblivost látek. 

Nejběžněji se změny efektivní pohyblivosti dosahuje u slabých kyselin a bází změnou 

pH vedoucího elektrolytu, v ostatních případech tvorbou 

komplexů a asociátů, 

použitím směsných rozpouštědel a různých aditiv. Tyto 

jednotlivé způsoby budou 

nyní podrobněji probrány v následujících kapitolách. 

4.3.1 Využití acidobázických rovnováh 

V případě slabých kyselin nebo bází je stupeň jejich ionizace a tedy i efektivní 

pohyblivost (viz rovnice (17)) závislé na pH prostředí, v izotachoforéze tedy na pH 



příslušné zóny. Hodnota pH zóny vzorku závisí na pH vedoucího elektrolytu (viz 

Matematický model), čehož se právě využívá při ovlivňování pohyblivosti pomocí 

změn pH vedoucího elektrolytu. Ovlivňování efektivní pohyblivosti slabých kyselin či 

bází pomocí pH provádíme v případě látek, které mají velmi blízkou limitní 

pohyblivost a tyto látky je tedy obtížné separovat, budou-li plně disociovány. 

Závislost efektivní pohyblivosti na pH zóny pro slabou jednosytnou kyselinu je 

znázorněna na Obrázku 30. Je vidět, že efektivní pohyblivost 

m A nabývá 50% 

hodnoty limitní pohyblivosti mA při pH = pK. Při hodnotě pH = pK-1 je efektivní 

pohyblivost již 10 % limitní a naopak při pH = pK+1 je m A 90 % limitní pohyblivosti. 

Z tvaru křivky je zřejmé, že nejvýraznější ovlivňování efektivní pohyblivosti je při 

hodnotě pH blízké pK (největší směrnice). A tedy pro dvě látky s blízkou limitní 

pohyblivostí, ale odlišnou hodnotou pK je zpravidla 

dosaženo v těžišti pK hodnot 

separovaných látek. Analogická situace je u slabý ch bází s tím, že 10% ionizace 

báze je při pH=pK+1 a 90% při pH = pK–1. 

m 

m 

A 

A 

1 

0,5 

0 

pKHA-1 pKHA pKHA+1 

Obrázek 30 

t relativní efektivní 

ohyblivosti A A m 

Závislos 

p m / na pH pro 

slabou jednosytnou kyselinu HA. 

Existuje několik způsobů volby 

optimálního pH vedoucího 

elektrolytu. První postup spočívá 

v použití tabelovaných dat 

relativních efektivních pohyblivostí 

v závislosti na pH vedoucího 

elektrolytu. Pro separované složky sestrojíme takovouto závislost (tzv. 

izotachoforetická křivka pohyblivosti – viz Obrázek 31) a jako optimální pH vedoucího 

elektrolytu zvolíme takové, pro které je největší rozdíl v relativní pohyblivosti pro 

pH 

sledované složky. V případě uvedeném na obrázku je maximální separace dosaženo 

při pHL = 3. Pro uspokojivou separaci dvou látek uvádí autoři tabelovaných dat 

minimální rozdíl RE = 0,15. 



Další způsob, jak určit efektivní pohyblivost látek, je simulačním výpočtem, avšak pro 

tento postup je nezbytný příslušný program sestavený například na základě 

matematického modelu ustáleného stavu (viz kapitola 2.3). Detailní popis výpočtu 

1, 17 

však jde mimo rámec této práce a lze jej nalézt v příslušné literatuře . Pokud pro 

analyzované složky nejsou dostupná 

potřebná fyzikálně-chemická data, je nutné 

izotachoforetické křivky zjistit experimentálně, 

a to tak, že provedeme analýzy dělené 

směsi 

za použití vedoucích 

elektrolytů o různém pH. 

Obrázek 31 

Závislost relativních efektivních 

pohyblivostí na pH vedoucího 

elektrolytu. RE je výška 

izotachoforetické vlny a je 

definovaná jako intenzita 

elektrického pole v dané zóně 

vztažená 

na intenzitu pole ve 

vedoucí 

zóně (pro chlorid jako 

vedoucí ion je RE = 1). 

Vliv pH vedoucího elektrolytu na separaci silných kyselin nebo bází je zpravidla 

minimální a je nutné pro tyto účely využít jiných způsobů. 

4.3.2 Využití tvorby komplexů a asociátů 

v předešlé kapitole, tvorby komplexů a asociátů se využívá pro silné kyseliny a báze, 

jako v předešlém případě s tím rozdílem, že efektivní pohyblivost neovlivňujeme 

pomocí pH vedoucí zóny, ale volbou vhodné komplexující částice a její koncentrace. 

Při 

ovlivňování efektivních pohyblivostí využitím komplexotvorných (nebo 

asociačních) reakcí je nutné mít na paměti několik zásad: 

RE 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

Ftalová 

o.toluová 

benzoová 

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 

pHL 

Zatímco při separaci slabých kyselin a zásad je nejsnazším ovlivněním jejich 

efektivní pohyblivosti změna pH vedoucího elektrolytu tak, jak bylo popsáno 

kationty kovů či vícesytné organické ionty. Postup optimalizace je v principu stejný 



� komplexotvorné (asociační) rovnováhy musí být kineticky labilní, tj. rychle se 

ustavující 

� konstanta stability komplexu (asociátu) nemá být příliš velká, aby to nevedlo 

k zabrzdění či dokonce k reverzi směru 

migrace komplexu; v některých případech 

se však úmyslně silné konstanty stability využívá (stanovení železa ve formě 

záporně nabitého komplexu s EDTA) 

� komplexotvorná látka se nesmí zúčastňovat nežádoucích vedlejších reakcí, 

jako je srážení, hydrolýza apod. 

� přídavek komplexotvorné 

látky by neměl podstatně snížit pufrační kapacitu 

operačního systému (zvláště při separacích, kdy se současně separují anionty 

podle pK hodnot). 

Například použitím vícemocného protiiontu se prohloubí brzdící efekt iontové 

atmosféry pohybující se proti separovaným iontům. Přídavek dvojmocného kationtu 

BTP do vedoucího elektrolytu vede k separaci dusičnanů od síranů. Stejný účinek 

má tento protiion na separaci kyseliny jablečné (náboj -2) od citronové (náboj –3) 

nebo myo-inositolfosfátů (viz Obrázek 32) při neutrálním pH. Pomocí komplexujícího 

účinku síranu lze separovat alkalické kovy a kovy alkalických zemin, přídavkem α- 

hydroxymáselné kyseliny lze separovat kovy vzácných zemin a těžké kovy. 

Přídavkem symetrického 18-crown-6 etheru do vedoucího elektrolytu je možné 

separovat amonný ion od draselného. Stejného efektu se dosáhne použitím 

nesymetrického polyethylenglykolu, avšak při řádově 

vyšší koncentraci. 

RSH 

[%] 

140 

120 

100 

80 

60 

40 

20 

IP6 

IP5 

0 

0 1 2 3 4 

Obrázek 32 

Migrační chování fytové kyseliny 

(IP6) 

a myo-inositol pentafosforečné kyseliny 

(IP5) v elektrolytových systémech při 

pH 4,5 s rostoucí koncentrací 

koprotiiontu bis- tris-propanu ve 

vedoucím 

elektrolytu. Relativní výška 

vlny (RSH) je vztažena na výšku vlny 

fosforečnanu 46 . 

CITP v analýze potravin C [mmol/l] 

85 

BTP


Řada látek tvoří s kavitou cyklodextrinů asociáty, čehož lze využít při chirálních 47 

i 

48 

jiných separacích . Separaci anorganických aniontů lze významně ovlivňovat 

přídavkem polyvinylpyrrolidonu 49 do vedoucího elektrolytu. 

4.3.3 Využití nevodných rozpouštědel 

50, 51, 52, 53 

Analýza v nevodných, nebo směsných prostředích se v zásadě neliší od 

izotachoforetických analýz prováděných ve vodě. Jediným předpokladem je, že 

máme k dispozici instrumentaci odolnou vůči použitému rozpouštědlu. 

Souhrnně má 

použití nevodných, nebo směsných rozpouštědel tyto výhody: 

1) selektivní změna pohyblivosti látek, a tím dosažení žádané 

separace, 

2) analýza látek ve vodě prakticky neionizovatelných, 

3) analýza látek ve vodě málo rozpustných nebo nestálých. 

Selektivní změnu pohyblivostí je možno v zásadě provádět několika způsoby, a to: 

(1) změnou limitní iontové pohyblivosti způsobenou rozdílnou solvatací iontů v 

různých rozpouštědlech; (2) změnou pK hodnot kyselin a bází způsobenou 

rozdílnými proteolytickými vlastnostmi použitých rozpouštědel; (3) změnou 

efektivních pohyblivostí látek 

změněnou schopností tvořit komplexy a asociáty s 

použitým 

rozpouštědlem. 

Obrázek 33 

A 

Ovlivnění separace použitím nevodného prostředí 54 . Separace modelové směsi ve vodném (A) 

a methanolickém (B) elektrolytu; analyzátor IONOSEP; A - LE: 5 mM-H2SO4; TE: 10 mMcitran 

lithný, hnací proud 100 µA při detekci snížen na 30 µA; B - LE: 2 mM-toluensulfonová 


B


kyselina TE: 2 mM-Septonex v 99% methanolu, hnací proud 30 µA při detekci snížen na 10 

µA; R – odezva vodivostního detektoru. 

Jako příklad použití nevodného prostředí je ovlivnění pohyblivosti draselných iontů. 

Efektivní pohyblivost amonných a draselných iontů ve vodném prostředí je 

v poměrně širokém rozmezí pH (< 8) velmi blízká a jejich separace je prakticky 

nemožná (vyjma použití 18-crown-6 etheru – viz předešlá kapitola). Na Obrázku 33 

je dokumentován 

vliv nevodného prostředí na separaci draselného iontu od 

amonného. Díky nižší pohyblivosti draselného iontu v methanolu tak lze tyto kationty 

oddělit. 

Z uvedeného vyplývá, že lze značně ovlivnit separaci použitím nevodných 

rozpouštědel. Obecně musí použité rozpouštědlo splňovat několik podmínek. Látky 

v něm rozpuštěné musí tvořit nabité částice, tj. musí být ionizovatelné. Rozpouštědlo 

musí vykazovat dostatečnou chemickou stabilitu, co možná nejnižší vodivost, 

inertnost vůči látkám v něm rozpuštěných a mělo by být dostupné v dostatečně 

čistém stavu, či být snadno čistitelné. Rozpouštědlo by dále mělo mít bod varu 

umožňující bezproblémovou práci za normálních podmínek a nízkou cenu. U 

směsných rozpouštědel je samozřejmě důležitým kritériem i mísitelnost 

složek. Je 

vidět, že potenciální ovlivnění separace použitím nevodných, nebo směsných 

rozpouště del je značné, v praxi však poměrně zřídka využívané. 

4.3.4 Využití dalších vlivů 

Jedním z významných optimalizovaných faktorů, zvláště při tvorbě rutinní 

metody, je 

doba analýzy. Optimalizace v tomto případě představuje minimalizaci času při 

zachování požadovaných charakteristik 

metody (správnost, přesnost, 

opakovatelnost). Minimalizace doby analýzy 

lze dosáhnout jedním z následujících 

postupů, nebo jejich kombinací: 

1. Aplikace vyššího hnacího proudu. 

2. Použití kratší separační kapiláry. 

3. Použití zředěnějšího vedoucího elektrolytu. 

4. Použití rychlejšího zakončujícího iontu a tím možnost aplikace postupu ad 1). 

Řada vzorků obsahuje rychlejší ionty, které však nejsou předmětem našeho zájmu. 

Zvláště pak, je-li obsah těchto rychlých složek velký, nepříjemně to komplikuje 



analýzu. Použití pomalejšího vedoucího iontu tyto rychlejší makrosložky elegantně 

eliminujeme, neboť za takových podmínek migrují volnou elektroforézou a neruší 

izotachoforetickou analýzu. Příkladem může být použití octové kyseliny jako 

vedoucího aniontu, 

analyzujeme-li vzorky s velkým obsahem uhličitanů, které nejsou 

ční limit a taktéž eliminovat některé pomalejší ionty, 

teré jsou mimo náš zájem 55 cílem analýzy. 

Použitím dvou vedoucích iontů (jeden rychlý a druhý pomalý) lze za určitých 

podmínek výrazně snížit detek 

k 

. 


Instrumentace pro kapilární izotachoforézu 

5. Instrumentace pro kapilární izotachoforézu 

Běžně používané přístroje pro elektroforetické separace mají typickou konfiguraci, při 

které je separační jednotka spojená se zdrojem hnacího proudu. Po ukončení 

separace následuje proces detekce, který je obvykle oddělenou fází analýzy. Tak 

jako v případě jiných analytických metod, je i v kapilární izotachoforéze přístrojová 

technika konstruována tak, aby se optimálně využil daný teoretický model 

s minimalizací průvodních nežádoucích jevů. V kapilární izotachoforéze se stává 

detekční systém integrální součástí analyzátoru. Tato konfigurace analyzátoru je 

přirozeným důsledkem snahy o objektivizaci analýzy, minimalizaci počtu operací, 

zkrácení doby analýzy a její automatizaci. Izotachoforetické uspořádání 

elektromigrační separace může být v zásadě realizované v různých stabilizujících 

médiích, jako je papír, tenká vrstva, gel či kapilára, tak jak již bylo uvedeno v kapitole 

2.1.4. Použití kapilár jako stabilizujícího prostředí začalo v izotachoforéze a odtud se 

rozšířilo na dnes prudce se rozvíjející kapilární elektroforézu. Výhody uspořádání 

izotachoforézy v kapiláře jsou následující: 

� kapilára do vnitřního průměru 1 mm plní funkci stabilizujícího prostředí 

� separace a analytické vyhodnocení je realizované ve volném roztoku, tzn. že 

jsou eliminovány obtížně definovatelné interakce nosič-analyt 

� on-line detekce spojené s registračním a vyhodnocovacím zařízením umožňuje 

kvalitativní i kvantitativní vyhodnocení analýzy 

� roztok je uzavřený, takže je zabráněno jeho odpařování, a tím eliminaci 

nežádoucích důsledků z toho plynoucích 

� elektroosmotický transport materiálu je potlačený výběrem kapilár z vhodných 

materiálů a nebo použitím vhodných aditiv do vedoucího elektrolytu 

� volbou menšího vnitřního průměru lze snižovat detekční limit 

� nízký tepelný výkon v kapilárách menšího vnitřního průměru dovoluje aplikovat 

vysoké proudové hustoty, čímž se dosahuje zkrácení doby analýzy 

� relativně snadná možnost automatizace provozu kapilárního analyzátoru. 



Izotachoforetický analyzátor je možné rozdělit na čtyři základní části, a to: separační 

jednotka, vysokonapěťová jednotka, detekční část, řídící a vyhodnocovací část. Tyto 

jednotlivé části budou v následujících kapitolách popsány podrobněji. 

5.1 Separační část 

Z hlediska analytických parametrů, jako je detekční limit, separační výkon, 

reprodukovatelnost analýz, má prvořadý význam separační jednotka, respektivě 

části, které ji tvoří. V izotachoforéze se používají tzv. uzavřené separační systémy, 

ve kterých je polopropustnou membránou o oddělen prostor kapiláry od elektrodové 

komory s elektrolytem, čímž je zabráněno elektroosmotickému toku kapaliny z 

kapiláry do této komory (viz kapitola 2.4.1). Základní schéma separační jednotky 

jednokapilárového analyzátoru (stejný průřez kapiláry po celé její délce) je 

znázorněno na Obrázku 34. 

Obrázek 34 

Základní (vertikální) uspořádání separační jednotky pro 

izotachoforézu; rezervoár zakončujícího elektrolytu (1), septum pro 

dávkování vzorku mikrostříkačkou (2), dávkovací kohout 

umožňující i dávkování mikrostříkačkou (3), detektor (5), blok pro 

plnění systému vedoucím elektrolytem (6), který je od nádobky 

vedoucího elektrolytu (8) oddělen membránou (7). Elektroda, ke 

které se připojuje vysokonapěťový pól zdroje o požadované polaritě, 

tzn. že při anionické analýze záporný pól a při kationické kladný 

(�), a elektroda (g), ke které se připojuje pól opačný. Plnění 

separační kapiláry (4) vedoucím elektrolytem se provádí stříkačkou 

z místa (le) přes ventil (9) a vzorek se dávkuje v místě (S) pomocí 

mikrostříkačky nebo v místě (S1) naplněním kohoutu s vnitřní 

smyčkou fixního objemu pomocí stříkačky. Toto uspořádání 

umožňuje použití různě dlouhé kapiláry stejného průřezu. 

V současnosti existují 3 základní uspořádání separační 

jednotky z pohledu propojení separačních kapilár, a to: 

� s jednou kapilárou stejného průřezu 

� s jednou kapilárou nestejného průřezu (spojování objemů) 

o celofán je nejčastějším materiálem pro membránu 



� se dvěma kapilárami různého průřezu (spojování kapilár). 

Separační jednotka v uspořádání spojených kapilár p nestejného vnitřního průměru 

umožňuje současné dosažení vysokého separačního výkonu a nízkého detekčního 

limitu a na rozdíl od předchozího typu umožňuje oddělení nežádoucích makrosložek 

mimo analytickou trasu. Tento přístup známý v chromatografii jako dvourozměrná 

chromatografie (column switching) byl do kapilární izotachoforézy zaveden 

Everaertsem a jeho skupinou 56 pro stanovení nízkých koncentrací látek ve složitých 

matricích biologických vzorků. V současnosti se tohoto uspořádání používá pro 

techniku 2D-CITP a kombinaci CITP-CZE (viz kapitola 3.4). Schéma separační 

jednotky spojených kapilár je na následujícím obrázku. 

Obrázek 35 

Separační jednotka na principu spojování kapilár (kolon). 

Označení jednotlivých částí je identické jako na předchozím 

obrázku s tím rozdílem, že části příslušející předseparačnímu 

stupni (silnější kapilára) mají index p a části příslušející 

k analytickému stupni (tenčí kapilára) mají index a. Bifurkační 

blok (blok spojení předseparační a analytické kapiláry) je označen 

(11). 

Ze schématu jsou zřejmé dvě separační trasy, a to: 

1. Rezervoár zakončujícího elektrolytu (1) ⇒ dávkovací 

kohout (3) ⇒ kapilára (4p) ⇒ bifurkační blok (11) ⇒ 

rezervoár vedoucího elektrolytu (8p) 

2. Rezervoár zakončujícího elektrolytu (1) ⇒ dávkovací 

kohout (3) ⇒ kapilára (4p) ⇒ bifurkační blok (11) ⇒ 

kapilára (4a) ⇒ rezervoár vedoucího elektrolytu (8a). Vysokonapěťový pól zdroje 

hnacího proudu je trvale připojený k elektrodě ponořené v roztoku zakončujícího 

elektrolytu. O tom, která ze dvou možných proudových cest (a současně tras 

p Často je používaný výraz spojené kolony (column coupling), který je odvozen od analogické techniky používané 

v chromatografii 



transportu hmoty) je používaná, rozhoduje to, zda je k druhému pólu zdroje 

hnacího proudu připojena elektroda gp nebo ga. Pomocí relé se přepínání elektrod 

gp a ga může časově sladit tak, že z předseparační kapiláry (4p) se do analytické 

kapiláry (4a) dávkuje jen část ionogenních látek původně přítomných 

v analyzovaném vzorku. A když jsou kapiláry 4p a 4a naplněny různými 

vedoucími elektrolyty, lze dosáhnout vyšší selektivity a nízkého LOD. Jestliže jsou 

obě kapiláry naplněny stejným elektrolytem, je možné dosáhnout vyššího 

separačního výkonu než u jednokapilárového uspořádání. Při takovéto analýze 

v první fázi můžeme aplikovat trasou � ⇒ gp vyšší hnací proud bez nežádoucích 

tepelných efektů. V okamžiku, kdy čelo první zóny (= konec zóny vedoucího 

elektrolytu) dosáhne bifurkačního bloku (11), kde jsou spojené kapiláry, 

přepnutím relé se připojí druhý pól zdroje hnacího proudu na elektrodu ga a 

menším hnacím proudem se rozdělené (úplně, nebo z větší části) analyty 

transportují kapilárou 4a k detektoru 5a. Z uvedeného je zřejmé, že technika 

spojování kapilár v izotachoforéze je podobně jako v chromatografii velmi 

efektivní nástroj v analýze komplexních směsí ionogenních látek, jakým potraviny 

nepochybně jsou. 

Pro dávkování vzorku se v izotachoforéze používá nejčastěji dávkovacích kohoutů 

různých konstrukcí. Nejjednodušší dávkovací zařízení je znázorněno na Obrázku 36 

a. Tento systém dávkování je použit v komerčním analyzátoru IONOSEP 900.1 

(výrobce je tuzemská firma RECMAN-laboratorní technika) a jeho hlavní výhodou je 

jednoduchost a snadná a reprodukovatelná výroba. Funkce tohoto dávkovače je 

následující. V prvním kroku se dávkuje vedoucí elektrolyt ve směru (1) a odchází do 

odpadu (4). Následuje dávkování vzorku z kapiláry (3) do odpadu (4) a třetím a 

posledním krokem je dávkování zakončujícího elektrolytu z kapiláry (3) do odpadu 

(4). Tímto způsobem je vzorek uzavřen mezi vedoucí a koncový elektrolyt. Zapnutím 

hnacího proudu ve směru od (3) ⇒ (1) je analýza zahájena. Separace probíhá 

v kapiláře, která je na obrázku ve směru (1). Protože neobsahuje žádné točivé části, 

nedochází prakticky k jeho opotřebení. Díky jednoduchosti jeho konstrukce a funkce 

je velmi snadná automatizace jednotlivých kroků. Jeho nevýhodou je oproti dalším 

typům ventilů nižší reprodukovatelnost nástřiku (RSD ≈ 1 %). 



Čtyřcestný dávkovací kohout (viz Obrázek 36 b) pracuje tak, že v poloze (1) se 

dávkuje vedoucí elektrolyt, v poloze (2) zakončující elektrolyt a v poloze (3) vzorek. 

Po otočení kohoutu do polohy (4) je vzorek umístění v těle kohoutu mezi 

zakončujícím a vedoucím elektrolytem separován v kapiláře (*). 

3 

a 

Obrázek 36 

kapilára 

4 

2 

1 


b 

c d 

* 

* 

* * 

Dávkovače pro kapilární izotachoforézu. Dávkovač bez točivých částí (a), čtyřcestný kohout 

(b), šesticestný kohout (c) a kombinovaný kohout (d). 

Princip funkce šesticestného kohoutu je zřejmý z Obrázku 36 c. V poloze A se 

současně dávkuje přes separační kapiláru vedoucí elektrolyt (cesta 4 ⇒ 3), vzorek 

(cesta 5 ⇒ 2) a zakončující elektrolyt (cesta 6 ⇒ 1). V poloze kohoutu B je po 

spuštění hnacího proudu zahájena separace, která probíhá v kapiláře (4). Na


podobném principu pracuje dávkovací kohout, kterým byl vybaven analyzátor 

Agrofor, vyráběný v letech 1985 až 1990 v JZD Odry Krmelín. 

Kombinovaný dávkovací kohout umožňuje současné dávkování vzorku do těla 

kohoutu a mikrostříkačkou přes septum. Jeho funkce je zřejmá z Obrázku 36 d. 

V poloze kohoutu A se plní vedoucím elektrolytem, jehož přebytek odchází do 

odpadu. Současně lze v této poloze plnit tělo kohoutu vzorkem ve směru (S). Po 

otočení do polohy B se z rezervoáru zakončujícího elektrolytu, který je umístěn nad 

kohoutem, vypustí část elektrolytu přes kohout do odpadu a v poloze D, nazývané 

pracovní, lze ještě dávkovat vzorek mikrostříkačkou (S). Po spuštění hnacího proudu 

ve směru od (te) ⇒ (le) je analýza zahájena. Separační kapilára se nachází ve směru 

(le). Tímto kohoutem jsou vybaveny analyzátory se spojenými kapilárami, které 

vyrábí slovenská firma Villa - Labeco. Výhoda kombinovaného kohoutu spočívá 

v tom, že lze snadno provádět kalibrační analýzy (různě velké nastřikované objemy 

zásobního standardního roztoku o jedné koncentraci) a dále lze snadno provádět 

technika standardního přídavku, kdy se provede analýza vzorku dávkovaného pouze 

do těla kohoutu a poté se provede analýza, kdy se dávkuje do jeho těla vzorek a přes 

septum mikrostříkačkou známý roztok standardu. 

Separační část bývá vyrobena z organického skla nebo teflonu. Výhodou 

organického skla je zejména: 

� snazší výroba částí vyžadujících dodržení rozměrů s vysokou přesností 

� průhlednost a tím možnost vizuální kontroly celé separační trasy. 

Další výhodou je nižší cena separační jednotky, jednak díky nižší ceně materiálu a 

také snazší zpracovatelnosti organického skla než teflonu (zvláště při vrtání 

submilimetrových otvorů). Jeho značnou nevýhodou je omezené použití na vodná 

případně směsná rozpouštědla s omezeným obsahem q organické složky. 

Naproti tomu teflonová aparatura může díky značné inertnosti teflonu vůči 

chemikáliím pracovat ve vodných i nevodných prostředích. 

q maximálně 50 % MeOH, 25 % EtOH nebo 25 % acetonu; u dalších rozpouštědel je vhodné provést pokus 

uspořádaný tak, že se na několik dní vloží kousek vyleštěného organického skla do zkoumaného rozpouštědla 

a pokud se povrch zmatní, nemůžeme dané rozpouštědlo použít 



Separační část může být termostatována celá (zejména vzduchem), nebo pouze ta 

část, kterou během analýzy protéká proud a je tedy zahřívána. Termostatování má 

však význam pouze při analýzách termolabilních látek. 

5.2 Zdroj vysokého napětí 

Zdroje vysokého napětí (VN) používané v kapilární izotachoforéze jsou nejčastěji 

konstruovány tak, že umožňují nastavení stejnosměrných hnacích proudů v rozmezí 

1 až 500 µA (plynule nebo skokově) při maximálním napětí do 30 kV. Hnací proud je 

udržován na konstantní hodnotě r nezávisle na elektrickém odporu v separační 

kapiláře. V souladu s principem CITP během analýzy napětí zdroje vzrůstá. Dojde-li 

při separaci k přerušení sloupce elektrolytu, většinou vlivem přehřátí roztoků 

elektrolytů v kapiláře bublinkou uvolněného rozpuštěného plynu, dojde v místě 

bublinky ke vzniku elektrického oblouku, a tím k poškození povrchu kapiláry, nebo 

dokonce k jejímu přetavení. Proto je zdroj vybaven přepěťovou ochranou 

nastavitelnou od 6 do 30 kV. Vzhledem k tomu, že se teflonová kapilára snadno 

přetaví, vyskytne-li se elektrický oblouk při napětích nad 15 kV, není vhodné tuto 

přepěťovou ochranu nastavovat na vyšší hodnotu. VN zdroje bývají dále vybaveny 

proudovou ochranou, tzn. že při proudu vyšším než nastavená maximální hodnota 

dojde k odpojení VN zdroje. Tato ochrana je proti doteku obsluhy přístroje, případně 

proti zkratu díky mechanickému poškození (vytečení elektrolytu) některé části 

separační jednotky. 

Změna polarity je u starších VN zdrojů mechanická (přehození přívodních kabelů 

z VN zdroje k elektrodám), u nových analyzátorů je elektronická, tj. polarita se 

přepíná uvnitř VN zdroje z ovládacího panelu analyzátoru nebo příkazem v programu 

ovládajícím analyzátor. 

r kolísaní proudu musí být minimální (< 0,1 %), neboť negativně ovlivňuje kvantitativní analýzu 



5.3 Detekční část 

Detekční systémy používané v izotachoforéze lze rozdělit podle různých kritérií, ale 

nejvhodnější dělení je podle skupiny látek, na které detektor reaguje. Podle tohoto 

hlediska rozlišujeme detekční systémy (detektory) na: 

� univerzální, 

� selektivní a 

� kombinované. 

Univerzální detektory jsou takové, jejichž odezva je v přímém vztahu k efektivní 

pohyblivosti detegované látky. Odezva selektivních detektorů souvisí s jinými 

fyzikálně-chemickými vlastnostmi detegovaných látek. Kombinované detekční 

systémy umožňují univerzální i selektivní detekci. 

Detektory je možné rozdělit také podle kontaktu senzorů detekčního systému 

s měřeným roztokem na: 

� kontaktní a 

� bezkontaktní. 

Je logické, že z hlediska možných nežádoucích interferencí mezi analytem a čidlem 

detektoru jsou výhodnější bezkontaktní detektory. Velmi důležitou charakteristikou 

detekčních systémů je rozlišovací schopnost, tj. schopnost detegovat velmi krátké 

zóny (~ 0,1 mm). Schémata detektorů používaných či použitelných v kapilární 

izotachoforéze jsou uvedeny na Obrázku 37. Prvním detektorem použitým v kapilární 

izotachoforéze byl termodetektor s (viz Obrázek 37 a). Konstrukce detektoru je velmi 

jednoduchá a spočívá v tom, že na vnější stěnu kapiláry je upevněn termočlánek. 

Odezva detektoru souvisí přímo s principem izotachoforézy, neboť teplota v zónách 

se mění skokem a podél zóny je konstantní (viz kapitola 2.1.4). Pro malou podélnou 

rozlišovací schopnost a neostré vlny na záznamu se termodetektor již nepoužívá. 

V současnosti se používají tři typy univerzálních detektorů založených na měření 

gradientu elektrického pole a vodivosti. Kontaktní vodivostní detektor (viz Obrázek 37 

b) je konstruován tak, že elektrodami (platinový drátek nebo ze slitiny Pt-Ir) 

s pomineme-li použití refraktometrického detektoru v experimentech Konstantinova 5 



umístěnými ekviplanárně a stýkajícími se s roztokem na úrovni vnitřní stěny kapiláry, 

se měří vysokofrekvenčním střídavým proudem vodivost. Konstrukce detektorů 

gradientových (viz Obrázek 37 c) je podobná předchozí s tím rozdílem, že se 

používá stejnosměrného proudu. Odezva detektoru je přímo úměrná intenzitě 

elektrického pole v zónách, a tedy pohyblivosti. Posledním současně používaným 

typem detektoru je bezkontaktní vysokofrekvenční vodivostní detektor (viz Obrázek 

37 d). Má oproti výše jmenovaným detektorům tu výhodu, že elektrody (čtyři čidla 

vzájemně v úhlu přesně 90°) se přímo nestýkají s roztokem, a tedy nemůže docházet 

k nežádoucím interakcím analytu s elektrodou. 

Obrázek 37 

Přehled univerzálních (I) a 

selektivních (II) detektorů 

používaných v kapilární 

izotachoforéze; a – teplotní 

detektor (1 - termočlánek nebo 

mikrotermistor); b – kontaktní 

vodivostní detektor (2 – elektrody 

detektoru); c – kontaktní 

gradientový detektor (2 – elektrody 

detektoru); d – bezkontaktní 

vodivostní detektor (3 – elektrody 

detektoru); e – fotometrický 

detektor (5 – zdroj světla, 6 – 

štěrbina, 7 – interferenční filtr, 8 – fotočidlo); f – radiometrický detektor (8 – fotočidla, 12 – 

plastický scintilátor); g – fluorimetrický detektor (9 – zdroj světla, 10 – excitační filtr, 11 – 

emisní filtr, 6 – štěrbina, 8 – fotočidlo). 

Toto přináší tu výhodu, že elektrody nejsou znečisťovány a odezva detektoru není 

zkreslována, jak tomu bývá u kontaktních detektorů. Jeho nevýhodou je nižší 

podélná rozlišovací schopnost, což znamená i horší detekční limit. Minimální délka 

vlny detegovatelná kontaktním vodivostním detektorem je asi 0,1 mm, zatímco 

bezkontaktním je to asi troj- až pětinásobek. 

Ze selektivních detektorů je nejrozšířenější fotometrický (zejména v oblasti UV), který 

je schematicky znázorněn na Obrázku 37 e. Jako zdroj světla je nejčastěji používána 

bezkontaktní vysokofrekvenčně buzená výbojka (jodová, rtuťová) a vlnová délka je 



určena pomocí interferenčního filtru. Aby se do kapiláry dostalo co nejvíce světla, 

používá se pro zaostření paprsků safírová kulička umístěná mezi interferenčním 

filtrem (viz Obrázek 37, f12) a kapilárou. Minimální detegovatelná délka zóny je dána 

šířkou štěrbiny a LOD je v příznivých případech řádu 10 -9 mol/l. 

K detekci radioaktivních a radioaktivně označených látek byl zkonstruován detektor 

pro β-zářiče typu 35 S nebo 32 P (Obrázek 37 f). I pro detekci slabých zářičů, jako je 14 C 

nebo 99 Tc, je možné použít tohoto detektoru vyvinutého v 80. letech v Ústavu jaderné 

techniky v Košicích ve spolupráci s Universitou Komenského v Bratislavě 57 . 

Senzorem radioaktivního záření je v případě tohoto detektoru část kapiláry 

zhotovená z plastického scintilátoru a zářením generované světelné záblesky jsou 

detegované fotonásobičem. Detekční limit pro 14 C je 7 pmol, což při běžných 

dávkovaných objemech představuje koncentraci 10 -7 až 10 -8 mol/l. 

Fluorimetrický detektor (Obrázek 37 g) je velmi rozšířen v kapilární elektroforéze, 

avšak v izotachoforéze nebyl použit, přestože je principálně jeho použití možné. 

Nejnižšího detekčního limitu bylo dosaženo použitím laserem indukovaného 

fluorimetrického (BioFocus LIF 2 od firmy BioRad) detektoru při analýze značených 

fragmentů DNA 58 metodou kapilární elektroforézy. Absolutní detegovatelné množství 

odpovídalo 4 zmol (=zeptamol), tj. 4 x 10 -21 mol, což představuje asi 2500 molekul. 

Amperometrický detektor pro použití v kapilární izotachoforéze zkonstruoval 

Kaniansky 59 . Pro minimalizaci rušivých vlivů hnacího proudu na odezvu detektoru byl 

použit post-kolonový galvanicky oddělený chemický detektor. Separované analyty 

byly do detektoru transportovány hydrodynamicky. Dosažený detekční limit 10 -7 mol/l 

je srovnatelný s LOD běžně dosažitelným fotometrickým detektorem. Pro další 

těžkosti spojené s rozmýváním rozhraní zón během hydrodynamického transportu 

nenalezl tento způsob detekce uplatnění. 

Velmi užitečný detekční systém vznikne kombinací univerzálního a selektivního 

detektoru. Selektivní detektor podá doplňující informaci o vlastnostech zóny 

detegované univerzálním detektorem a v mnoha případech je tato informace natolik 

cenná, že pouhý údaj univerzálního detektoru je ve srovnání s ní téměř bezcenný. 


5.4 Řídící a vyhodnocovací část 


Řídící jednotka umožňuje naprogramovat a řídit průběh celé analýzy a 

vyhodnocovací část kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení analýzy. Řídící část 

starších analyzátorů umožňovala na panelu jednotky nastavit požadované hodnoty 

hnacího proudu, dobu, po kterou budou aplikovány, případně u analyzátoru se 

spojenými kapilárami i přepínaní proudů mezi kolonami. U přístrojů, jejichž separační 

jednotka byla vybavena termostatem kapiláry, umožňovala řídící jednotka nastavení 

a automatické udržování teploty. Vzhledem k tomu, že na přelomu 70. a 80. let 

nebyla výpočetní technika na potřebné úrovni příliš rozšířena, vyhodnocovací část 

spočívala pouze ve spuštění či zastavení registračního zařízení (zapisovače, později 

integrátoru) připojeného na výstup detektoru(ů). Vzhledem k relativní jednoduchosti t 

vyhodnocení izotachoforetické analýzy nebyl požadavek automatizace vyhodnocení 

analýzy tolik potřebný jako u chromatografických technik. Toto uspořádání se 

používalo až do začátku 90. let, kdy řídící i vyhodnocovací část byly integrovány a 

obě činnosti řízeny počítačem vybaveným vhodným programem. Toto uspořádání se 

používá do dnešní doby. 

5.5 Komerční analyzátory 

Nejstarším sériově vyráběným izotachoforetickým analyzátorem je výrobek švédské 

firmy LKB, která v roce 1974 přivedla na trh zařízení 2127 Tachophor. 

Jednokapilárový analyzátor Tachophor umožňoval analýzu kationtů i aniontů ve 

vodném i nevodném prostředí. Výměnná separační kapilára byly termostatována 

vzduchem a detekci zajišťoval kontaktní vodivostní detektor a UV detektor 

s nastavitelnou vlnovou délkou pomocí interferenčních filtrů. Analyzátor byl vybaven 

přídavným zařízením Tachofrac, které umožňovalo izolaci separovaných látek. 

Přístroj byl vyráběn pod stejným názvem až do začátku 80. let, kdy jeho výroba byla 

zastavena. Japonská firma Shimadzu přišla na trh se svým jednokapilárovým 

analyzátorem IP-1B asi rok po firmě LKB. Vybavení přístroje bylo podobné 

Tachophoru s tím rozdílem, že japonský stroj používal potenciálově gradientový 

t pro kvalitativní (výška vlny na záznamu) i kvantitativní (délka vlny) analýzu postačuje obyčejné pravítko 



detektor a termostatování bylo prováděno kapalinou. Dalšími modely firmy Shimadzu 

byly přístroje IP-2A a IP-3A, jejichž separační část byla konstruována na principu 

spojených objemů. Model IP-2A umožňoval použití hydrodynamického protiproudu 

vedoucího elektrolytu a model IP-3A byl vybaven automatickým dávkovačem 

elektrolytů a vzorků. Třetím výrobcem izotachoforegrafů byl od počátku 80. let Ústav 

radioekológie a využitia jadrovej techniky ve Spišské Nové Vsi. Tato firma vyráběla 

analyzátory založené na principu spojených kapilár. Přístroj byl zkonstruován ve 

spolupráci s odborníky z University Komenského v Bratislavě (Dr. D. Kanianský) 

podle prototypu postaveného koncem 70. let Dr. Everaertsem na Universitě 

v Eidhovenu. První model ZKI 01 byl vybaven pouze dvěma kontaktními vodivostními 

detektory, později byl doplněn o UV detektor pracující na dvou vlnových délkách (254 

a 289 nm). Analyzátor umožňoval práci pouze ve vodných, případně směsných 

rozpouštědlech. Další model v řadě ZKI 02 byl již standardně osazován všemi třemi 

detektory. Fotometrický detektor byl koncem 80. let rozšířen o filtr 405 nm. 

V současnosti vyráběný model EA 100 má vybavení shodné s předchozími modely 

s tím rozdílem, že řízení a vyhodnocování analýzy je prováděno pomocí počítače. 

Podrobněji se o tomto analyzátoru zmíním v příslušné kapitole. 

V polovině 80. let švédská firma Itaba přišla na trh s jednokapilárovým analyzátorem 

Tachophor δ. Přestože jde o název podobný výrobkům firmy LKB, jde zcela o odlišný 

přístroj. Tento analyzátor umožňoval plně automatickou analýzu až 60 vzorků a byl 

vybaven kontaktním konduktometrem a fotometrem s volitelnou vlnovou délkou (206 

– 530 nm). Vyhodnocení analýz obstarával připojený integrátor Spectra-Physics 

4270. 

V roce 1985 byla v JZD Odra v Krmelíně zahájena výroba jednokapilárového 

analyzátoru Agrofor vybaveného vodivostním detektorem a umožňujícím analýzu ve 

vodných či směsných rozpouštědlech. Tento analyzátor byl zkonstruován na 

Universitě Palackého v Olomouci skupinou prof. Stránského. Jeho výroba byla 

ukončena v roce 1989 a celkem bylo za 4 roky vyrobeno 400 ks těchto analyzátorů. 

V roce 1990 byla přidružená výroba JZD Odra privatizována. Nově vzniklá firma 

Recman - laboratorní technika od roku 1993 vyrábí poloautomatický jednokapilárový 

analyzátor IONOSEP 900.1. 


5.5.1 IONOSEP 900.1 


Vývoj plně automatického analyzátoru IONOSEP 900.1 byl zahájen v roce 1990. Na 

vývoji spolupracovalo několik subjektů, přičemž moje úloha spočívala v účasti na 

konstrukci separační části analyzátoru, jeho testování a zejména tvorbě aplikací pro 

konkrétní analytické úlohy. Analyzátor byl zaveden do výroby v roce 1993 a do 

současnosti bylo vyrobeno více než 50 strojů pracujících v tuzemsku a zahraničí. 

Konstrukčně jde o poloautomatický jednokapilárový analyzátor se spojenými objemy. 

Je vybaven vysokofrekvenčním bezkontaktním konduktometrem a díky teflonové 

separační části umožňuje analýzy ve vodných i nevodných prostředích. Kapilára 

vnitřního průměru 0,5 mm je výměnná a minimální délka je 100 mm. Dávkování 

vzorku je zajišťováno vnitřním smyčkou (dávkovač bez točivých částí – viz Obrázek 

36 a) s fixním objemem ca 20 µl. Elektrolyty i vzorek jsou dávkovány automaticky 

pomocí peristaltických čerpadel. VN zdroj je konstruován až do napětí 30 kV, avšak 

z důvodů již dříve uvedených (kapitola 5.2) je přepěťová ochrana nastavena na 15 

kV a proudová ochrana na 500 µA. Hnací proud je plynule nastavitelný v rozmezí 1 

až 256 µA po 1 µA. Změna polarity je manuální pomocí speciálního přepínače na 

zadní straně analyzátoru. Lze 

pracovat pouze v režimu 

kvalitativní analýzy, kdy se 

provede identifikace analytu 

podle výšky vlny. Kvantitativní 

analýzu lze provádět metodou 

vnějšího (až 20 analytů na deseti 

koncentračních úrovních) i 

vnitřního standardu (až tři vnitřní 

standardy). 

Obrázek 38 

Izotachoforetický analyzátor IONOSEP 900.1. 



Analyzátor je dodáván se souborem 70 aplikačních listů obsahujících konkrétních 

metodik z oblasti analýzy potravin, krmiv a farmacie. Analýza i její vyhodnocení je 

řízeno osobním počítačem. Analýza může být prováděna při dvou různých hnacích 

proudech, které jsou automaticky měněny podle zadaného programu. Na počátku 

analýzy, kdy se separované látky nacházejí v širší části separační trasy (vnitřní 

průměr ca 1 mm), se aplikuje větší hnací proud. Když separované látky dosáhnou 

kapiláry s menším vnitřním průměrem, hnací proud se automaticky sníží a při tomto 

proudu se provádí i sběr dat z detektoru. Použitím dvou různých hnací proudů se 

výrazně zkrátí doba analýzy. Obvyklý poměr počátečního proudu a proudu při 

detekci je 2 – 4 : 1. Analyzátor umožňuje automaticky provádět opakovanou analýzu 

jednoho vzorku. Tato možnost je výhodná při zjišťování opakovatelnosti analýzy 

v rámci vývoje nové metody. Program pro řízení a vyhodnocování analýzy (pracující 

v systému MS DOS nebo OS/2) umožňuje nastavení podmínek analýzy a kvalitativní 

i kvantitativní vyhodnocení analýz. 

Nároky na výkon řídícího počítače jsou minimální, neboť postačuje PC AT 386, 640 

kB RAM, pevný disk, disketová jednotka 3,5“ a VGA monitor. Současná cena 

analyzátoru je včetně programu (bez osobního počítače) a základního příslušenství 

170 000,- Kč. 

5.5.2 Elektroforetický analyzátor EA 100 

Tento analyzátor se spojenými kapilárami, který v současnosti vyrábí slovenská firma 

Villa Labeco s.r.o. ze Spišské Nové Vsi, umožňuje provádění analýz na principu 

CITP, 2D-CITP, CZE a CITP-CZE. Po osazením speciálním kohoutem lze provádět 

mikropreparativní izotachoforézu. Vzhledem ke konstrukci separační části (organické 

sklo) je možné provádět analýzy ve vodných nebo směsných prostředích. Přístroj je 

standardně vybaven dvěma vyměnitelnými FEP kapilárami – předseparační a 

analytickou o vnitřním průměru 0,8, respektivě 0,3 mm a dvou různých délkách (90 a 

160 mm). Tyto kapiláry ve spojení se speciálním dávkovačem (viz Obrázek 36 d) o 

fixním objemu ca 30 µl se používají pro analýzy v módech CITP, CITP-CITP, 2D- 

CITP a CITP-CZE. Dále je vybaven kapilárou o vnitřním průměru 0,2 mm (délka na 

přání), která se používá pro CZE nebo CITP-CZE analýzy. Při práci v módu CZE je 



výhodné použít keramický dávkovací kohout o objemu 200 nl, který je stejně jako 

posledně zmíněná kapilára součástí doplňkové výbavy analyzátoru. Detekce je 

zajišťována dvěma kontaktními konduktometry (na předseparační a analytické 

kapiláře) a jedním UV-VIS detektorem pracujícím na 254, 280 a 405 nm, kterým je 

osazena analytická kapilára. Zdrojem světla je nízkotlaká rtuťová nebo jodová 

výbojka. VN zdroj umožňuje nastavení hnacího 

proudu v rozmezí 0 až 500 µA (po 2 µA) a je 

vybaven nastavitelnou přepěťovou ochranou 

v rozmezí 6 až 16 kV. Přepínaní polarity je 

elektronické pomocí řídícího programu, který je 

součástí standardní výbavy analyzátoru. 

Program dodávaný s analyzátorem (pracující 

v systému MS DOS nebo Windows) umožňuje 

nastavení podmínek, řízení a kvalitativní i 

kvantitativní vyhodnocení analýz. Program pracující v systému MS DOS je ve 

standardní výbavě a program pod Windows na zvláštní objednávku. Nároky na výkon 

řídícího počítače jsou pro DOS program shodné jako u analyzátoru IONOSEP 900.1, 

zatímco program pod Windows vyžaduje výkonnější PC – minimálně PC AT 486 

DX2, 8 MB RAM, pevný disk, disketová jednotka 3,5“ a VGA monitor. Tento 

analyzátor je pod označením ItaChrom EA 101 distribuován firmou Merck, která jej 

standardně dodává s řídícím software pro Windows. 



Obrázek 39 

Elektroforetický analyzátor EA 100. Detail separační části (vlevo) a stanice EA 100 (nahoře). 


6. Aplikace CITP v analýze potravin 

Aplikace CITP v analýze potravin 

Kapilární izotachoforéza má v ČR velmi dobré odborné i přístrojové zázemí. V oblasti 

analýzy potravin je nejvíce používána pro stanovení organických kyselin, dusičnanů 

a konzervačních látek benzoové a/nebo sorbové kyseliny. Je třeba si ovšem 

uvědomit, že kapilární izotachoforéza jakožto separační metoda umožňuje vhodnou 

volbou podmínek (elektrolytového systému) řešit naprosto odlišné analytické úkoly a 

z toho plyne možnost rozšíření této metody na mnohem větší okruh aplikací v oblasti 

kontroly potravin, než je tomu dosud. Zákon č. 110/1997 Sb., z 1.9. 1997 o 

potravinách a tabákových výrobcích ukládá výrobcům potravin v §3 povinnost zajistit 

pravidelné posuzování shody vyráběných potravin s požadavky technickými a 

zdravotní nezávadnosti. Připravovaná vyhláška klasifikuje potraviny podle 

jednotlivých komodit a vymezuje okruhy sledovaných vlastností. Uvedená 

technologická a chemická kriteria představují široké spektrum analýz, které budou 

výrobci nuceni sami provádět nebo zadávat. Další požadavky na chemická vyšetření 

vyplývají také z komoditních vyhlášek k zákonu, které definují požadavky na 

jednotlivé druhy potravinářských výrobků. Řada analytických postupů je dána ČSN, 

jsou postupně přejímány normy EU, u speciálních analytů, např. prokazování obsahu 

svalové bílkoviny v šunkách nejsou zatím dostatečně popsány vhodné analytické 

postupy. Podobná situace je také v oblasti vývoje a zavádění metod k ověřování 

autenticity potravinářských výrobků, která je také do jisté míry ošetřena vyhláškou o 

prokazování shody a komoditními vyhláškami. Z uvedeného je zřejmé, že 

s postupným zavádění zákona a příslušných vyhlášek budou vzrůstat nároky na 

kontrolní laboratoře a bude potřeba nových rychlých, spolehlivých a levných postupů 

nebo metod alternativních ke klasickým metodám uváděným v normách. Velmi 

perspektivní se v této souvislosti jeví vedle chromatografických metod použití 

elektromigračních postupů, které dosud nenalezly v této oblasti odpovídající 

uplatnění. Díky zcela odlišnému separačnímu principu je CITP komplementární 

technikou HPLC či GLC. Významné je i to, že cena přístrojového vybavení pro 

izotachoforézu je mnohem nižší než instrumentace pro HPLC, GC. Vzhledem k této 



skutečnosti a nízké spotřebě chemikálií jsou náklady na jednu analýzu výrazně nižší 

než v případě HPLC či GLC. Nezanedbatelným atributem CITP je díky malé spotřebě 

chemikálií u nízké zatížení odpadních vod a tím životního prostředí. 

Vybrané základní charakteristiky CITP jsou shrnuty v následující tabulce. Tyto platí 

pro analýzy prováděné na komerčně dostupné instrumentaci. 

TABULKA 8 

Základní charakteristiky kapilární izotachoforézy 

Parametr / Konfigurace Jednokapilárová Spojené kapiláry 

Doba analýzy (min) 5 – 60 5 – 45 

LOD v (pmol) ~ 10 ~ 1 

Dávkované množství (µl) 1 – 50 1 - 300 

Minimální stanovitelná koncentrace (mol/l) až 10 -6 

až 10 -8 

Maximální poměr stanovovaných složek 1 : 100 až 1 : 10 6 

Z analytického hlediska představuje potravinářský výrobek komplexní a značně 

heterogenní matrici, což komplikuje analytické stanovení látek v něm obsažených. 

Vzhledem ke skutečnosti, že běžné neionogenní složky potravin jako jsou sacharidy, 

škrob, vláknina a další neruší izotachoforetickou analýzu, je tato metoda v řadě 

případů velmi vhodná pro stanovení ionogenní látek. Další výhodou je minimální 

úprava vzorku před analýzou (ředění a filtrace u kapalných vzorků či extrakce u 

vzorků pevných), což snižuje pracnost analýz. Separace ve volném roztoku v 

kapiláře eliminuje v mnoha případech nežádoucí interakce analytu s nosičem jak 

tomu bývá u chromatografických technik a tím se dosahuje velmi dobré 

reprodukovatelnosti analýz. Jednou z řady možností rozdělení látek, které jsou 

v potravinách stanovovány, je do tří následujících skupin: 

• přirozené látky 

• přídatné látky 

• cizorodé látky 

u asi 1 mililitr zředěného většinou vodného (~ 0,01 mol/l) roztoku na jednu analýzu 

v podle charakteru analytu a použitého detektoru a vnitřního průměru kapiláry 



V následujících kapitolách bude diskutovány analýzy látek příslušejících do 

jednotlivých skupin. Na tomto místě je nutné připomenout, že citovány jsou zejména 

práce, které popisují stanovení látek v reálné matrici. Separace modelových směsí 

bez reálné aplikace nejsou z hlediska tématu této práce relevantní. Existují 

60, , 

přehledové články 61 62 na toto téma, ale tyto publikace jsou poměrně starého data 

vydání a neobsahují další zajímavé aplikace této techniky v analýze potravin za 

posledních 10 let. 

6.1 Přirozené látky 

Za přirozenou látku v potravině lze označit takovou látku, která je její přirozenou 

součástí nebo její složky a jejíž přítomnost nezpůsobil nahodilý kontakt s prostředím, 

případně záměrné přidání do potraviny. Mezi přirozené složky potravin patří látky 

významné pro výživovou a senzorickou hodnotu potravin, tj. nutriční, antinutriční a 

toxické. 

6.1.1 Anorganické kationty 

Kromě základních biogenních prvků (C, O, H, N) jsou pro růst organismu důležité 

další prvky. Souhrnně se nazývají minerální látky. Minerální látky představují 0.1 % 

živé hmoty organismu a dělíme je na základní minerální prvky a stopové prvky. 

Základní minerální prvky tvoří 99.5 % podílu minerálních látek živé hmoty a stopové 

prvky tvoří asi 0.5 % podílu minerálních látek živé hmoty, a v organismu jsou tedy 

zastoupeny v množství 0.001 až 10 %. Minerální látky plní v organismu řadu 

důležitých funkcí. Vzhledem k tomu, že si je organismus nedovede syntetizovat, musí 

být dodávány potravou, a proto sledování jejich hladin v potravinách patří mezi 

základní analýzu potravin. Mezi tyto prvky patří vápník, fosfor, hořčík, sodík, draslík, 

síra a chlor. Fosfor, síra a chlor se nachází v mnoha formách, zatímco alkalické kovy 

a kovy alkalických zemin jsou ve formě kationtů různých solí vhodné pro přímé 

stanovení. Přehledně jsme s kolegou Blatným shrnuli použití CITP v analýze 

anorganických aniontů a kationtů v potravinách v letos publikovaném článku 63 . 

Princip, na kterém je kapilární izotachoforéza založena, tuto metodu přímo 

předurčuje pro stanovení minerálních látek kationických (K, Na, Ca, Mg) i 



anionických (chlorid, síran, fosforečnan) v extraktech či mineralizátech potravin. 

Kapilární izotachoforéza byla použita ke stanovení alkálií (K, Na, Ca, Mg) v 

extraktech rostlinných materiálů. Autoři 64 vyřešili separaci těchto kationtů použitím 

polyethylenglykolové pseudofáze. Polyethylenglykol tvoří podobně jako symetrický 

18-crown-6 ether asociáty s alkalickými kovy 65 (viz. dále), avšak při řádově vyšších 

koncentracích. Tvorbou asociátů je ovlivněna jejich efektivní pohyblivost a umožněna 

tak separace. V tomto systému lze separovat, vedle běžných alkalických kovů 

draslíku a sodíku, také rubidium a cézium. Výhoda použití polyethylenové 

pseudofáze do vedoucího elektrolytu před 18-crown-6 etherem je v nižší ceně. Má 

však jeden ohromný nedostatek a tím je zdlouhavé čištění polyethylenglykolu. 

Separaci těchto kovů ve vodném prostředí je obtížná díky jejich velmi blízké 

pohyblivosti. Tyto kovy lze separovat v nevodném prostředí methanolu (viz Obrázek 

33). Obdobný systém byl aplikován i pro stanovení těchto kationtů v mineralizátech 

krmných směsí 66 a metoda se stala podkladem pro normovanou metodu stanovení 

těchto kationtů ve vodách 67 . Při výrobě cukru má sledování hladiny těchto kationtů 

prvořadý technologický význam, jednak s ohledem na výtěžnost procesu těžení 

cukru a dále na riziko vzniku inkrustací v odparce a zahřívačích (vyšší obsah vápníku 

a hořčíku). Stanovení těchto kationtů bylo z úspěchem použito i v případě výroby 

škrobových sirupů 68 . V systému zředěné kyseliny sírové jako vedoucího a citranu 

lithného jako zakončujícího elektrolytu lze během 15 minut analyzovat cukerné šťávy 

v různých fázích získávání cukru s dostatečnou přesností 69 . Výhoda použití CITP 

v analýze vzorků s vysokým obsahem neionogenní látek (matrice vzorku) spočívá 

v tom, že tyto látky neruší analýzu a není je nutné odstraňovat. Lze například 

provádět přímou analýzu až 25% roztoku sacharózy a dosáhnout tak detekčního 

limitu v desetinách mg/kg, což je srovnatelné s technikou AAS. Na rozdíl od AAS 

však není při CITP nutná úprava vzorku. Systém je použitelný v případě nízkého 

obsahu amonného iontu pro přímou analýzu řady potravin 70, 71 , jako jsou 

nealkoholické nápoje, mléko, víno, pivo, apod. Je-li obsah amonného iontu 

srovnatelný s obsahem draslíku, je možné buď tento kation odstranit (záhřev 

hydroxidem lithným zalkalizovaného vzorku), nebo použít postup níže popsaný. 



Stanovení amonného iontu vedle draselného ve vodném prostředí je díky jejich 

blízké pohyblivosti (při pH ≤ 8) obtížné a lze jej provést použitím 18-crown-6 etheru 

jako aditiva do vedoucího elektrolytu 72 . Tato látka tvoří s draslíkem (a dalšími 

alkalickými kovy a kovy alkalických zemin) asociáty, jejichž vznik způsobuje snížení 

efektivní pohyblivosti draslíku, a tím jeho separace od amonného iontu. 

R 

H 3 O + 

Obrázek 40 

+ 

NH4 A B 

R 

K + 

Mg ++ 

Ca ++ 

Na + 

čas 

BTP ++ 

Mg ++ 

Ca ++ 

Na + 


+ 

NH4 H 3 O + 

K + 

čas 

BTP ++ 

Analýza standardní směsi 3,6 mg/l NH4 + , 16 mg/l K + , 4,6 mg/l Na + , 4 mg/l Ca ++ a 2,4 mg/l 

Mg ++ (A) a vzorku pomerančového džusu (50x zředěný) (B); R – odezva vodivostního 

detektoru (ohmický odpor). 

S kolegou Blatným 73 jsme použili operační systém s tímto aditivem pro stanovení 

alkalických kovů, kovů alkalických zemin a amonného iontu v silážích. Vypracovanou 

metodiku lze aplikovat na některé potravinářské vzorky, jako jsou nápoje (alkoholické 

i nealkoholické), pekařské výrobky, maso a masné výrobky a další. Na Obrázku 40 je 

uveden záznam analýzy pomerančového džusu 74 . Analýza byla provedena na 

jednokapilárovém analyzátoru IONOSEP 900.1 a úprava vzorku spočívá pouze ve 

vhodném naředění. Obsah těchto kationtů (a jejich poměrné zastoupení) v ovocných 

či zeleninových šťávách je jedním ze sledovaných parametrů při posuzování 

autenticity vzorku. V případě pevných vzorků je nutná extrakce (vodou nebo 

zředěnou minerální kyselinou) kationtů před izotachoforetickou analýzou.


Jinou možností stanovení amonného kationtu vedle draselného je použití vedoucího 

elektrolytu o vysokém pH, kdy dojde díky potlačení disociace amonného iontu k jeho 

přibrždění, a tím oddělení od draslíku. V systému 5mM KOH + 30 mM L-histidin 

(vedoucí elektrolyt) a 10 mM citronan lithný (zakončující) lze takovouto analýzu 

provést prakticky u všech potravinářských vzorků 75 . V tomto uspořádání pokusu 

nelze však uspokojivě stanovit draselný ion, neboť je použit jako vedoucí. V případě 

vzorků s vysokým obsahem draslíku je možná jeho kvantifikace z protažení délky 

vedoucí zóny. Podobně lze stanovit chlorid (viz. další kapitola), s tím, že chyba 

stanovení závisí na obsahu iontu ve vzorku a RSD je větší než 3 %. 

Izotachoforetické stanovení těchto kationtů lze provést i v jiných operačních 

76, , 

systémech 77 78 . 

Stopové prvky lze principiálně v potravinách metodou CITP stanovit v operačních 

systémech, které budou popsány v kapitole věnované kontaminantům potravin. 

Vzhledem k pracnosti úpravy vzorku (selektivní sorpce u kapalných vzorků a 

mineralizace následovaná selektivní sorpcí u pevných vzorků) a velice rozdílným 

hladinám základních a stopových minerálních kationtů (zpravidla několik řádů) je 

využití CITP na tomto poli minimální a dominantní postavení má AAS či podobné 

79, , , 

techniky. Přesto existuje několik prací 80 81 82 popisujících stanovení těchto prvků 

zejména ve vodách, kdy je aplikována selektivní sorpce před vlastní analýzou. 

Kationty se převážně stanovují v kationickém módu, ale například železo, hliník a 

další kovy lze stanovit jako záporně nabité komplexy s EDTA. Na tomto principu jsme 

vypracovali metodu pro stanovení železa 83 v pitných vodách na úrovni desítek µg/l 

bez úpravy vzorku. Metoda je založena na tvorbě záporně nabitého komplexu 

trojmocného železa s EDTA, který má poměrně vysoký absorbanční koeficient při 

254 nm. Díky tomu se nám podařilo vypracovanou metodou CITP v kombinaci s CZE 

(izotachoforetické zakoncentrování v prvním kroku a elektroforetická separace 

v druhém s UV detekcí) dosáhnout detekčního limitu 10 µg Fe/l vody. Výhodou této 

metody je to, že současně se železem je možné stanovit některé anionty přítomné ve 

vzorku. 


6.1.2 Anorganické anionty 


Mezi nejčastěji sledovaný anorganický anion v potravinách patří bezesporu dusičnan, 

protože jeho obsah je limitován. Stanovení dusičnanu v různých potravinách 

metodou CITP popisuje celá řada prací. Vzhledem k tomu, že dusičnan je téměř vždy 

doprovázen chloridem a síranem, je nutné při hledání podmínek separace tomuto 

faktu věnovat pozornost. Separace dusičnanu od síranu je zpravidla dosahováno 

přídavkem vícemocného koprotiontu (Ca, Mg, BTP) do vedoucího elektrolytu, který 

sníží efektivní pohyblivost síranu, čímž je dosaženo separace. Vzhledem k velmi 

blízké efektivní pohyblivosti chlorid-dusičnan-síran je separační kapacita systému 

zpravidla nízká. 

Obrázek 41 

Izotachoforegram vodného extraktu (10 g/l) 

ředkvičky. Volbou vhodného zakončujícího 

aniontu (mravenčan) lze dosáhnout velmi 

jednoduchého záznamu analýzy, který je 

snadno vyhodnotitelný 84 . 

Proto je v určitých případech vhodné snížit koncentraci chloridů, případně síranů w , a 

tím umožnit analýzu méně zředěného vzorku a dosáhnout nižších detekčních limitů 

řádu desetin mg/l analyzovaného roztoku. Metoda CITP je z důvodů rychlosti 

analýzy, nenáročnosti na úpravu vzorku a nízkých provozních nákladů rozšířena pro 

stanovení dusičnanů v zelenině 85 a pitné vodě 86 . Chloridy jsou při této metodě 

stanoveny z prodloužení vedoucí zóny. Chyba takovéhoto stanovení je závislá na 

obsahu sledovaného analytu a v případě analýz vody se RSDCl - pohybuje od 3 do 7 

%. CITP se stala normovanou metodou 87 pro stanovení anorganických aniontů ve 

vodách, podobně jako v případě stanovení kationtů. Přehledné informace o 

metodách stanovení dusičnanů v biologických materiálech lze získat v práci Krýsla 88 . 

w zpravidla ve formě nerozpustné stříbrné či barnaté soli 


R 

čas


V potravinářských surovinách a výrobcích lze metodou CITP určit obsah 

fosforečnanů 89 a síranů, siřičitanů 90, 91 ve víně, chloridů v pitné či minerální vodě 92 a 

dále fluoridů 93 , 94 , jodidů, dusitanů 95 , chromanu 96 apod. Kaniansky použil metodu 

CITP-CZE s vodivostní detekcí pro analýzu vod a dosáhl detekčního limitu 200 ng/l 

pro dusitan, 300 ng/l pro fluorid a 600 ng/l pro fosforečnan. 

R 

Obrázek 42 

Izotachoforegram analýzy (a) modelové směsi aniontů a (b) vzorku surové šťávy při výrobě 

cukru 97 . Analýza byla provedena v systému 10 mM HCl + 10 mM β-alanin + 3 mM BTP + 

0,1% HPMC (vedoucí elektrolyt, pH 3,6) a 10 mM mléčnan lithný (zakončující elektrolyt) na 

jednokapilárovém analyzátoru IONOSEP 900.1. L chlorid, 1 dusičnan, 2 síran, 3 dusitan, 4 

šťavelan, 5 siřičitan, 6 mravenčan, 7 fosforečnan, 8 citronan, 9 pyrolidonkarboxylan, T 

mléčnan. 

Těchto limitů bylo dosaženo bez úpravy vzorku, přičemž hladina chloridu a síranu 

byla až 10 6 -krát větší. Zelenský vypracoval CITP metodu (bez nutnosti předúpravy 

vzorku) s fotometrickou detekcí při 405 nm pro stanovení chromanu v pitné vodě a 

dosáhl detekčního limitu 5 µg/l. 

Izotachoforéza je vhodná pro stanovení nízkých iontových nečistot v neionogenních 

materiálech, jako je cukr, glycerol, škrob apod. Například Meissner 98 použil kapilární 

izotachoforézu v uspořádání spojených kapilár pro analýzu iontových nečistot 

v glycerolu a dosáhl pro vybrané anorganické anionty detekčních limitů řádu 10 -5 % 

vztaženo glycerol. Takto nízkých detekčních limitů je možné dosáhnout jen díky 


čas


tomu, že izotachoforézou lze přímo analyzovat poměrně koncentrované roztoky 

(řádu jednotek až desítek %) neionogenních látek. 

Pomocí isotachoforetického analyzátoru IONOSEP 900.1 jsme stanovili 

imidodisulfonát (IDS) v cukrovarnických meziproduktech. Tato ve vodě rozpustná 

látka vzniká reakcí dusitanu se siřičitanem a přechází až do rafinády ve formě 

draselné soli. Tím se zvýší obsah popelovin v rafinádě, což je nežádoucí z hlediska 

kvality finálního produktu. Záznam analýzy je uveden na následujícím obrázku. 

Obrázek 43 

Analýza standardu IDS (a), vzorku těžké šťávy (b) a vzorku těžké šťávy s přídavkem IDS (c) 

v operačním systému 2 mM L-histidin hydrochlorid + 2 mM L-histidin + 3 mM chlorid 

vápenatý + 0,1% (LE) a 10 mM mravenčí kyselina (TE). L chlorid; 1 dusičnan; 2 IDS; 3 

síran; T mravenčan. 

6.1.3 Organické báze 

Mezi organické báze sledované v potravinách metodou CITP patří zejména histamin 

vznikající mikrobiální dekarboxylací histidinu. Tato báze je indikátorem kvality 

zejména rybího masa a hladina histaminu je také důležitá z hygienicko-zdravotního 

hlediska, neboť má negativní fyziologické účinky na organismus. Rubach se 

spolupracovníky 99 použil pro stanovení histaminu v rybách a rybích výrobcích 

operační systém s Ba ++ jako vedoucím a TRIS + jako zakončujícím kationtem. 

Izotachoforéza se ukázala vhodnou technikou (reprodukovatelnost ~ 1 %) pro 

sledování obsahu histaminu při skladování ryb. Voldřich se spolupracovníky 100 při 

sledování hladin histaminu v rybích výrobcích nahradil vedoucí Ba ++ rychlejším 



draselným iontem, čímž dosáhl zkrácení analýzy a současně i snazší manipulace 

s vedoucím roztokem x . Použitím koncentrační kaskády v uspořádání spojených 

kapilár dosáhl detekčního limitu 1 mg histaminu/kg vzorku. 

CITP umožňuje stanovení dalších biogenních aminů, jako je putrescin nebo 

kadaverin, které je možné stanovit za stejných podmínek jako histamin. 

V extraktech masa a masných výrobků je možné touto technikou stanovit kreatinin, 

případně nukleotidy ATP, ADP, AMP. 

6.1.4 Organické kyseliny 

Stanovení organických kyselin patří mezi nejrozšířenější aplikace kapilární 

izotachoforézy. Hladiny organických kyselin ve vzorcích jsou zpravidla dostačující 

k přímému stanovení bez úpravy vzorku. Jednou z prvních aplikací CITP v analýze 

potravin bylo stanovení organických kyselin ve víně 101 . Farkaš 102 pomocí CITP 

v různých druzích vína stanovil kyselinu vinnou, jablečnou, mléčnou, jantarovou, 

octovou a citrónovou a sledoval obsah těchto kyselin během výroby vína 103 . 

Reijenga 104 pomocí CITP analyzoval 100 vzorků různých vín (červené, bílé a růžové) 

ze 13 evropských zemí na obsah organických kyselin a konzervačních látek. Zrání 

tokajského vína bylo sledováno pomocí hladiny citramalové kyseliny stanovené 

CITP. Typický izotachoforegram bílého vína je na následujícím obrázku. Obvyklá 

úprava vzorku vína spočívá pouze v jeho vhodném zředění. Za těchto podmínek lze 

ve víně vedle přirozených kyselin stanovit i kyselinu sorbovou přidávanou jako 

konzervační látku. 

Obrázek 44 

Izotachoforegram 105 vzorku bílého vína 

(25krát zředěného) v operačním systému 

LE: 10 mM-HCl + 5.5 mM-BTP a TE: 5 

mM-MES. L chlorid; 1 síran; 2 vinnan ; 3 

jablečnan; 4 jantaran ; 5 citronan; 6 octan; 

7 mléčnan; 8 fosforečnan; 9 sorban; T 

MES. Analýzy provedena na analyzátoru 

IONOSEP 900.1. 

x absorpcí vzdušného oxidu uhličitého vzniká nerozpustný BaCO3, a tím se snižuje koncentrace Ba ++ v roztoku 


R 

čas


Sledování obsahu organických kyselin při získávání cukru (řepného i třtinového) je 

významné pro řízení procesu. Pro CITP je cukerná šťáva obsahující asi 90 % 

neionogenních rozpuštěných látek a 10 % necukrů převážně ionogenní povahy 

téměř ideálním vzorkem. Touto technikou lze sledovat obsah všech technologicky 106, 

107, 108, 109 

významných kyselin – citronová, mléčná, octová, mravenčí, 

pyrrolidonkarboxylová a další. Pro tyto účely jsme vypracovali několik operačních 

systémů umožňujících stanovení všech důležitých kyselin. Izotachoforéza se 

osvědčila při stanovení těkavých mastných kyselin v melase 110, 111 . Analýzou různých 

druhů řepných melas byl prokázán vliv kyseliny mravenčí na výtěžnost ethanolu při 

jeho výrobě z melasy. Výhody CITP oproti běžně používané GLC spočívají v tom, že 

není nutné kyseliny před analýzou izolovat destilací a možnost stanovení mravenčí 

kyseliny. Záznam analýzy modelové směsi kyselin významných v cukrovarnické 

technologii a vzorku tekutého cukru je na Obrázek 45. Izopropanol přidaný do 

vedoucího elektrolytu umožňuje separaci máselné od izomáselné kyseliny, která je 

charakteristickým produktem anaerobní mikrobiální činnosti během dlouhodobého 

skladování tekutého cukru. Bez přídavku izopropanolu migruje máselná kyselina ve 

společné zóně s izomáslenou, ale separace ostatních aniontů je zachována. V tomto 

operačním systému migruje ve společné zóně citronová s jablečnou kyselinou a 

pyroglutamová s jantarovou. Použitím operačního systému uvedeného na 

předchozím obrázku je možné stanovení jablečné vedle citronové kyseliny. 

Izotachoforéza je vhodná pro monitorování kvasných procesů, jako je například 

kvašení zeleniny, zrání těsta při výrobě pečiva apod. Při těchto procesech je důležitý 

obsah zejména mléčné a octové kyseliny a jejich vzájemný poměr. Organické 

kyseliny jako senzoricky významné složky potravin byly touto metodou stanoveny 

v džusech, nealkoholických nápojích, pivu, kávě, kakau, pečivu, kysané zelenině a 

112, , , , 

mnoha dalších potravinářských výrobků 113 114 115 116 . Nižší těkavé mastné 

kyseliny jsou senzoricky významnou složkou sýru typu Ementál. Izotachoforézou 

jsme v extraktu sýru stanovili během 20 minut všechny významné kyseliny 117 . 



Izotachoforézu jsme použili na stanovení organických kyselin v potravinářských 

surovinách, jako jsou mouka 118 , brambory 119 , rajská jablka 120 , vejce 121 , mléko 122 , 

ovoce 123 , a maso 124 . 

R 

Obrázek 45 

Izotachoforegram 125 modelové směsi 13 kyselin (á 0.1 mM) a vzorku tekutého cukru (zředěn 

na koncentraci 5g/100 ml). Analýza byla provedena na analyzátoru IONOSEP 900.1 

v operačním systému LE: 10 mM HCl + 22 mM EACA + 15 % (w/V) izopropanol + 0,1% 

HPMC (pH 4,6) a TE: 5 mM-kapronová kyselina. L chlorid; 1 šťavelan; 2 mravenčan; 3 

citronan; 4 fosforečnan; 5 mléčnan; 6 pyroglutaman; 7 asparagan; 8 octan; 9 glutaman; 10 

propionan; 11 máselnan; 12 izomáselnan; 13 valeran; T kapronan. 

Izotachoforézou 126 byl sledován obsah acetátu, laktátu, fumarátu a α-ketoglutarátu 

vznikajících při kultivaci mikroorganismů Escherichia coli. 

Poměr citronové a izocitronové kyseliny je důležitým parametrem při posuzování 

pravosti citrusových džusů. Stanovení se běžně provádí pomocí enzymových 

souprav, avšak toto stanovení je poměrně zdlouhavé a nákladné. Analýzou 127 džusů 

na přístroji EA 100 se spojenými kapilárami jsme v jedné analýze během 20 minut 

stanovili kyselinu jablečnou, citronovou a izocitronovou. Izotachoforegram této 

analýzy je na následujícím obrázku. V předseparační kapiláře jsou stanoveny 

makrosložky – jablečná a citronová kyselina a část separovaných zón (viz. čárkovaný 

obdélník na obrázku) je vpuštěna do analytické kapiláry, kde je stanovena 


čas


izocitronová kyselina, která je přítomna asi ve 100x nižší koncentraci než citronová. 

Separace citronové kyseliny od izocitronové je zajištěna přídavkem vápníku do 

vedoucího elektrolytu. Tento tvoří s citronovou kyselinou středně silný komplex (log β 

~ 3), zatímco s izocitronovou nikoliv. 

DL-isocitronová 

DL-jablečná 

Chlorid 10 s 

Obrázek 46 

1 MES 2 

MES 

citronová 

Chlorid 

DL-isocitronová 

DL-jablečná 

citronová 

Záznam izotachoforetické analýzy citrusového džusu (25krát zředěn) na dvoukapilárovém 

analyzátoru EA 100 v operačním systému LE: 6 mM-HCl + 3,8 mM-BTP + 2 mM-CaCl2 + 

0.1% HPMC, pH 6.1 a TE: 5 mM-MES + 1 mM-BTP. (1) – záznam z předseparační kapiláry; 

(2) – záznam z analytické kapiláry 

10 s 

Efektivní pohyblivost kyseliny citronové je snížena do té míry, že je separována od 

izocitronové. Touto elegantní metodou lze všechny kyseliny stanovit s dostatečnou 



přesností a rychlostí srovnatelnou s enzymovou, případně chromatografickou, 

metodou, avšak za podstatně nižších nákladů. 

6.1.5 Aminokyseliny 

Aminokyseliny vzhledem k jejich „zwitterionické“ povaze nelze stanovit všechny 

v jedné izotachoforetické analýze, neboť např. za nízkého pH jsou kyselé 

aminokyseliny (asparagová, cysteová, glutamová) záporně nabité, neutrální téměř 

(glycin, alanin, atd.) bez náboje a bazické (lysin, histidin, arginin) kladně nabité. 

Vzhledem k této skutečnosti se izotachoforéza na tomto poli nepoužívá. Je však 

používána pro stanovení jednotlivých kyselin. V potravinách je izotachoforézou 

nejčastěji stanovována kyselina glutamová v souvislosti s tím, že je používána jako 

přídatná látka (podrobněji viz. kapitola 6.2.6). Izotachoforézou jsme v krmných 

směsích 128 stanovili esenciální 

aminokyselinu lysin, a to volný (po extrakci 

vzorku vodou) i vázaný lysin (po alkalické 

hydrolýze). 

Obrázek 47 

Izotachoforetické stanovení bazických 

aminokyselin; A – standard (á 50 µmol/l), B - 

vzorek krmné směsi 

Tato metoda je použitelná i pro potraviny. Obsah čistých svalových bílkovin (Lean 

meat content) je nejlepším ukazatelem kvality masných výrobků. Pomocí tohoto 

ukazatele je možné rozdělit velmi snadno výrobky do různých kvalitativních (a 

cenových) skupin, které jsou srozumitelné pro spotřebitele. Zákon o potravinách a 

tabákových výrobcích předepisuje výrobci udávat obsah čistých svalových bílkovin 

ve výrobcích, v jejichž názvu je slovo šunka. V současnosti však neexistuje ověřená 

spolehlivá analytická metoda pro tento účel a je používaná tzv. nepřímá metoda 

založená na zjištění obsahu N-látek Kjehldahlovou metodou (obsah N x 6,25) a 

odečtením kolagenu stanoveného jako 4-hydroxyprolin (kolagen = 8,00 x 4-OH- 

prolin). Tato metoda má však jistá omezení. Není schopna rozlišit, je-li svalová 



bílkovina nahrazena jinou (pšeničná, sojová, mléčná), či použita jiná dusíkatá látka 

(močovina, azodikarbonamid) zvyšující obsah N-látek. Z tohoto důvodu je žádoucí 

nahradit stávající nepřímou metodu takovou, pomocí které bude možné stanovit 

bílkoviny masa přímo. Existují látky charakteristické výhradně pro svalové bílkoviny. 

Zejména se jedná o 3-methyl-L-histidin (3-MeHis; [S]-1-methylimidazol-4-alanin; τ- 

methyl-L-histidin, Nε-methyllysin) a kreatinin. Zvláště 3-MeHis je typickým přirozeným 

stavebním kamenem myofibrilárních bílkovin myosinu a aktinu. Dle literárních údajů 

jsou hladiny této aminokyseliny stálé pro různé druhy masa. Znamená to, že se 3- 

MeHis nevyskytuje v jiných potravinách bohatých na proteiny, jako je mléko, vejce, 

sója a další. Proto je možné hladinu 3-MeHis použít jako ukazatel obsahu čisté 

svalové bílkoviny. Pro tento účel jsem vypracoval isotachoforetickou metodu 129 

stanovení 3-MeHis, 1-MeHis a kreatininu v mase a masných výrobcích. Na Obrázku 

48 je ukázka záznamu analýzy standardu a vzorku hydrolyzovaného vepřového 

masa. 

A T 

B 

T 

PK 

R 

L 

1 

2 3 

Obrázek 48 

A254 AK PK 

4 4 

4 

AK 

1 

1 

2 3 

2 

L L L 

T 

2 

3 

čas 

Záznam izotachoforetické analýzy standardní směsi (A) 1-MeHis, His, 3-MeHis a kreatininu 

(á 100 mM) a (B) hydrolyzátu vepřového masa; analýza byla provedena na analyzátoru se 

spojenými kapilárami v operačním systému 5 mM-NH4OH + 10 mM-MES (LE) a 10 mM- 

EACA + 5 mM-HAc (TE); L – NH4 + , 1 - 1-MeHis, 2 – His, 3 – 3-MeHis, 4 – kreatinin, T – 

EACA; R – odezva vodivostního detektoru; A254 – odezva fotometrického detektoru 

(absorbance při 254 nm). 

Touto metodou lze kvantifikovat všechny výše zmíněné potenciální markery 

svalových bílkovin. Z obrázku je vidět, že kreatinin absorbuje na rozdíl od ostatních 


4 

T


analytů při 254 nm, což umožňuje jeho snazší identifikaci. LOD pro 3-MeHis (i ostatní 

analyty) je 0.2 µmol/g, což je dostatečné vzhledem k jeho hladinám ve vzorcích, 

které jsou o jeden až dva řády vyšší. Tuto metodu jsem s úspěchem použil pro 

stanovení kreatininu v bílkovinných hydrolyzátech. Celková doba analýzy je 20 až 30 

minut podle charakteru vzorku. 

Analýzu umožňující stanovení kyselých a bazických aminokyselin popsal 

Holloway 130 . Metoda spočívá v derivatizaci aminokyselin anhydridem kyseliny 

citrakonové a následné separaci záporně nabitých derivátů v operačním systému 5 

mM-HCl + 10 mM-L-histidin (LE) a 5 mM-kakodylová kyselina (TE). 

Izotachoforéza byla použita na stanovení 2,4-dinitrofenylderivátů aminokyselin 131 ve 

víně za použití fotometrické detekce při 405 nm. Tímto způsobem bylo dosaženo 

detekčního limitu v analyzovaném roztoku 10 -8 mol/l. 

6.1.6 Vitaminy 

Metoda CITP je převážně používána pro stanovení vitamínů rozpustných ve vodě ve 

vitamínových koncentrátech, případně v potravinách obohacených příslušnými 

vitamíny. Röben 132 stanovil v kationickém režimu společně thiamin (B1), pyridoxamin, 

pyridoxol (B6) a nikotinamid (PP). V anionickém režimu při vysokém pH stanovil 

v jedné analýze riboflavin-5-fosfát, nikotinovou kyselinou (B3), listovou kyselinu, biotin 

a pantothenovou kyselinu. Poměrně hodně prací je věnováno stanovení vitamínu C, 

respektivě askorbové a dehydroaskorbové kyselině. V citrusových koncentrátech 

stanovil Rubach 133 obě tyto kyseliny. Obsah dehydroaskarbové kyseliny vypočetl 

jako rozdíl obsahu askorbové kyseliny po a před redukcí vzorku merkaptoethanolem. 

Izotachoforéza byla použita pro stanovení vitamínu C v pivu 134 a dětské výživě 135 . 

Mírně modifikovanou metodu jsme použili pro stanovení páru askorbová- 

dehydroaskorbová kyselina v pšeničném těstě 136 , do kterého se askorbová přidává 

jako zlepšující prostředek. Touto metodou jsme analyzovali různé potravinářské 

výrobky obohacených tímto vitamínem. Na následujícím obrázku je záznam analýzy 

ovocné limonády obohacené vitamínem C. Z obrázku je vidět, že současně 

s vitamínem C lze stanovit i sorbovou kyselinu, která je přidána do limonády jako 



konzervační látka. Tento operační systém jsme úspěšně vyzkoušeli pro stanovení 

vitamínu C v ovoci a ovocných šťávách. 

askorbová 

R 

6.1.7 Bílkoviny 

min 

sorbová 

A25 

Obrázek 49 

Izotachoforegram analýzy vzorku limonády 

(10krát zředěná) na dvoukapilárovém 

analyzátoru v operačním systému 10 mM- 

HCl + BALA, pH 3,8 (LE) a 5 mMkapronová 

kyselina (TE). význam symbolů 

shodný jako na předchozím obrázku. 

V analýze potravin se zpravidla bílkoviny stanovují jako suma dusíkatých látek, a 

nikoliv jako individuální analyty. V principu je kapilární izotachoforéza velmi vhodnou 

technikou pro stanovení peptidů a bílkovin a pro tyto analýzy je široce využívána 

zejména v biochemii 137 . Do sféry analýzy potravin lze zahrnout CITP stanovení 

lysozymu z vaječného bílku a ovalbuminu z vaječného žloutku provedené 

v kationickém módu 138 . 

6.1.8 Antinutriční látky 

Z antinutričních látek přirozeně se vyskytujících v potravinách, které byly stanoveny 

metodou CITP, lze na prvním místě jmenovat fytovou kyselinu (myo-inositol 

hexafosforečná kyselina, IP6). Tato látka je obsažena v potravinách rostlinného 

původu, jako jsou cereálie a luštěniny ve formě nerozpustné vápenato-hořečnaté soli 

zvané fytin. Její nepříznivý vliv na organismus spočívá ve vázání minerálních látek 



(stopových prvků) do nerozpustných komplexů, čímž se tyto esenciální prvky stávají 

pro organismus nevyužitelnými. Pro stanovení kyseliny fytové v rostlinných 

surovinách jsme vypracovali izotachoforetickou metodu 139 spočívající v anionické 

analýze kyselého extraktu vzorku. Na následujícím obrázku je uveden záznam 

analýzy vzorku hrachu provedené na jednokapilárovém analyzátoru IONOSEP 

900.1, ve kterém jsme nalezli 2,2 g/100 g fytové kyseliny 

Obrázek 50 

Záznam izotachoforetické analýzy extraktu 

hrachu; L – chlorid, P – fosfát a T – MES; 

Jako vedoucí elektrolyt byl použit 10 mM HCl 

+ 5,5 mM BTP + 0,1% HPMC (pH 6,2) a 

zakončující 5 mM-MES. 

Vedle fytové kyseliny je možné stanovit 

nižší myo-inositol fosfáty a fosfáty. Hladiny fytové kyseliny se pohybují od desetin 

procenta u hladké pšeničné mouky až po 10 % u otrub. Vysoký obsah této 

antinutriční látky je nutné mít na paměti při různých „vlákninových dietách“, kdy může 

konzumentovi hrozit nebezpečí deficitu minerálních látek. Je proto nutné vlákninovou 

dietu vždy kompenzovat dostatečným přísunem minerálních prvků v potravě. 

Obrázek 51 

Izotachoforegram extraktu 

semen hořčice odrůdy Sinapsis 

alba a Brassica juncea. 

v operačním systému 5 mM-HCl 

+ glycylglycin, pH 3 (LE) a 5 

mM-kapronová kyselina (TE). 

Glukosinoláty hořčice sinigrin 



a sinalbin stanovil Klein 140 po extrakci semen horkou vodou v anionickém módu za 

nízkého pH vedoucího elektrolytu. Pro identifikaci a kvantifikaci použil UV detekce při 

254 nm. Na Obrázku 51 je uveden záznam izotachoforetické analýzy extraktu semen 

hořčice. Z dalších antinutričních látek, které byly stanoveny metodou CITP, lze 

jmenovat glykoalkaloidy brambor nebo rajských jablek. Vzhledem k tomu, že tyto 

látky mají škodlivý vliv na lidský organismus, náleží spíše do skupiny toxických 

přirozených látek potravin. 

6.1.9 Toxiny 

Hlavními glykoalkaloidy brambor je α − solanin a α − chaconin. Pro jejich teratogenní 

účinky je maximální přípustný obsah těchto látek (suma) v bramborách a výrobcích z 

brambor stanoven na 200 mg/kg. Některými autory je doporučována ještě nižší, 

zhruba třetinová hladina. Pro stanovení těchto látek jsme vypracovali 

izotachoforetickou metodu 141 , která je alternativou k běžně využívané metodě HPLC. 

S touto technikou má totožnou úpravu vzorku (extrakce na tuhou fázi), liší se 

koncovkou. Izotachoforetickou metodou nelze rozlišit α − solanin a α − chaconin, 

avšak je možné stanovit aglykon solanidin, případně nižší glykoalkaloidy (β - a γ - 

formy y ). Stanovení těchto látek je metodou HPLC obtížné a musí se podmínky běžně 

používané pro stanovení α - formy modifikovat. Na následujícím obrázku je uveden 

izotachoforegram standardu a extraktu brambory. 

Obrázek 52 

Izotachoforegram 

standardu (1) αchaconinu 

+ α-solaninu a 

(2) solanidinu (a) a 

extraktu brambory (b); L 

– H3O + , 2 – Zn ++ 

Analýza je prováděna 

R 

y alfa-forma obsahuje vázaný trisacharid na aglykon, beta-forma disacharid a gama-forma monosacharid 


čas


na jednokapilárovém analyzátoru IONOSEP 900.1 v nevodném prostředí methanolu 

za použití 2 mM-HCl jako vedoucího elektrolytu a 2 mM-Zn(NO3)2 jako zakončujícího 

elektrolytu. Technika byla aplikována na stanovení α-tomatinu,v rajčatech 142 . 

Z přirozených toxinů vyskytujících se v potravinách lze uvést tetrodotoxin, jehož 

strukturní vzorec je na Obrázku 53. Tato látka se vyskytuje v mořských rybách 

O 

O 

O 

O 

O 

O 

O 

O 

N 

N 

zvaných ježovky. 

Obrázek 53 

Strukturní vzorec tetrodotoxinu 

Pokrm z těchto živočichů je oblíbený v zejména 

Japonsku, kde byly ovšem také zaznamenány 

případy otrav. Shimada 143 stanovil tuto látku přímo 

v extraktu ježovek za použití operačního systému sestávajícího se z 5 mM-KAc + 

50% dioxanu (LE) a 10 mM-BALA + HAc, pH 4,5 (TE). 

6.2 Přídatné látky 

H 

H 

H 

N 

Prováděcí vyhláška 298 k zákonu 110/1997 Sb., z 1.9. 1997 o potravinách a 

tabákových výrobcích definuje soubor látek spadajících do potravinářských aditiv, 

neboli látek přídatných. V dalších kapitolách bude o analýze některých aditiv 

pojednáno individuálně. 

6.2.1 Antioxidanty 

Mezi běžně používané antioxidanty patří askorbová (E300) a isoaskorbová 

(erythorbová) kyselina (E315). Stanovení askorbové kyseliny již bylo popsáno 

v kapitole 6.1.6 a stanovení isoaskorbové kyseliny lze provést za stejných podmínek, 

přičemž jsou obě kyseliny jsou dobře separovatelné. Rubach stanovil askorbovou 

kyselinu vedle isoaskorbové v citrusových koncentrátech v jedné analýze trvající 10 

minut. Pro detekci kyselin použil UV a vodivostní detekci. Jako antioxidant je 

využíván dále oxid siřičitý (E220), nebo siřičitany (E221-227), které současně plní i 



funkci konzervační. Společně s kolegou Blatným jsme vypracovali metodu stanovení 

volného oxidu siřičitého ve víně 144 . 

Obrázek 54 

Izotachoforegram vzorku bílého 

vína (10x zředěné) v operačním 

systému 10 mM HCl + 20 mM 

glycylglycin + 0,1% HPMC, pH 

3.0 (LE) a 10 mM kyselina 

vinné (TE); L – chlorid, 1 – 

siřičitan; T – vínan. 

Úprava vína spočívá pouze 

v jeho naředění a dosažitelný LOD je 5 mg SO2/l pro jednokapilárový analyzátor 

IONOSEP 900.1, zatímco na dvoukapilárovém analyzátoru EA 100 je možné 

dosáhnout detekčního limitu 10krát nižšího. Pro stanovení siřičitanu v hořčici 145 jsem 

vypracoval metodu CITP na analyzátoru se spojenými kapilárami. V této potravině 

běžně používaná titrační metoda poskytuje vysoké nálezy siřičitanu, což je 

pravděpodobně způsobeno přítomností glukosinolátů. Siřičitan je v extraktu hořčice 

stanoven v operačním systému 10 mM-HCl + 10 mM-Glycylglycin + 3 mM-BTP + 

0.05% HPMC (LE) a 10 mM- dihydrogenfosforečnan draselný (TE). Rozdílným 

způsobem vedení extrakce (pH a redukční prostředí) lze stanovit volný a vázaný 

R 

SO2 

čas 

siřičitan. Dosažitelný detekční limit je 5 

mg SO2/kg. 

Obrázek 55 

Izotachoforegram extraktu hořčice (záznam 

z analytické kapiláry). 



Záznam izotachoforetické analýzy vzorku hořčice je na následujícím obrázku. Vlna 

siřičitanu odpovídá koncentraci 0,5 mg/l, což v přepočtu na vzorek hořčice odpovídá 

25 mg/kg. 

Mezi antioxidanty lze zařadit i sůl kyseliny ethylendiaminotetraoctové (EDTA). O té 

však bude podrobnější zmínka později. 

6.2.2 Barviva 

Karovičová a kol 146 . použila kapilární izotachoforézu ke stanovení syntetických 

potravinářských barviv. V patnácti různých potravinách stanovila touto technikou 

tartrazin (E102), žluť SY (E110), amaranth (E123) a košenilovou červeň (E120). 

Barviva byla stanovena v anionickém módu přímo v methanolickém extraktu pevných 

vzorků, nebo po předúpravě pomocí polyamidových kuliček u kapalných vzorků. 

Obrázek 56 

Elektroforegram 

syntetických 

potravinářských 

barviv; nosný 

elektrolyt 30 mM-TES + 8 mM-IMID + 0,2 % PEG + 5 mM-β-CD; hnací proud 150 µA, 

separační kapilára 240 x 0,3 mm (I.D.); nástřik 90 nl modelové směsi á 20 mg/l; 1-Tartrazin 

(E102), 2-Ponceau 4R (E124), 3-Amaranth (E123), 4-Čerň BN (E151), 5-Žluť SY (E110), 

6a,b-Indigotin (E132), 7-Azorubín (E122), 8-Patentní modř V (E131), 9a,b-Brilantní modř 

(E133), 10-Erythrosin (E127) a 11a,b-Chinolinová žluť (E104). 

Metodou CZE v hydrodynamicky uzavřené kapiláře na analyzátoru EA 100 Masár 147 

separoval během 15 minut syntetická potravinářská barviva. Metodu ověřil na 

reálných vzorcích. 

Pro barvení potravinářských výrobků se používá kuléru vyráběného zahříváním 

cukru s amonnými solemi. Při jeho procesu výroby vzniká řada derivátů imidazolu a 

pyrazinu, z nichž některé jsou považovány za toxické. Příkladem je 4-methylimidazol 

(4-MeI), jehož obsah je limitován. Tuto látku lze stanovit plynovou nebo kapalinovou 

chromatografií po velmi komplikované úpravě vzorku. Pro stanovení 4-MeI v kuléru 

jsem vypracoval originální izotachoforetickou metodu 148 . Výhodou CITP oproti 



chromatografickým metodám je v tomto případě absence složité úpravy vzorku, 

neboť 4-MeI se stanoví přímo ve vhodně zředěném kuléru. Na obrázku je ukázán 

záznam analýzy vzorku kuléru. 

6.2.3 Konzervační látky 

Obrázek 57 

Izotachoforegram zředěného kuléru 

(2g/100 ml); 1 – záznam 

z předseparační kapiláry a 2 – 

záznam z analytické kapiláry. 

Detekční limit metody při použití 

koncentrační kaskády je 5 mg/kg 

kuléru. 

Mezi nejpoužívanější konzervační látky používané v potravinách patří bezesporu 

kyselina benzoová (E210) a sorbová (E200) nebo jejich soli z . Tyto látky se používají 

individuálně nebo ve směsi, a to v maximální povolené výši 200 mg/kg potraviny aa . 

Existuje celá řada prací zabývajících se izotachoforetickým stanovením těchto látek 

v potravinách. Nejčastěji jsou tyto slabé kyseliny stanoveny za použití vedoucího 

elektrolytu sestávajícího se ze směsi HCl a BALA o pH 3 až 4. Jako zakončující 

elektrolyt je nejčastěji používána zředěná kapronová kyselina. Takto byly tyto 

konzervační látky stanoveny v džemech a hořčici 149 , vínu aj. Madajová 150 stanovila 

benzoovou kyselinu v hořčici a kečupu metodou 2D-CITP. Pro vydělení benzoové 

kyseliny ze složité matrice vzorku použila „spacery“ jantarovou (S1) a glutarovou (S2) 

kyselinu. Kyselina benzoová migruje v prvním rozměru analýzy (OS1) mezi těmito 

z izotachoforézou nelze rozlišit, zda byla použita volná kyselina nebo její sůl 

aa vyjádřeno jako volná kyselina 



kyselinami, a tím je velmi elegantně lokalizována v matrici vzorku. Ostatní složky 

vzorku jsou odvedeny mimo separační trasu. V druhém rozměru jsou zvoleny takové 

podmínky analýzy (OS2), za kterých benzoová kyselina migruje až za použitými 

„spacery“. Díky použití spacerů je izotachoforegram v druhém rozměru analýzy velmi 

jednoduchý. 

Obrázek 58 

Dvojdimenzionální 

CITP kečupu bez (I) a s 

použití spacerů (II); 

OS1: 10 mM-HCl + 

BALA, pH 3,9; OS2: 

10 mM-HCl + EACA, 

pH 5; 5 mM 

propionová kyselina 

použita jako 

zakončující elektrolyt 

pro oba systémy; (IA) – 

záznam detektoru 

analytické kapiláry za 

použití OS1; (IB) – 

záznam detektoru 

analytické kapiláry za použití OS2; (IIA) – záznam detektoru předseparační kapiláry v OS1 

s použitím spacerů; (IIB) – záznam detektoru analytické kapiláry za použití OS2; do 

analytické kapiláry vpuštěny zóny vymezené obdélníkem. 

Z dalších používaných konzervovadel byly stanoveny metodou CITP kyseliny 

propionová (E280) a salicylová a estery bb kyseliny p-hydroxybenzoové v pekařských 

výrobcích 151 , marmeládě, majonéze a kaviáru 152 . V posledních letech se rozšířilo 

používání mléčné kyseliny a jejich solí za účelem prodloužení masných výrobků. Pro 

mléčnanu v těchto vzorcích jsme použili metodu CITP 153 . Úprava vzorku spočívá 

v extrakci vzorku vodou a filtraci. Analýza trvá 15 až 20 minut podle charakteru 

vzorku. Detekční limit metody je 0,1 g mléčné kyseliny/kg. Metodu lze použít pro 

stanovení mléčné kyseliny i v dalších potravinách. 

bb methyl-, ethyl- a propyl- 


6.2.4 Regulátory kyselosti 


Regulátory kyselosti se používají na udržení či upravení pH na požadovanou 

hodnotu. Pro tyto účely se používají různé kyseliny, zásady, soli kyselin a estery. 

Nejčastěji jsou používané následující kyseliny, respektivě jejich soli: 

fosforečná (E338), citronová (E330), vinná (E334), mléčná (E270), octová (E260), 

jablečná (E296), jantarová (E363), fumarová (E297), adipová (E355), EDTA cc (E385), 

glukonová (E574). Pro stanovení těchto kyselin lze využít stejných metod popsaných 

v předchozích kapitolách věnovaných analýzám organických kyselin nebo 

konzervačním látkám. 

Pro stanovení některých regulátorů kyselosti jsme s kolegou Blatným vypracovali 

metodu 154 dvourozměrné izotachoforézy s využitím tvorby asociátů mezi analyty a β- 

CD. Za těchto podmínek se podařilo separovat kyselinu fumarovou od vinné, jejichž 

separace nelze dosáhnout s využitím acidobázických rovnováh. Na Obrázku 59 je 

uveden izotachoforegram směsi kyselin používaných jako regulátory kyselosti. 

Obrázek 59 

Dvourozměrná izotachoforetická separace 

modelové směsi aniontů o koncentraci 0,05 

mmol l -1 . Záznamy byly pořízeny na analyzátoru 

v konfiguraci spojených kolon. Předseparační 

kapilára byla naplněna vedoucím elektrolytem 

10 mM HCl + 5,6 mM BTP (pH 6,1) a 

analytická kapilára elektrolytem 20 mM HCl + 

30 mM Glycin + 20 mM β-CD (pH 2.5); 

zakončující elektrolyt 5 mM-kapronová 

kyselina; L = vedoucí anion (chlorid), T = 

koncový anion (kapronan), 1 = fosforečnan, 2 = 

vinan, 3 = fumarát, 4 = citrát, 5 = mravenčan, 6 

= jablečnan, 7 = mléčnan, 8 = benzoan. 

2 3 4 5 6 

Analýza byla provedena na analyzátoru se spojenými kapilárami metodou 2D-CITP 

(podrobnosti viz obrázek). 

cc vápenato-dvojsodná sůl 


L 

1 

R 

7 

8 

čas 

T


6.2.5 Náhradní sladidla 

Mezi nejpoužívanější náhradní ionogenní sladidla lze v současnosti zařadit aspartam 

(E951), acesulfam K (E950), a sacharin (E954). V osmdesátých letech jsem 

v souvislosti s uvažovanou výrobou aspartamu dd v tehdejším Československu 

vypracoval metodu 155 stanovení této látky v potravinách. Metoda je též využitelná pro 

stanovení některých nečistot ee vznikajících při syntéze této látky. 

Obrázek 60 

Izotachoforegram Coca-Coly, A - 

5µl vzorek; B - 5 µl vzorek + 300 

ppm aspartamu; LE: 5 mM-HAc + 

TRIS, pH 7,7, TE: 5 mM-His + 

TRIS, pH 7,8, I=200/30 µA, LOD 

je 2 mg/l, při použití koncentrační 

kaskády LE2=LE1/5 - snížení 

detekčního limit na 0.2 mg/l. 

Sacharin a acesulfam K byly stanoveny v nealkoholických nápojích anionickou 

izotachoforetickou analýzou 156, 157 za použití vedoucího elektrolytu o nízkém pH. 

V infúzních roztocích stanovila Pospíšilová 158 neionogenní sorbitol (E420), mannitol 

(E966) a xylitol (E967) metodou CITP s využitím borátových komplexů pro mobilizaci 

těchto nenabitých polyolů. Při anionické analýze byl vedoucím elektrolytem roztok 10 

mM-HCl + 20 mM-imidazolu, pH 7.1 a zakončujícím 20 mM-boritá kyselinu + 

imidazol, pH 8.1. Analýzy byly prováděny na jednokapilárovém analyzátoru 

AGROFOR (120 x 0,3 mm I.D.) s vodivostní detekcí. Výsledky dosažené 

izotachoforetickou metodou byly srovnatelné s těmi, které byly získány lékopisnou 

jodometrickou metodou. 

dd vzhledem k tomu, že aspartam je ochranná známka, byl v Československu zaveden název USAL 

ee L-aspartyl-L-fenylalanin, dioxopiperazin a β-aspartam = L-fenylalanyl-L-asparagová kyselina, což je na rozdíl od 

aspartamu látka hořké chuti 


6.2.6 Látky chuťové a povzbuzující 


Do této skupiny přídatných látek používaných v potravinách patří zejména glutamová 

(E620 – 625), guanylová (E626 – 629) a inosinová kyselina (E630 – 633) a jejich soli, 

chinin sulfát nebo chlorid a kofein. Kenndler 159 stanovil ve vybraných potravinách 

metodou CITP v jedné analýze glutamát, guanosin 5'-monofosfát a inosin 5'- 

monofosfát. Použili jsme stejný operační systém pro stanovení glutamové kyseliny ve 

vybraných potravinách za použití jednokapilárového analyzátoru IOPNOSEP 900.1. 

Metodou CITP lze během 15 minut prakticky bez předúpravy vzorku stanovit toto 

ochucovadlo s dostatečnou přesností 160 . 

Obrázek 61 

Stanovení glutamové kyseliny 

(a – standard a b v 1000x 

zředěné sojové omáčce); 

analýza provedena na 

analyzátoru IONOSEP 900.1 

v operačním systému 10 mM 

HCl + 20 mM L-histidin + 

0,1% HPMC, pH 6,0 (LE); 5 

mM MES (TE). 

Chinin 161 byl stanoven v nealkoholických nápojích a v moči konzumenta po požití 

nápoje obsahujícího chinin metodou CITP v kationickém módu. Modifikovaný 

operační systém jsem použil pro stanovení chininu v toniku. Jako vedoucí elektrolyt 

posloužil roztok 5 mM-NH4OH + 10 mM-MES a 5 mM-histidin hydrochlorid jako 

zakončující. Úprava vzorku spočívala pouze v odstranění oxidu uhličitého působením 

tepla nebo ultrazvuku a vhodným naředěním. Analýza byla provedena na 

analyzátoru se spojenými kapilárami a při vodivostní detekci kombinované s UV 

detekcí při 254 nm a detekční limit byl 5 mg/l. Jedna analýza trvala včetně úpravy 

vzorku 20 minut. Na obrázku je znázorněn záznam standardu chininsulfátu o 

koncentraci 50 mg/l (počítáno na chinin) a 5krát zředěného nealkoholického nápoje 

Tonic Schweppes. Obsah chininu lze vyhodnocovat buď ze záznamu vodivostního 

detektoru (délka vlny), nebo ze záznamu UV detektoru (plocha pod křivkou). 



Současný záznam z konduktometru (výška vlny) a UV detektoru (absorbuje-li 

příslušná vlna stejně ff jako standard) je velmi cenný pro identifikaci chininu ve 

složitějších matricích vzorku. 

A254 

R 

Obrázek 62 

A 

chinin 

chinin 

Izotachoforegram standardu chininu (50 mg/l) (A) a 5krát zředěného nápoje Tonic Schweppes 

(B); záznamy jsou z analytické kapiláry. 

6.2.7 Ostatní 

Z ostatních přídatných látek, které je možné izotachoforeticky stanovit, lze jmenovat 

dusičnany (E251, 252) a dusitany (E249, 250) v solících či nakládacích směsích pro 

masné výrobky, polyfosfáty gg (E452) v přípravcích používaných v masné výrobě, 

křemičitany a fosfáty v protihrudkujících směsích a další. Například Janoš 162 popsal 

stanovení toxického trimetafosfátu v difosforečnanech (E450), které se používají 

jako aditiva při výrobě potravin. EDTA (E385) se díky svým vlastnostem používá jako 

konzervační látka, sekvestrační přísada i jako antioxidační aditivum. V majonézách 

se EDTA používá za účelem prodloužení použitelnosti. Vytváří totiž s kovy, jako je 

železo či měď, pevné komplexy a tyto kovy již nemohou katalyzovat oxidaci tuků. 

ff výška „pařezu“ na UV záznamu 

gg mono- až hexafosfáty 


B 

čas


Povolená hladina EDTA v majonéze je 75 mg/kg. Vypracovali jsme metodu 163 

stanovení této látky v majonéze. Na rozdíl od dosud popsaných metod naše metoda 

nevyžaduje náročnou předúpravu vzorku, nýbrž jednoduchou extrakci vodou 

následovanou odstředěním tuku před analýzou. EDTA jsme stanovili ve formě silně 

absorbujícího hh komplexu se Fe 3+ metodou CITP-CZE. Dosažený detekční limit 2 

mg/kg je vzhledem k povolené hladině dostatečný pro uspokojivou kvantifikaci. Naše 

metoda má oproti izotachoforetickému stanovení popsaného japonskými autory 164 tu 

výhodu, že není nutná předúprava vzorku. Na následujícím obrázku je uveden 

záznam analýzy majonézy. V izotachoforetickém kroku je komplex Fe(III)-EDTA 

zakoncentrován v předseparační kapiláře do krátké zóny a tato je nadávkována do 

analytické kapiláry, kde je po separaci zónovou elektroforézou detegována při 254 

nm. Operační systém je zvolen tak, aby byl maximálně potlačen vliv matrice 

majonézy, takže získaný izotachoforegram je jednoduchý a snadno vyhodnotitelný. 

Obrázek 63 

Izotachoforegram analýzy extraktu majonézy (2g vzorku/100 ml) metodou CITP-CZE. 

Analýza provedena na analyzátoru se spojenými kapilárami; záznam z vodivostního detektoru 

předseparační kapiláry (1) a UV detektoru analytické kapiláry (2). 

hh při 254 nm 



6.3 Kontaminanty potravin 

Z látek kontaminujících potraviny byly izotachoforézou stanoveny těžké kovy, rezidua 

pesticidů a další látky. V následujících kapitolách bude v krátkosti pojednáno o této 

skupině látek. 

6.3.1 Těžké kovy 

Ačkoliv je analýza těžkých kovů doménou spektrálních metod, je možné tyto 

elementy stanovit i separačními technikami jako HPLC nebo CITP. Everaerts 165 

vyvinul metodu CITP stanovení těžkých kovů v kapalných vzorcích a demonstroval 

tuto techniku na stanovení Fe, Cu, Zn, Pb a Al v séru. V operačním systému 20 mM- 

KOH + α-HIBA + HAc, pH 4,1 (LE) a 5 mM-HAc (TE) lze během 15 minut stanovit 

Mn, Cd, Co, Zn, Ni, Pb, Cu a Al. Záznam modelové směsi v tomto operačním 

systému je uveden na následujícím obrázku. 

↑ R 

NH 4 

Ba 

Na CaMg MnCd Co 

Ni Zn 

Pb 

Cu 

15 16 

min 

Al 

Obrázek 64 

Izotachoforegram modelové 

směsi 12 prvků (á 0.1mM); 

analýza provedena na 

jednokapilárovém analyzátoru 

AGROFOR při hnacím proudu 

150 µA. 

Vzhledem k nepříliš 

nízkému detekčnímu limitu 

(~ µmol/l) je nutné u většiny 

vzorků provést 

zakoncentrování na 

selektivním sorbentu. Autoři 

užili při analýze séra katexu 

Chelex 100, který má extrémně nízkou afinitu k Na + iontům, a dosáhli detekčního 

limitu řádu desítek µg/l. Tuto metodiku lze použít i pro potravinářské vzorky. U 


H


pevných vzorků je nutné před selektivní sorpcí mineralizovat na suché, nebo mokré 

cestě. Nevýhodou výše uvedeného systému je to, že malou změnou pH vedoucího 

elektrolytu se zhroutí separace Cu a Al. Z tohoto důvodu jsem nalezl robustnější 

operační systém umožňující stanovení stejných prvků. Záznam analýzy modelové 

směsi těžkých kovů je na následujícím obrázku. 

R 

+ 

NH4 Cd ++ 

Zn ++ 

Pb ++ 

Cu ++ 

Al +++ 

čas 

H 3 O + 

Obrázek 65 

Izotachoforegram směsi standardů kovů 

o koncentraci 0,5 mM každého prvku; 

analýza provedena v operačním systému 

30 mM-NH4Ac + 10 mM-kyselina 

glykolová (LE) a 5 mM-HAc (TE) na 

jednokapilárovém analyzátoru IONOSEP 

900.1. 

Tento operační systém jsem použil 

pro stanovení těžkých kovů v pitné 

vodě. Pro zakoncentrování jsem použil selektivní sorbent Spheron 1000 OXIN. Při 

1000násobném zakoncentrování, tj. kovy zachyceny z 1000 ml vzorku vody a ze 

sorbentu uvolněny do konečného objemu 1 ml, jsem dosáhl detekčního limitu 

v jednotkách µg/l. 

Tanaka 166 separoval Hg ++ , Cd ++ , Zn ++ , Ag + , Co ++ a Cu ++ ve formě záporně nabitých 

kyanokomplexů v operačním systému 5 až 15 mM-HCl + TRIS, pH 7,5 (LE) a 10 

mM-KCN + Ba(OH)2 (TE). 

6.3.2 Rezidua biocidů 

Stránský 167 vypracoval izotachoforetickou metodu stanovení kationických herbicidů 

ve vodě a půdě. Za různých separačních podmínek stanovil kvartérní kationické 

herbicidy chlormequat, paraquat a diquat a triaziny atraton, prometryn, atrazin, 

simazin a další ve vodě po extrakci organickým rozpouštědlem. Zpětný nález na 

koncentrační úrovni stovek µg/l byl 70 až 95 %, LOD ~ 10 µg/l. 



Rezidua kationických herbicidů promethrynu, desmethrynu, terbutrynu a 

hydroxyderivátů atrazinu a simazinu stanovila metodou CITP Křivánková 168 v mléku. 

Dosažený detekční limit byl ~1 µg/l mléka a zpětný nález na úrovni 50 µg/l asi 65 %. 

Dombek 169 vyvinul izotachoforetickou metodu stanovení pyrethroidů alfamethrinu a 

cypermethrinu. Vzhledem k tomu, že uvedené insekticidy jsou látky neionogenní 

povahy byly po extrakci ze vzorku podrobeny alkalické hydrolýze. Produkty 

hydrolýzy, tj. cis- a trans-dichlorchrysantemová kyselina, byly stanoveny 

v anionickém módu CITP. 

Účinná složka herbicidu „RoundUp“ glyfosat (GLYF) a její metabolit kyselina 

aminomethanfosfonová (AMPA) byly stanoveny metodou CITP na analyzátoru se 

spojenými kapilárami 170 . Bez předúpravy vzorku je možné stanovit tyto látky na 

koncentrační hladině ~ 1 mg/l. Záznam analýzy extraktu jablka je uveden na 

následujícím obrázku. 

Obrázek 66 

Izotachoforegram analýzy extraktu jablka (1g extrahován 2 ml vody) v anionickém módu za 

použití operačního systému 10 mM-HCl + His, pH 5,8 (LE) a 5 mM-MES + TRIS (TE); A – 

záznam vodivostního detektoru předseparační kapiláry a B – záznam vodivostního detektoru 

analytické kapiláry. 


6.3.3 Ostatní kontaminanty 


Do této skupiny lze například zařadit dusičnany v zelenině, fosfáty ve vodě. 

Stanovení dusičnanů a fosfátů již bylo probráno v příslušné kapitole (viz 6.1.2). Na 

následujícím obrázku je uveden záznam analýzy pitné vody dvojrozměrnou CITP. 

Obrázek 67 

Záznam analýzy pitné 

vody provedené na 

analyzátoru se 

spojenými kapilárami 

dvourozměrnou CITP. 

Použitý operační 

systém byl tvořen 

vedoucím elektrolytem 

o složení 8 mM - HCl 

+ 3 mM - BTP +1,5 

mM-β - Alanin, pH 

3.55 (předseparační 

kapilára), 2 mM-HCl + 

β - Alanin, pH 3,55 

(analytická kapilára) a 

10 mM - citronovou 

kyselinou; (A) předseparační kapilára – stanovení makrosložek, tj. chloridů, síranů a 

dusičnanů a (B) analytická kapilára – stanovení mikrosložek, tj. dusitanů, fluoridů a fosfátů. 

Dosažitelný detekční limit je pro makrosložky ~ 1 mg/l a pro mikrosložky o řád nižší. 

Těkavé mastné kyseliny (n-C4 až n-C9) ve vodě stanovil Hutta 171 CITP metodou. Po 

jejich zakoncentrování na makroporézním karborafínu bylo na analyzátoru se 

spojenými kapilárami dosaženo detekčního limitu jednotek µg/l. 


Použitá literatura 

7. Použitá literatura 

1 Everaerts F.M., Beckers J.L., Verheggen T.P.E.M.: Isotachophoresis: Theory, 

Instrumentation and Applications, Elsevier, Amsterdam (1976). 

2 Kohlrausch F.W.G.: Über Konzentrationen-Verschiebungen durch Elektrolyse im 

Inneren von Lösungen und Lösungsgemischen, Ann. Phys. (Leipzig), 62, 209 

(1897). 

3 Kendall J., Crittenden E.D.: The separation of isotopes, Proc. Nat. Acad.Sci. U.S., 

9, 75 (1923). 

4 Longsworth L.G.: Moving boundary separation of salt mixtures, Nat. Bur. Stand. 

(U.S.) Circ., 524, 59 (1953). 

5 Konstantinov B.P., Ošurkova O.V.: Экспрессный микроанализ химических 

элементов методом движущейся границы (Rapid microanalysis of the 

chemical elements by the moving boundary method), Dokl. Akad. Nauk SSSR, 

148, 1110 (1963). 

6 Schumacher E., Studer T.: Qulitative und quantitative Mikroanalyse von 

Sauregemischen durch Elektrophorese in pH-Gradienten, Helv. Chim. Acta, 47, 

957 (1964). 

7 Haglund H.: Isotachophoresis. A principle for analytical and preparative separation 

of substances such as proteins, peptides, nucleotides, weak acids and metals, 

Sci. Tools, 17, 2 (1970). 

8 Dolník V.: Úvod do kapilární elektroforézy, © Vladislav Dolník (1994). 

9 Kaniansky D.: Základný kurz izotachoforézy, Příručka pro uživatele 

izotachoforetického analyzátoru CS ISOTACHOFORETIC ANALYSER, Spišská 

Nová Ves, (1984). 

10 Boček P., Deml M., Gebauer P., Dolník V.: Analytická kapilární isotachoforéza, 

Pokroky chemie, Academia Praha (1987). 

11 Stránský Z., Dostál V.: Analytická kapilární izotachoforéza, Nové směry 

v analytické chemii zemědělských laboratoří, PřF UP Olomouc (1988). 

12 Moore W.J.: Physical Chemistry, 4. vydání, Prentice-Hall, Inc., New Jersey, USA 

(1972), český překlad Č. Černého a A. Schutze vydalo SNTL v roce 1979 

13 Schumacher E.: Über fokussierenden Ionenaustausch I. Prinzip und einfache 

Theorie, Helv. Chim. Acta, 40, 221 – 228 (1957). 

14 Righetti P. G., Gelfi C.: Isoelektric focusing in capillaries and slab gels: a 

comparison, J. Cap. Elec., 1, 27 (1994). 

15 International Critical Tables, vol. VI, Mc Graw-Hill, New York 1929. 



16 Hirokawa T., Nishino M., Aoki N., Kiso Y.: Table of isotachophoretic indices, J. 

Chromatogr., 221, D1-D106 (1983). 

17 Blatný P.: Simulace ustáleného stavu při isotachoforetické analýze, Diplomová 

práce, VŠCHT Praha (1991). 

18 Kotrlý K., Šůcha L.: Handbook of Chemical Equilibria in Analytical Chemistry, s. 

24, Elis Horwood (Editor), London (1985). 

19 Blatný P.: Využití kapilární elektroforézy v analýze krmiv, Disertační práce, 

VŠCHT Praha (1996). 

20 Foret F., Křivánková L., Boček P.: Capillary zone electrophoresis, (editor Radola 

B. J.), VCH, Weinheim: (1993). 

21 Boček P., Ryšlavý Z., Deml M., Janák J.: Stationary mean temperatures and 

radial temperature profiles in capillary isotachophoresis, Coll. Czech. Chem. 

Commun., 42, 3382 – 3387 (1977). 

22 Gaš B.: Axial temperature effects in electromigration, J.Chromatogr., 644, 161 – 

174 (1993). 

23 Kvasnička F.: Nepublikované výsledky, VŠCHT Praha, březen 1998. 

24 Beckers J.L.: Isotachophoresis. Some fundamental aspects, Thesis, University of 

Technology, Eindhoven, Holandsko (1973). 

25 Boček P., Deml M., Kaplanová B., Janák J.: Analytical isotachophoresis – teh 

concept of the separation capacity, J. Chromatogr., 160, 1 – 9 (1978). 

26 Mikkers, F.E.P., Everaerts F.M., Peek J.A.F.: Isotachophoresis: the concepts of 

resolution, load capacity and separation efficiency, I. Theory, J. Chromatogr., 

168, 293 –315 (1979). 

27 Bier M., Palusinski O.A., Mosher R.A., Saville D.A.: Electrophoresis: Mathematical 

modelling and computer simulation, Science, 219, 1281 – 1287 (1983) 

28 Gaš B., Vacík J., Zelenský I.: Computer aided simulationof electromigration, 

J.Chromatorg., 545, 225 – 237 (1991) 

29 Mikkers, F.E.P., Everaerts F.M., Peek J.A.F.: Isotachophoresis: the concepts of 

resolution, load capacity and separation efficiency, II. Experimental evaluation, J. 

Chromatogr., 168, 317 –332 (1979). 

30 Kenndler E.: Capilary zone electrophoresis and isotachophoresis: A comparison 

by information theory, Chromatographia, 30, 713 – 718 (1990) 

31 Marák J., Laštinec J., Kaniansky D., Madajová V.: Computer-assisted choice of 

electrolyte systems and spacing constituents for two-dimensional capillary 

isotachophoresis., J. Chromatogr., 509, 287 - 299 (1990). 

32 Kaniansky D., Marák J.: Online coupling of capillary isotachophoresis with 

capillary zone electrophoresis., J. Chromatogr. 498, 191 - 204 (1990). 



33 Křivánková L., Gebauer P., Thormann W., Mosher R. A., Boček P.: Options in 

electrolyte systems for on-line combined capillary isotachophoresis and capillary 

zone electrophoresis. J. Chromatogr., 638, 119 - 135 (1993). 

34 Kaniansky D., Marák J., Madajová V., Šimuničová E.: Capillary zone 

electrophoresis of complex ionic mixtures with online isotachophoretic sample 

pre-treatment., J. Chromatogr., 638, 137 - 146 (1993). 

35 Kaniansky D.: Kapilárna izotachoforéza, Základné principy, ÚRVJT VVZ PJT 

Spišská Nová Ves (1984) 

36 Kašička V., Prusík Z.: Desorption isotachophoresis as a tool for sorbent 

characterization on a microscale - a survey., J. Chromatogr., 390, 39 – 50 

(1987). 

37 Boček P. (editor): Isotachophoresis: Basic course – Advanced course, 4 th 

International Symposium on Isotachophoresis ITP8´84, Hradec Králové (1984) 

38 Boček P., Gebauer P., Deml M.: Migration behaviour of the hydrogen ion and its 

role in isotachophoresis of cations, J. Chromatogr., 217, 209 – 224 (1981). 

39 Boček P., Gebauer P., Deml M.: Concept of the effective mobility of the hydrogen 

ion and its use in cationic isotachophoresis, J. Chromatogr., 219, 21 – 28 (1981). 

40 Gebauer P., Křivánková L., Boček P.: Inverse electrolyte systems in 

isotachophoresis, J. Chromatogr., 470, 3 – 20 (1989). 

41 Boček P., Gebauer P.: Some problems encountered in the selection of electrolyte 

systems in isotachophoresis, Electrophoresis, 5, 338 – 342 (1984) 

42 Křivánková L., Foret F., Gebauer P., Boček P.: Selection of electrolyte systems in 

isotachophoresis, J.Chromatogr., 390, 3 – 16 (1987) 

43 Gebauer P., Boček P.: The concept of the zone existence diagram and its use in 

cationic systems, J.Chromatogr., 267, 49 - 65 (1983) 

44 Boček P., Gebauer P., Deml M.: Analytická izotachoforéza kationtů, Chem.listy, 

78, 510 – 530 (1984) 

45 Haglund H.: Isotachophoresis. A principle for analytical and preparative 

separation of substances such as proteins, peptides, nucleotides, weak acids, 

metals., Sci.Tools, 17, 2 – 21 (1970). 

46 Blatný P., Kvasnička F., Kenndler E. Time Course of Formation of Inositol 

Phosphates During Enzymatic Hydrolysis of Phytic Acid by Phytase Determined 

by Capillary Isotachophoresis, J. Chromatogr., 679(2), 345 - 348 (1994). 

47 Jelinek I.; Snopek J.; Smolkova-Keulemansova E.: Influence of counter-ion 

inclusion complexation on the quality of cyclodextrin-supported separations in 

isotachophoresis., J.Chromatogr., 557, 215-226 (1991). 



48 Blatný P., Kvasnička F., Kenndler E.: Determination of anionic feed additives by 

two-dimensional capillary isotachophoresis, J. Chromatogr. A, 737, 255 - 262 

(1996). 

49 Madajová V., Turcelová E., Kaniansky D.: Influence of poly(vinylpyrrolidone) on 

isotachophoretic separations of inorganic anions in aqueous electrolyte 

systems., J. Chromatogr., 589, 329 - 332 (1992). 

50 Kenndler E., Jenner P.: Isotachophoresis in mixed solvents, consisting of water, 

methanol and dimethyl sulphoxide, I. The acid-base and migration behaviour of 

substituted benzenecarboxylic acids, J. Chromatogr., 390, 169 – 183 (1987). 

51 Kenndler E., Jenner P.: Isotachophoresis in mixed solvents, consisting of water, 

methanol and dimethyl sulphoxide, II. Solavtion effects on the acid-base and 

transport properties of cation acids of the ammonium ion type, J. Chromatogr., 

390, 185 – 197 (1987). 

52 Kenndler E., Schwer Ch., Jenner P.: Isotachophoresis in mixed solvents, 

consisting of water, methanol and dimethyl sulphoxide, III. Influence of the 

composition on the dissociation constants and mobilities of non- and hydroxysubstituted 

aliphatic carboxylic acids, J. Chromatogr., 470, 57 – 68 (1989). 

53 Sarmini K.; Kenndler E.: Influence of organic solvents on the separation selectivity 

in capillary electrophoresis., J.Chromatogr. A, 792, 3-11 (1997). 

54 Kvasnička F.: Nepublikované výsledky, VŠCHT Praha (1993) 

55 Beckers J.L., Everaerts F.M.: Isotachophoresis with two leading ions and 

migration behaviour in capillary zone electrophoresis: I. Isotachophoresis with 

two leading ions, J. Chromatogr., 508, 3 – 17 (1990). 

56 Everaerts F.M., Verheggen T.P.E.M., Mikkers F.E.P.: Determination of 

substances at low concentrations in complex mixtures by isotachophoresis with 

column coupling., J.Chromatogr., 169, 21 – 38 (1979). 

57 Kaniansky, D.; Marák, -J.; Rajec, P.; Švec, A.; Koval, M.; Lúčka, M.; Sabanoš, G.: 

On-column radiometric detector for capillary isotachophoresis and its use in the 

analysis of carbon-14-labelled constituents., J. Chromatogr.; 470(1), 139-153 

(1989). 

58 New BioFocus LIF 2 detector., http://www.biorad.com/apps/t3server/templates/tafs/searchBioRad.taf?division_id=corp, 

stránka navštívena v dubnu 1999 

59 Kaniansky D., Havaši P., Marák J., Sokolík R.: Post-column amperometric 

detection in capillary isotachophoresis., J. Chromatogr., 366, 153 –160 (1986) 

60 Kaiser K. P., Hupf H.: Isotachophorese in der Lebensmittelanalytik, 1. Teil: Prinzip 

der Isotachophorese. Nachweis und Bestimmung von Säuren, 

Dtsch.Lebensm.Rdsch., 75, 300 –304 (1979). 



61 Kaiser K. P., Hupf H.: Isotachophorese in der Lebensmittelanalytik, 2. Teil: 

Untersuchungen von Lebensmitteln., Dtsch.Lebensm.Rdsch., 75, 346 –349 

(1979). 

62 Klein H., Stoya W.: Anwendung der Isotachophorese (Ionophorese) in der 

Lebensmittelanalytik., Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg., 79, 413 – 432 (1988). 

63 Blatný P., Kvasnička F.: Application of capillary isotachophoresis and capillary 

zone electrophoresis to the determination of inorganic ions in food and feed 

samples, J. Chromatogr. A, 834, 419-431 (1999). 

64 Zelenský I., Pešlová H., Kaniansky D.: Determination of alkalies in plant material 

by capillary isotachophoresis., Agrochémia, 29, 160 - 163 (1989). 

65 Stover F.S.: Isotachophoresis of metal-neutral ligands complexes: 18-crown-6 

ether complexes with alkali metals., J. Chromatogr., 298, 203 – 210 (1984). 

66 Zelenská V., Kaniansky D., Zelenský I., Polák M.: Sborník 3. celostátní 

konference Izotachoforetické dni, 38 - 39, Spišská Nová Ves, Československo, 

(1991). 

67 Izotachoforetické stanovenie amoniaku, sodíka, draslíka, vápníka a hořčíka vo 

vodách, Slovenská Technická Norma 75 7431 (1997). 

68 Kvasnička F.: Analysis of starch and its products, Acta Alimentaria Polonica, XVII 

(4), 317 - 325 (1991). 

69 Kvasnička F., Parkin G., Harvey CH.: Capillary Isotachophoresis as a New Tool in 

Sugar Factory Analysis, Int. Sugar J., 95, 451 - 458 (1993). 

70 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení draslíku, sodíku, vápníku a hořčíku v mléku, 

Aplikační list č. 32, Recman- laboratorní technika (1994). 

71 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení draslíku, sodíku, vápníku a hořčíku ve víně, 

Aplikační list č. 33, Recman- laboratorní technika (1994). 

72 Fukushi,-K; Hiiro,-K: Determination of ammonium ion in sea-water by capillary 

isotachophoresis. Talanta.; 35(10), 799-802 (1988). 

73 Blatný P., Kvasnička F., Loučka R., Šafářová H.: Determination of ammonium, 

calcium, magnesium and potassium in silage by capillary isotachophoresis, J. 

Agric. Food Chem., 45, 3554-3558 (1997). 

74 Kvasnička F.: Nepublikované výsledky, VŠCHT Praha (1997). 

75 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení amonného iontu, vápníku, sodíku a hořčíku 

v silážích a senážích, Aplikační list č. 7, Recman-laboratorní technika (1994). 

76 Vacík J., Muselasová I.: Isotachophoretic determination of anionic and cationic 

species in well and surface waters., J.Chromatogr., 320, 199-203 (1985). 



77 Fanali S., Foret F., Boček P.: Determination of potassium, sodium, calcium and 

magnesium in dialysis solution for artificial kidneys by capillary isotachophoresis, 

Pharmazie 40, 653 (1985). 

78 Matejovič I., Polonský J.: Isotachophoretic analysis of cations important in plant 

nutrition, J. Chromatogr., 390, 155 –160 (1987). 

79 Everaerts F.M., Verheggen T.P.E.M., Reijenga J.C., Aben G.V.A., Gebauer P., 

Boček P.: Determination of heavy metals by isotachophoresis., J.Chromatogr., 

320, 263-268 (1985). 

80 Hirama Y., Yoshida H.: Non-aqueous capillary isotachophoretic determination of 

heavy-metal ions as chloro-complexes after extraction of the 

diethyldithiocarbamate chelates., Nippon-Kagaku-Kaishi, 7, 943 – 949 (1986). 

81 Zelenský I., Kaniansky D., Havaši P., Verheggen T.P.E.M., Everaerts F.M.: 

Photometric detection of metal cations in capillary isotachophoresis based on 

complex equilibria, J.Chromatogr., 470, 155 –169 (1989). 

82 Hutta M., Kaniansky D., Šimuničová E., Zelenská V., Madajová V., Šišková A.: 

Solid-phase extraction for sample preparation in trace analysis of ionogenic 

compounds by capillary isotachophoresis., J.Radioanal.Nucl.Chem., 163, 87-98 

(1992). 

83 Blatný P., Kvasnička F. Kenndler E.: Trace determination of iron in water on the 

ppb level by UV detection of the Fe(III)-EDTA complex with on-line coupling of 

capillary isotachophoresis and capillary zone electrophoresis, J. Chromatorg. A, 

757, 297 - 302 (1997). 

84 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení dusičnanu v zelenině, Aplikační list č. 27, 

Recman-laboratorní technika (1994). 

85 Karovičová J., Polonský J., Drdák M., Príbela A.: Determination of nitrates in 

vegetables by capillary isotachophoresis., Nahrung, 34, 765-767 (1990). 

86 Písaříková B., Herzig I., Říha J.: Inorganic anions with potential strumigenic 

effects in potable water for humans and animals., Veterinarní Medicína, 41, 33- 

39 (1996). 

87 Izotachoforetické stanovenie chloridov, dusičnanov, síranov, dusitanov, fluoridov 

a fosforečnanov vo vodách, Slovenská Technická Norma 75 7430 (1997). 

88 Krýsl S.: Determination of nitrates in biological materials., Chem.Listy, 84, 281- 

291 (1990). 

89 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení chloridu, síranu a fosforečnu v potravinách, 

Aplikační list č. 20, Recman-laboratorní technika (1994). 

90 Kováč J., Farkaš J., Svoboda M.: Využitie izotachoforézy na stanovenie látok 

viažúcich oxid siričitý vo víně., Kvas.prům., 35, 296 – 299 (1898). 



91 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení volného siřičitanu ve víně, Aplikační list č. 31, 


92 Boček P., Medziak I., Deml M., Janák J.: Use of complex formation equilibria in 

the analytical isotachophoresis of strong electrolyte ions. Separation of halides 

and sulphates., J.Chromatogr., 137, 83 – 91 (1977). 

93 Kaniansky D., Zelenský I., Hybenová A., Onuska F.I.: Determination of chloride, 

nitrate, sulfate, nitrite, fluoride, and phosphate by on-line coupled capillary 

isotachophoresis – capillary zone electrophoresis with conductivity detection., 

Anal.Chem., 66, 4258 – 4264 (1994). 

94 Blatný P. a Kvasnička F.: Determination of fluoride in feed mixtures by capillary 

isotachophoresis, J. Chromatogr., 670, 223 - 228 (1994). 

95 Matějovič I., Bielikova M.: Isotachophoretic determination of soluble nitrates, 

nitrites, sulphates and phosphates in plant material., Collect.- 

Czech.Chem.Commun., 53, 3067-3071 (1988). 

96 Zelenský I., Zelenská V., Kaniansky D.: Isotachophoretic determination of 

chromium(IV) at low parts per billion concentrations., J.Chromatogr., 390, 111- 

120 (1987). 

97 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných organických a anorganických 

kyselin v cukru a cukerných roztocích I, Aplikační list č. 11, Recman-laboratorní 

technika (1994). 

98 Meissner, Th., Eisenbeiss, F., Jastorff, B.: Determination of anionic trace 

impurities in glycerol by capillary isotachophoresis with enlarged sample load., 

J.Chromatogr., A, 810, 201-208 (1998). 

99 Rubach K., Offizorz P., Bremez Z.: Bestimmung von Histamin in Fisch- und 

Fischkonzerven mittels Capillar – Isotachophorese., Z.Lebensm.Unters.Forsch., 

172, 351 – 354 (1981). 

100 Voldřich M., Hrdlička J., Opatová H.: Stanovení histaminu v rybách metodou 

kapilární izotachoforézy., Potr.Vědy, 6, 99 – 103 (1988). 

101 Průša K., Smejkal O.: Použití izotachoforézy pro rozlišení kyselin ve víně., Kvas. 

prům., 29, 7 – 9 (1983). 

102 Farkaš J., Kovaľ M.: Využitie izotachoforézy na identifikáciu a stanovenie kyselín 

vo víne., Kvas.prům., 28, 256 – 260 (1982). 

103 Farkaš J., Kovaľ M.: Stanovení kyselin ve víně pomocí izotachoforézy II., 

Vinohrad, 20, 186 – 187 (1982). 

104 Reijenga J.C., Verheggen T.P.E.M., Everaerts F.M.: Simultaneous determination 

of organic and inorganic acids and additives in wines by capillary isotachophoresis 

using UV and a.c. conductivity detection., J.Chromatogr., 245, 120 – 125 (1982). 



105 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin ve víně, Aplikační list č. 

10, Recman-laboratorní technika (1994). 

106 Štechová A., Kvasnička F., Čopíková J., Kadlec P.: Chování necukrů během 

epurace surové šťávy I., Listy cukrov., 101, 223 - 228 (1985). 

107 Štechová A., Kvasnička F., Čopíková J., Kadlec P.: Chování necukrů během 

epurace surové šťávy II., Listy cukrov., 101, 278 - 284 (1985). 

108 Štechová A., Čopíková J., Kvasnička F., Kadlec P.: Chování necukrů během 

epurace surové šťávy IV., Listy cukrov., 102, 36 - 42 (1986). 

109 Kvasnička F., Čopíková J., Sterziková E.: Využití kapilární isotachoforesy v 

cukrovarnické analytice., Listy cukrov., 104, 255 - 259 (1988). 

110 Procházka L., Kvasnička F., Štechová A.: Stanovení těkavých mastných kyselin 

v melase, Kvasný průmysl, 32, 33 - 36 (1986). 

111 Procházka L., Štechová A.: Kyselina mravenčí ve výrobě cukru., Listy cukrov., 

103, 91 – 94 (1987). 

112 Engelhardt U.H., Maier H.G.: Säuren des Kaffees, Z. Lebensm. Unters. Forsch., 

178, 20 – 23 (1984). 

113 Scholze A., Maier H.G.: Säuren des Kaffees, VIII. Glykol- und Phosphorsäure., 

Z. Lebensm. Unters. Forsch., 181, 20 – 23 (1985). 

114 Nuyken-Hamelmann C., Maier H.G.: Säuren im Kakao., Z. Lebensm. Unters. 

Forsch., 185, 114 – 118 (1987). 

115 Barlianto H., Maier H.G.: Acids in chicory roots and malt., Z. Lebensm. Unters. 

Forsch., 198, 215 – 222 (1994). 

116 Karovičová J., Polonský J., Drdák M.: Stanovenia organických kyselín v džúsoch 

kapilárnou izotachoforézou., Potr. Vědy., 6, 105 – 110 (1988). 

117 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v sýrech, Aplikační list č. 


118 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v mouce a droždí, 


119 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v bramborách, Aplikační 

list č. 31, Recman-laboratorní technika (1994). 

120 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v rajských jablkách, 


121 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení mléčnanu ve vejcích, Aplikační list č. 45, 


122 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v mléce, Aplikační list č. 




123 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v ovoci, Aplikační list č. 43, 


124 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných kyselin v mase, Aplikační list č. 46, 


125 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení vybraných organických a anorganických 

kyselin v cukru a cukerných roztocích III, Aplikační list č. 13, Recman-laboratorní 

technika (1994). 

126 Futschik K., Ammann M., Bachmayer S., Kenndler E.: Determination of ionic 

species formed during growth of Escherichia coli by capillary isotachophoresis., 

J.Chromtogr., 644, 389 – 395 (1993) 

127 Kvasnička F.: Isotachoforetické stanovení kyseliny citronové a isocitronové 

v džusech, Apilkační list pro analyzátor EA 100, Villa-Labeco, (1998). 

128 Kvasnička F., Prášil T., Zbudilová D., Svobodová M.: Stanovení lysinu v krmných 

směsích metodou kapilární isotachoforesy., Biol. Chem. Vet. (Praha), XXII, 471 - 

478 (1986). 

129 Kvasnička F.: Isotachophoretic determination of 3-methylhistidine, v tisku 

k publikaci v J. Chromatorg. A, 838, (1999). 

130 Holloway C.J.: Novel method for the isotachophoretic separation of amino-acids 

at low to intermediate pH after derivatization with citraconic anhydride., 

J.Chromatogr., 390, 97 – 100 (1987). 

131 Kaniansky D., Madajová V., Marák J., Šimuničová E., Zelenský I., Zelenská V.: 

Photometric detection at 405 nm in trace analysis by capillary isotachophoresis., 

J.Chromatogr., 390, 51 – 60 (1987). 

132 Röben R., Rubach K.: Determination of water soluble vitamins in vitamin 

preparations by isotachophoresis., Analytical and Preparative Isotachophoresis, 

109 – 116, Walter de Gruyter u. Co., Berlin (1984). 

133 Rubach K., Breyer C.: Bestimmung von L(+)-Ascorbinsäure und 

Dehydroaskorbinsäure in rückverdünnten Citruskonzentraten mittels 

Isotachophorese., Dtsch. Lebensm. Rdsch., 76, 228 – 231 (1980). 

134 Rubach K., Breyer C., Krüger E.: Das Verhalten von Ascorbinsäure während der 

Lagerung von Flaschenbier., Mschr. Brauerei, 33, 163 – 166 (1980). 

135 Pažitná G., Sochorová V.: Stanovenie kyseliny askorbovej v ovocných 

výrobkoch dojčenskej a detskej výživy., Průmysl potravin, 41, 246 – 247 (1990). 

136 Kvasnička F., Humpolíková P., Volkmerová D.: Stanovení kyseliny L-askorbové 

a L-dehydroaskorbové v systému pšeničná mouka – voda., Potrav. vědy, 6, 259 

- 269 (1988). 

137 Kašička V., Prusík Z.: Application of capillary isotachophoresis in peptide 

analysis., J. Chromatogr. Biomed. Appl., 107, 123 – 174 (1991). 



138 Stover F.S.: Cationic capillary isotachophoresis of proteins, J.Chromatogr., 445, 

417 – 423 (1988). 

139 Blatný P., Kvasnička F., Kenndler E.: Determination of Phytic Acid in Cereal 

Grains, Legumes and Feeds by Capillary Isotachophoresis, J. Agric. Food 

Chem., 43, 129 - 133 (1995). 

140 Klein H.: Quantitative Bestimmung von p-Hydroxybenzenglucosinolat (Sinalbin) 

und Allzlglucosinolat (Sinigrin) in Samen von Sinapis alba, Brassica juncea und 

Brassica nigra mittels Isotachophorese., Z. Acker. und Pflanzenbau, 150, 349 – 

355 (1981). 

141 Kvasnička F., Price K. R., Ng K., Fenwick G. R.: Determination of Potato 

Glycoalkaloids Using Isotachophoresis And Comparison With A HPLC Method, 

J. Liq. Chromatogr., 17(9), 1941 - 1951 (1994). 

142 Kvasnička F.: Nepublikované výsledky, IFR Norwich, UK (1993). 

143 Shimada K., Ohtsuru M., Yamaguchi T., Nigota K.: Determination of tetrodotoxin 

by capillary isotachophoresis., J. Food Sci.; 48, 665-667 (1983). 

144 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení volného siřičitanu ve víně, Aplikační list č. 34, 


145 Kvasnička F.: Nepublikované výsledky, VŠCHT Praha, 1995 

146 Karovičová J., Polonský J., Príbela A., Šimko P.: Isotachophoresis of some 

synthetic colorants in foods., J.Chromatogr., 545, 413 – 419 (1991). 

147 Masár M., Kaniansky D., Madajová V.: Seaparation of synthetic food colourants 

by capillary zone electrophoresis in a hydrodynamically closed separation 

compartment., J.Chromatgr. A, 724, 327 – 336 (1996). 

148 Kvasnička F.: Determination of 4-methylimidazole in caramel colour by capillary 

isotachophoresis, Electrophoresis, 10, 801 - 802 (1989). 

149 Karovičová J., Polonský J. Šimko P.: Determination of preservatives in some 

food products by capillary isotachophoresis., Nahrung, 35, 543 – 544 (1991). 

150 Madajová V., Marák J., Kaniansky D., Šimuničová E.: Stanovenie kyseliny 

benzoovej v potravinárskych výrobkoch dvojdimenzionálnou kapilárnou 

izotachoforézou, Chem. Listy, 86, 381 – 385 (1992) 

151 Rubach K., Breyer Ch.: Isotachophoretische Bestimmung der 

Konservierungsstoffe in Backwaren und deren Zutaten., Getreide Mehl. Brot., 35, 

91-93 (1981). 

152 Rubach K., Breyer Ch., Krchhoff E.: Isotachophoretische Bestimmung von 

Konservierungsstoffen., Z. Lebensm. Unters. Forsch., 170, 99 – 102 (1980). 

153 Pipek P., Beneš P., Kvasnička F.: Údržnost a kvalita mechanicky separovaného 

drůbežího masa, Maso, IX (6/98), 42 - 45 (1998). 



154 Blatný P., Kvasnička F., Kenndler E.: Determination of anionic feed additives by 

two-dimensional capillary isotachophoresis, J. Chromatogr. A, 737, 255 - 262 

(1996). 

155 Kvasnička F.: Analysis of the sweetener ASPARTAME by capillary 

isotachophoresis, J. Chromatogr., 390, 237 - 240 (1987). 

156 Rubach K., Offizorz P.: Determination of the sweeteners saccharin and 

cyclamate by capillary isotachophoresis., Dtsch. Lebensm. Rundsch., 79, 88-90 

(1983). 

157 Klein H., Stoya W.: Isotachophoretische Bestimmung von Acesulfam-K in 

Lebensmitteln., Ernaehrung, 11, 322-325 (1987). 

158 Pospíšilová M., Polášek M., Procházka J.: Separation and determination of 

pharmaceutically important polyols indosage forms by capillary 

isotachophoresis., J.Chromatogr. A, 772, 277 – 282 (1997). 

159 Kenndler E., Huber J.F.K.: Simultaneous identification and quantitation of the 

food additives glutamate, guanosine 5'-monophosphate and inosine 5'monophosphate 

by isotachophoresis., Z. Lebensm. Unters. Forsch., 171, 292- 

296 (1980). 

160 Blatný P., Kvasnička F.: Stanovení kyseliny glutamové v potravinách, Aplikační 

list č. 8, Recman-laboratorní technika (1994). 

161 Reijenga J.C., Aben G.V.A., Lemmens A.A.G., Verheggen T.P.E.M., Bruijn 

C.H.M.M.de. Everaerts F.M.: Determination of quinine in beverages, 

pharmaceutical preparations and urine by isotachophoresis., J. Chromatogr., 

320, 245 252 (1985). 

162 Janoš P.: Determination of trimetaphosphate in pyrophosphate by capillary 

isotachophoresis., J.Chromatogr., 516, 473 – 477 (1990). 

163 Kvasnička F., Míková K.: Determination of EDTA in Mayonnaise by On-Line 

Coupled Capillary Isotachophoresis - Capillary Zone Electrophoresis with 

Photometric Detection, J. Food Comp. and Anal., 9, 231 - 242 (1996). 

164 Ito Y., Toyoda M., Suzuki H., Iwaida M.: Isotachophoretic determination of 

ethylenediaminetetraacetate in salad dressing, mayonnaise, and margarine., 

JAOAC, 63, 1219-1223 (1980). 

165 Everaerts F. M., Verheggen T. P. E. M., Reijenga J. C., Aben G. V. A., Gebauer 

P., Bocek P.: Determination of heavy metals by isotachophoresis., J. 

Chromatogr., 320, 263 – 268 (1985). 

166 Tanaka S., Kaneta T., Yoshida H.: Capillary tube isotachophoretic separation of 

heavy metal ions using complex-forming equilibria between cyanide as 

terminating ion and the metal ions., J.Chromatogr., 447, 383-386 (1988). 



167 Stránský Z.: Isotachophoresis of cationic herbicides in waters and soils., 

J.Chromatogr., 320, 219 –231 (1985). 

168 Křivánková L., Boček P.: Tekel J., Kovačičová J.: Isotachophoretic determination 

of herbicides prometryne, desmetryne, terbutryne and hydroxy- derivatives of 

atrazine and simazine in extracts of milk., Electrophoresis, 10, 731 –734 (1989). 

169 Dombek V.: Determination of alphamethrine and cypermethrine in water and soil 

by capillary isotachophoresis., Analytica Chimica Acta., 256, 69 – 73 (1992). 

170 Analýza pesticídov v rastlinnom materiáli, Aplikační list č. 7, Villa-Labeco (1994). 

171 Hutta M., Šimuničová E., Kanianský D., Tkáčová J., Brtko J.: Isotachophoretic 

determination of short –chain fatty acids in drinking water after solid-phase 

extraction with a carbonaceous sorbent., J.Chromatogr., 470, 223 – 233 (1989).

1. Úvod

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?