Genotyp-Phänotyp Korrelation bei Fanconi Anämie - OPUS ...

Methoden
Die PCR besteht aus einer repetitiven Abfolge (30-35 Zyklen) folgender
Schritte:
- Denaturierung des DNA-Matritzenstranges bei ca. 95°C,
- Hybridisierung der Primer an ihre komplementäre Zielsequenz auf dem
Matritzenstrang („annealing-Phase“) bei 54-68°C,
- Elongation der DNA-Kette durch die DNA-abhängige DNA-Polymerase
bei ca. 72°C.
2.2.2 DNA-Sequenzierung
Zur Sequenzierung der DNA wird die Didesoxy-Methode nach Sanger et al.
(1977) angewandt. Das Prinzip dieses Verfahrens beruht auf dem
basenspezifischen Abbruch der DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase.
Neben den gewöhnlich eingesetzten 2’-Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTP)
werden zusätzlich fluoreszenzmarkierte 2’3’-Didesoxynukleotidtriphosphate
(ddNTP) eingesetzt, wobei jedes der vier ddNTPs an einen unterschiedlichen
Farbstoff gekoppelt ist. Diesen ddNTPs fehlt die 3’-OH-Gruppe, so dass die
DNA-Polymerase das nächste Nukleotid nicht mehr ankondensieren kann und
die Synthese beendet. Wird die Reaktion mit einem Gemisch aus dNTP und
markiertem ddNTP durchgeführt, kann statistisch gesehen an jeder
Nukleotidposition ein Kettenabbruch erfolgen, wodurch DNA-Fragmente
unterschiedlicher Länge entstehen, die an ihrem Ende jeweils eine
Fluoreszenzmarkierung tragen.
Die automatische Sequenzierung erfolgt im ABI PRISM 310 Genetic Analyser
durch Auftrennung der DNA-Fragmente mittels Kapillarelektrophorese und
darauf folgender Detektion des Emissionsspektrums der jeweiligen terminalen
floureszenzmarkierten Base.
In Abbildung 2 ist das Chromatogramm des Patienten C6 im Vergleich mit der
Wildtyp-Sequenz dargestellt.
13