Ute Hoffmann, BNI Hamburg - Förderverein der Biologieolympiade

die des IL-35-Plasmids verwendet. Zusätzlich wurde in einem Reaktionsgefäÿ
zur Kontrolle auf Kontaminationen mit Fremd-DNA 1µl H 2 O dem Mastermix
hinzugefügt.
Die PCR wurde in einem Thermocycler durchgeführt. Das Programm begann
mit einer 180 Sekunden dauernden initalen Denaturierung bei 95 °C, um
die zunächst als Doppelstränge vorliegenden Plasmide in ihre Einzelstränge
zu trennen.
Danach folgten Zyklen bestehend aus der Denaturierung bei 95 °C für 30
Sekunden, gefolgt von dem 60 Sekunden dauernden Annealing, bei dem sich
bei einer Temperatur von 55°C die Primer an die Einzelstränge anlagerten.
Ein Zyklus wurde vollendet durch die Elongation, bei der bei 72 °C für 60
Sekunden die Polymerase die dNTPs an die Primer anbaute und somit die
DNA-Stücke duplizierte.
Nach 40 Zyklen folgte ein Zeitraum von 600 Sekunden bei 72 °C, in denen
der DNA-Polymerase Zeit gegeben wurde unvollständige Amplikate zu
vervollständigen. Nach diesem Schritt war die PCR abgeschlossen.
Die Proben wurden daraufhin auf ein Agarosegel aufgetragen.
Restriktionsverdau Für den Restriktionsverdau wurden jeweils 2,5µl Puffer
und 1µg Plasmid vermischt. Pro Restriktionsschnittstelle wurden 1µl des
jeweiligen Restriktionsenzyms zugegeben, dem Leerplasmid dementsprechend
1µl Enzym und dem IL-35-Plasmid jeweils 1µl von zwei Enzymen. Diese Gemische
wurden mit Wasser auf 25µl aufgefüllt.
Der Verdau braucht bei 37°C etwa 10 bis 15 Minuten. Danach wurden die
Proben auf ein Agarosegel aufgetragen.
Agarose-Gelelektrophorese Mittels der Agarose-Gelelektrophorese kann
man DNA-Moleküle anhand ihrer Gröÿe auftrennen, da diese in einem elektrischen
Feld wandern. Bedingt durch die verschiedenen Gröÿen werden die
Moleküle unterschiedlich stark von dem Agarose-Gel aufgehalten, wandern
aus diesem Grund verschieden schnell und werden dadurch aufgetrennt. Um
10