Ute Hoffmann, BNI Hamburg - FÃ¶rderverein der Biologieolympiade

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4.2.3 Western-Blot zur Identizierung von TRAP-H Abb.15: Western Blot mit Proben der nicht induzierten TRAP-H-Bakterien (n.ind.Bakterien), den Lysaten der TRAP-F und TRAP-H-Bakterien (Lysat F, Lysat H), dem Durchlauf bei der Proteinaufreinigung (DL F, DL H), dem jeweils fünften Eluat der Proteinaufreinigungen (E5 F, E5 H) und den aufkonzentrierten Eluaten (TRAP F conc. und TRAP H conc.) Die schwachen Banden bei den Proben von TRAP-F rühren daher, dass der Film beim Entwickeln verrutscht ist. 24
5 Diskussion 5.1 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs 5.1.1 Überprüfung der Plasmide Die Banden auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen der PCR lassen vermuten, dass diese nicht erfolgreich war. Es hätten sowohl für das Leerplasmid als auch für das Plasmid, auf welches zusätzlich das genetische Material für IL-35 eingefügt worden ist, jeweils drei Banden sichtbar sein müssen. Auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen des Restriktionsverdaus sieht man deutlich, dass das IL-35-Plasmid in zwei DNA-Stücke gespaltet worden ist, das Leerplasmid jedoch nicht. Die kleinere, weiter gewanderte und somit leichtere Bande entspricht also der DNA für IL-35, die weniger weit gewanderte Bande und somit schwerere dem Leerplasmid. Damit ist bewiesen, dass sich das Gen für IL-35 tatsächlich noch auf dem Plasmid bendet. 5.1.2 Transfektion Die Negativkontrolle fungiert als Kontrolle um unspezische Bindungen des verwendeten Nachweisantikörpers zu anderen Strukturen der Zellen anzuzeigen. Bei den transzierten Zellen wurden nur geringfügig mehr Fluoreszenz nachgewiesen als bei der Negativkontrolle und somit auch nicht viel mehr Bindungen des Antikörpers gemessen. Das bedeutet dass entweder der Nachweis der Transfektion oder die Transfektion nicht erfolgreich war. Die niedrige Transfektionsrate kann verschiedene Ursachen habe. Es können beispielsweise Fehler bei der Durchführung der Transfektion aufgetreten sein oder das Transfektionsmedium könnte nicht mehr funktioniert haben. Die Zellen können auch aus verschiedenen Gründen nicht ausreichend kompetent gewesen sein für eine Transfektion. 25
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Seite 29: Literatur [1] Löscher, T.; Burchar

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