Ute Hoffmann, BNI Hamburg - Förderverein der Biologieolympiade

Praktikumsbericht
Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut in Hamburg in
der Abteilung für Immunologie
vom 16.8. bis zum 10.9.2010
Ute Homann
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Inhaltsverzeichnis
1 Die Rahmenbedingungen des Praktikums 4
2 Hintergrundwissen 5
2.1 Zu den Themen der Arbeitsgruppe . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2 Zu meinem Projekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3 Materialien und Methoden 9
3.1 Transfektion und Handhabung der CHOs . . . . . . . . . . . . 9
3.1.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.1.2 Überprüfung der Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.1.3 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.2 Proteinherstellung mittels der Bakterien . . . . . . . . . . . . 12
3.2.1 Transformation der Bakterien . . . . . . . . . . . . . . 12
3.2.2 Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.2.3 Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4 Ergebnisse 15
4.1 Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs . . . . . . . . . . . . . 15
4.1.1 Überprüfung der Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.1.2 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4.2 Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien . . . . . . . . . . . 20
4.2.1 Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4.2.2 Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
4.2.3 Western-Blot zur Identizierung von TRAP-H . . . . . 24
5 Diskussion 25
5.1 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs . . . . 25
5.1.1 Überprüfung der Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.1.2 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.2 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien . . 26
2

6 Fazit 28
3

1 Die Rahmenbedingungen des Praktikums
Mein Name ist Ute Homann und ich habe diesen Juni am Gymnasium
Olching, in der Nähe von München, mein Abitur erworben. Ab Oktober 2010
werde ich an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Biologie studieren.
Im Rahmen der 3. Runde des Auswahlwettbewerbs zur Bestimmung des
deutschen Teams für die Internationale Biologieolympiade 2010 wurden auch
dieses Jahr durch den Förderverein der Internationalen Biologieolympiade
e.V. Praktika an verschiedene Teilnehmer des Wettbewerbs vergeben. Aus
diesem Grund bekam ich die Möglichkeit vom 16. August bis zum 10. September
2010 ein vierwöchiges Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut für
Tropenmedizin in Hamburg zu absolvieren. Mein Praktikum fand in der Arbeitsgruppe
von PD Dr. Thomas Jacobs in der Abteilung für Immunologie
statt.
Vor diesem Praktikum konnte ich erst wenige Erfahrungen mit wissenschaftlichem
Arbeiten sammeln. Einige Einblicke in die Arbeit im Labor
erhielt ich allerdings durch mehrmalige Teilnahme an Ferienprojekten von
Mädchen machen Technik, einem Programm zur Förderung von Mädchen
in Wissenschaft und Technik.
Die Arbeitsgruppe von PD Dr. Thomas Jacobs beschäftigt sich mit der
Immunologie der Malaria und als zweiten Forschungsschwerpunkt mit Trypanosoma
cruzi, dem Erreger der südamerikanischen Chagas-Krankheit.
Da ich nur vier Wochen in der Arbeitsgruppe verbrachte und mir zudem
die nötigen Grundlagen fehlten, beschäftigte ich mich während dieser
Zeit damit chinese hamster ovary cells (CHOs) zu transzieren. Weiterhin
stellte ich mit Hilfe von E.coli BL21 pAP lacI ein Oberächenprotein des
Malariaerregers, TRAP, her. Die restliche Zeit schaute ich den verschiedenen
Mitgliedern der Arbeitsgruppe über die Schulter und half zum Teil auch mit,
so dass ich verschiedene, vor allem immunologische, Arbeitstechniken kennen
lernen konnte.
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2 Hintergrundwissen
2.1 Zu den Themen der Arbeitsgruppe
Die Malaria ist in vielen tropischen und subtropischen Gebieten unserer
Erde verbreitet, wobei sie vor allem in den ärmeren Regionen Afrikas ein
groÿes Problem darstellt, da dort keine ausreichende Medikamentenversorgung
und Infektionsprävention möglich ist. Hier sind vor allem Kinder Opfer
der Krankheit. Die Verbreitung der Malaria ist eng an den Lebensraum und
den Lebenszyklus ihres Endwirts, der Anopheles-Mücke, gebunden, was zum
Beispiel bedeutet, dass das Infektionsrisiko in feuchten Gebieten und während
der Regenzeit erhöht ist. Die Erreger der Malaria sind Plasmodien.
Humanpathogen sind Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Plasmodium
ovale, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum. Der Krankheitsverlauf
kann sich bei Infektionen mit verschiedenen Parasiten unterscheiden,
etwa durch die Zeitintervalle zwischen den wiederkehrenden Fieberschüben
oder die Schwere der Krankheit.
Die sexuelle Vermehrung der Plasmodien ndet in der Mücke statt. Bei
einem Stich gelangen sie als Sporozoiten in den menschlichen Blutkreislauf
durch den sie innerhalb kurzer Zeit in die Leber gelangen, in der sie Leberzellen
befallen. In diesen kommt es zur asexuellen Vermehrung, Merogonie
genannt, bei der pro inzierter Leberzelle innerhalb etwa einer Woche bis
zu 30.000 Merozoiten entstehen. Die Leberphase endet mit einer Freisetzung
der Merozoiten ins Blut, wo sie rote Blutzellen befallen. In ihnen vermehren
sie sich weiterhin asexuell. Je nach Plasmodienart werden die neu entstandenen
Merozoiten nach verschiedenen Zeitintervallen freigesetzt. Die für alle
Formen der Malaria in der Regel in Anfällen auftretenden Fieberanfälle sind
mit dieser Erythrozytenruptur assoziiert. Sie werden vermutlich als Reaktion
des Immunsystems auf die Abfallprodukte des Parasitenstowechsels ausgelöst.
Die Parasiten verstowechseln in den Erythrozyten Hämoglobin, aus
welchem das kristalline Malariapigment Hämozoin, welches als eines der Ma-
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lariatoxine gilt, entsteht. Bei der Vermehrung innerhalb der roten Blutzellen
entstehen unter anderem auch zur sexuellen Fortpanzung fähige Plasmodien,
Gametozyten. Durch erneute Mückenstiche können diese weitere Mücken
inzieren, in denen es wieder zur sexuellen Fortpanzung kommt.
Abb.1:
Der Lebenszyklus der Plasmodien
Eine Infektion mit den Parasiten kann in seltenen Fällen, etwa in Endemiegebieten,
durch klinische Immunität ohne Symptome verlaufen, oder
aufbauend auf typischen Symptomen wie Kopf- und Gliederschmerzen mit
Fieber(anfällen) zu Koma und auch zum Tode führen. Schwerere Verlaufsformen
werden dabei vor allem von Plasmodium falciparum ausgelöst.
In der Regel kommt es bei einer Malariainfektion zu einer Vergröÿerung
der Milz, einer so genannten Splenomegalie, da dort die Plasmodien aus dem
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Blut geltert werden und phagozytiert werden. P. falciparum entzieht sich
dem, indem auf der Erythrozytenoberäche durch die Einlagerung von parasitären
Proteinen Vorwölbungen entstehen, mit denen die Erythrozyten an
den Endothelzellen der Blutgefäÿe haften bleiben können. Dies kann zu einer
schlechteren Durchblutung der betreenden Gewebe führen. Zudem kommt
es in dem betroenen Gewebe zu einer stärkeren Entzündungsreaktion, was
etwa bei einer Malariainfektion in der Schwangerschaft fatal sein kann, da es
über eine massive Einwanderung von P. falciparum in die Plazenta zu Frühoder
Fehlgeburten kommen kann.
Durch die häugen Fieberanfälle sind die meisten Inzierten dehydriert.
Das, die verschlechterte Durchblutung und die Zerstörung der inzierten Erythrozyten
führen zu einer verschlechterten Sauerstoversorgung der Gewebe.
Dies wird durch eine verringerte Erythropoese verstärkt, da diese vermutlich
zu Gunsten der Leukopoese während der Krankheit gedrosselt wird. Die verringerte
Sauerstoversorgung führt zu einer verstärkten Ausschüttung von
Milchsäure. Da die Leber ebenfalls durch die anhaltende allgemeine Entzündungsreaktion
in ihrer Funktion beeinträchtigt ist, kommt es in der Regel
so nach kurzer Zeit zu einer Azidose. Der dadurch entstehende metabolische
Stress kann zu weiteren Organschäden führen und spielt unter Umständen
eine Rolle bei der cerebralen Malaria und dem dabei auftretenden Koma.
Die genauen Mechanismen, die hinter den verschiedenen Verlaufsformen
der Malaria stehen, sind noch nicht geklärt. Die verschiedenen Oberächenproteine
der verschiedenen Plasmodien spielen eine wichtige Rolle, da unter
anderem etwa P. falciparum durch verschiedene Oberächenproteine mehr
Erythrozyten inzieren kann als P. vivax und, wie bereits erwähnt, sich die
mit P. falciparum inzierten Erythrozyten über bestimmte parasitäre Ober-
ächenproteine an Endothelzellen anlagern können.
Ein weiterer kritischer Punkt des Krankheitsverlaufs ist das überbordende
Immunsystem. Durch den allgemeinen anhaltenden Entzündungszustand
wird der Körper teilweise mehr geschädigt, als dass die Reaktion bei der
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Bekämpfung der Krankheit helfen würde.
Mit Hilfe der Forschung kann man vielleicht in Zukunft, beispielsweise
durch die genauere Kenntnis der verschieden Oberächenproteine und Infektionswege,
den Beginn der Blutphase verhindern oder im späteren Krankheitsverlauf
das Immunsystem so regulieren, dass es nicht mehr mehr schädigt
als hilft. [1, 2]
2.2 Zu meinem Projekt
Während des Praktikums habe ich mich mit der rekombinanten Expression
verschiedener Proteine in eukaryotischen Zellen (CHOs, chinese hamster
ovary cells) und in Bakterien des Stamms E.coli BL21 pAP lacI beschäftigt.
Die CHOs sollten nach der Transfektion, die mittels durchusszytometrischen
Messungen überprüft wurde, das murine Zytokin IL-35 produzieren.
Dessen Funktion sollte in vitro und in vivo genauer charakterisiert werden.
In den Bakterien wurde P.berghei TRAP (thrombospondin-related adhesive
protein) produziert. Dieses ist ein Oberächenprotein der Sporozoiten,
dass eine wichtige Rolle bei der Infektion der Hepatozyten spielt. Es wurde
auf Grund seiner Gröÿe in zwei getrennten Fragmenten, TRAP-F und
TRAP-H, exprimiert und über die bei der Klonierung angefügten His-Tags
aufgereinigt.
Das aufgereinigte TRAP sollte in immunologischen Tests als Antigen verwendet
werden, um so die humorale Immunantwort von Mäusen nach einer
P.berghei-Infektion zu untersuchen.
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3 Materialien und Methoden
3.1 Transfektion und Handhabung der CHOs
3.1.1 Kultivierung
Bei der Arbeit mit Zellkulturen ist es wichtig Kontaminationen mit Mikroorganismen
zu vermeiden. Deswegen wurde mit sterilen Einmal-Plastikwaren
und zuvor durch Autoklavierung sterilisierten Glaswaren und Lösungen unter
einer Reinluft-Werkbank gearbeitet. Die Zellen wurden in RPMI1640-
Medium kultiviert, welchem 10 % fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-
Glutamin und 50 mg/ml Gentamycin zugesetzt wurden. Die Kultur der Zellen
erfolgte bei 37°C im Brutschrank mit einem CO 2 -Gehalt von 5%. Die
Zellen wurden in 6-Loch-Zellkulturplatten in 5 ml Medium pro Vertiefung
kultiviert. Bei ausreichender Besiedlung des Gefäÿes wurden die Zellen mit
Hilfe von Trypsin-EDTA von der Platte gelöst und neu ausgesät. Im Rahmen
dieses Arbeitsschrittes wurde 500 ml Trypsin-EDTA auf die Zellen gegeben,
etwa 4 Minuten gewartet bis sich diese vom Untergrund gelöst hatten, das
Trypsin-EDTA daraufhin wieder abgenommen und die Zellen verdünnt in
neue Vertiefungen gegeben.
3.1.2 Überprüfung der Plasmide
Polymerase-Kettenreaktion Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion,
kurz PCR, kann man gegebene DNA-Stücke vervielfältigen. Dazu wurde zunächst
ein Mastermix, pro zu vervielfältigender Probe bestehend aus je 2,5µl
Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 2,5µl 10x Taq-Puer, 2,5µl MgCl 2 , 2,5µl
dNTP-Lösung, 0,2µl Taq-DNA-Polymerase und 11,3µl H 2 O, angesetzt. Die
eingesetzte DNA-Polymerase stammte aus Thermophilus aquaticus, welche
durch ihre Hitzestabilität für PCRs geeignet ist.
Es wurden nun zwei Reaktionsgefäÿe mit Mastermix und je einmal 1µl der
Templates angesetzt. Als Templates wurden die Probe des Leerplasmids und
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die des IL-35-Plasmids verwendet. Zusätzlich wurde in einem Reaktionsgefäÿ
zur Kontrolle auf Kontaminationen mit Fremd-DNA 1µl H 2 O dem Mastermix
hinzugefügt.
Die PCR wurde in einem Thermocycler durchgeführt. Das Programm begann
mit einer 180 Sekunden dauernden initalen Denaturierung bei 95 °C, um
die zunächst als Doppelstränge vorliegenden Plasmide in ihre Einzelstränge
zu trennen.
Danach folgten Zyklen bestehend aus der Denaturierung bei 95 °C für 30
Sekunden, gefolgt von dem 60 Sekunden dauernden Annealing, bei dem sich
bei einer Temperatur von 55°C die Primer an die Einzelstränge anlagerten.
Ein Zyklus wurde vollendet durch die Elongation, bei der bei 72 °C für 60
Sekunden die Polymerase die dNTPs an die Primer anbaute und somit die
DNA-Stücke duplizierte.
Nach 40 Zyklen folgte ein Zeitraum von 600 Sekunden bei 72 °C, in denen
der DNA-Polymerase Zeit gegeben wurde unvollständige Amplikate zu
vervollständigen. Nach diesem Schritt war die PCR abgeschlossen.
Die Proben wurden daraufhin auf ein Agarosegel aufgetragen.
Restriktionsverdau Für den Restriktionsverdau wurden jeweils 2,5µl Puffer
und 1µg Plasmid vermischt. Pro Restriktionsschnittstelle wurden 1µl des
jeweiligen Restriktionsenzyms zugegeben, dem Leerplasmid dementsprechend
1µl Enzym und dem IL-35-Plasmid jeweils 1µl von zwei Enzymen. Diese Gemische
wurden mit Wasser auf 25µl aufgefüllt.
Der Verdau braucht bei 37°C etwa 10 bis 15 Minuten. Danach wurden die
Proben auf ein Agarosegel aufgetragen.
Agarose-Gelelektrophorese Mittels der Agarose-Gelelektrophorese kann
man DNA-Moleküle anhand ihrer Gröÿe auftrennen, da diese in einem elektrischen
Feld wandern. Bedingt durch die verschiedenen Gröÿen werden die
Moleküle unterschiedlich stark von dem Agarose-Gel aufgehalten, wandern
aus diesem Grund verschieden schnell und werden dadurch aufgetrennt. Um
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die Gröÿen der verschiedenen DNA-Moleküle nachvollziehen zu können, wurde
der DNA-Marker GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder von Fermentas
verwendet.
Die Gele wurden mit 1% Agarose gegossen. Zudem wurde Ethidiumbromid
in einer Endkonzentration von 0,2 µl/ml zugesetzt. Ethidiumbromid
interkaliert in die DNA-Moleküle und macht sie so in UV-Licht sichtbar.
Als Puer wurde 1x TBE verwendet. Die Elektrophorese wurde bei 80 V
durchgeführt.
3.1.3 Transfektion
Die zu transzierenden Zellen sollten beim Zeitpunkt der Transfektion ungefähr
zu 90 % konuent sein. Zum Transzieren wurde zunächst das alte
Medium abgenommen und durch 4 ml frisches Vollmedium ersetzt. Pro Well
wurden nun 400µl Medium mit 4µg DNA und 4µl TurboFect (Fermentas) für
20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses Gemisch wurde langsam
in das Well getropft.
TurboFect unterstützt die Aufnahme der DNA, indem es mit der DNA
Polymere bildet, die über Endocytose aufgenommen werden und nach dem
Bersten der Endosomen in den Zellkern gelangen können.
Die Transfektion wurde in zwei Wells mit dem Leerplasmid durchgeführt,
in zwei mit dem IL-35 enthaltenden Plasmid und ein Well wurde als Negativkontrolle
nur mit Medium und TurboFect behandelt.
Das Ergebnis der Transfektion wurde nach jeweils 24 und 48 Stunden
mittels Durchusszytometrie überprüft.
Durchusszytometrie Mittels der Durchusszytometrie kann man Zellen
auf verschiedene Eigenschaften hin untersuchen. Dabei werden einzelne Zellen
an einem Laser vorbeigeleitet und durch die Reektion und Streuung des
Lichts auf ihre Eigenschaften geschlossen. Man unterscheidet Forward- und
Sidewards Scatter, entsprechend der Streuung des Lichts nach vorne und der
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zur Seite. Der Forward Scatter gibt Auskunft über die Gröÿe der Zellen, der
Sidewards Scatter über die Granularität.
Man kann neben Forward und Sidewards Scatter auch Fluoreszenzen messen.
Dazu müssen die Zellen uoreszieren oder, etwa über Antikörper, mit
Fluoreszenzfarbstoen verbunden sein. Diese werden durch Laser mit Licht
der entsprechenden Wellenlänge angeregt und die entstehende Lichtemission
über Photodetektoren gemessen. So kann man weitere Aussagen über die
Zellen treen.
Auf dem Leerplasmid wurde humanes IgG codiert, auf dem IL-35 wurde
ein Fusionsmolekül aus IgG und IL-35 codiert. Um die Transfektion nachzuweisen,
wurde mittels eines mit einem Fluoreszenzfarbsto-gekoppelten-
Antikörper humanes IgG und somit die jeweils exprimierten Proteine nachgewiesen.
Da diese im Zellplasma vorliegen, mussten die Zellen erst mit Zellpermeabilisierungsagens
behandelt werden. Vor der durchusszytometrischen
Untersuchung wurden sie anschlieÿend mit den Nachweisantikörpern inkubiert,
mehrmals mit FACS-Puer gewaschen und mit 1% PFA in PBS xiert.
3.2 Proteinherstellung mittels der Bakterien
Die Herstellung des Proteins TRAP mittels E.coli gliederte sich in drei verschiedene
Zwischenschritte. Zu Beginn wurden die Bakterien mit den jeweiligen
Plasmiden transformiert, um danach, zur Proteingewinnung, in gröÿere
Kulturen gegeben zu werden, aus denen dann schlieÿlich über mehrere Schritte
das Protein aufgereinigt werden konnte.
3.2.1 Transformation der Bakterien
Für die Transformation wurden jeweils 3µl Plasmid (pJC45-TRAP-F bzw.
pJC45-TRAP-H) mit jeweils 50µl kompetenten Bakterien des Stammes E.coli
Bl21 pAP lacI in Reaktionsgefäÿen vermengt. Die Reaktionsgefäÿe wurden
nun für 30 min. auf Eis gestellt, um sie danach für 45 sek. bei 42 °C zu
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erhitzen. Danach kamen sie wieder für 2 Minuten auf Eis. Nach diesem Prozedere
wurde jeweils 1 ml warmes LB-Medium zu den Bakterien gegeben und
die Reaktionsgefäÿe für eine Stunde bei 37°C in den Schüttler gegeben. Im
Anschluss daran wurden jeweils 200µl und 800µl der Bakterien auf Agar-
Platten, die mit Kanamycin und Ampicilin versetzt waren, ausplattiert. Auf
diesen wuchsen die Bakterien über 2 Tage bei Raumtemperatur.
3.2.2 Proteingewinnung
Nach drei Tagen wurden in zwei Reagenzgläsern jeweils 5 ml LB-Medium mit
einer Konzentration von 50µl/ml Kanamycin und Ampicilin mit je einem
Klon der TRAP-F und TRAP-H-Bakterien angeimpft und über Nacht bei
37°C und 200 rpm inkubiert.
Sowohl die TRAP-F- als auch die TRAP-H-Übernachtkultur wurden genutzt
um jeweils zweimal 200 ml LB-Medium mit Kanamycin und Ampicilin
anzuimpfen. Die vier Erlenmeyerkolben mit dem LB-Medium wurden bei
37°C und 200 rpm inkubiert, bis die exponentielle Wachstumsphase erreicht
wurde. Die OD bei 600 nm beträgt dann in etwa 0,5.
Nun wurde durch die Zugabe von IPTG (1mM) die Expression der Proteine
induziert. Jeweils eine TRAP-F und eine TRAP-H-Kultur wurden weitere
drei Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert, die verbleibenden zwei Kulturen
wurden über Nacht bei 18°C und ebenfalls 200 rpm inkubiert.
Anschlieÿend wurden die Bakterien mit 4000 rpm bei 4 °C für 30 Minuten
abzentrifugiert und die Pellets bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C
aufbewahrt.
Vor und nach der Induktion der Proteinexpression wurden Aliquots abgenommen
und als Pellets bei -20°C gefroren. Die Menge der in den Aliquots
bendlichen Bakterien wurde über die Messung der OD 600 abgeglichen.
Vor der Proteinaufreinigung wurde eine Testlyse von jeweils 10 ml der Expressionskulturen
durchgeführt um die Löslichkeit der exprimierten Proteine
zu überprüfen. Die Pellets wurden mittels Ultraschall in PBS mit 1% Triton
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X-100 lysiert. Pellet und Überstand wurden getrennt und von ihnen und den
vor und nach der Induktion entnommenen Aliquots wurden Coomassie-Gele
angefertigt.
3.2.3 Proteinaufreinigung
Zur Aufreinigung der His-getaggten Proteine wurde das ProBondTM Nickel-
Chelating Resin von Invitrogen genutzt. Die näheren Informationen zu den
Zusammensetzungen der Puer und der Vorbereitung der Säule mit der Säulenmatrix
sind in der Anleitung des Kits nachlesbar. [1]
Die Aufreinigung wurde unter Hybridbedingungen nach den Angaben des
Herstellers durchgeführt. Um eine bessere Löslichkeit der Proteine zu erreichen,
wurden die Lyse und die Bindung an die Säulen der Bakterien unter
denaturierenden Bedingungen durchgeführt, die Elution jedoch, um die Proteine
zu schonen, unter nativen.
Von den gesammelten 1 ml groÿen Fraktionen des Eluats wurden jeweils
10µl mit 90µl Coomassie-Lösung vermengt. Dieser so genannte Bradford-Test
dient der ungefährem Bestimmung des Proteingehalts.
Die Fraktionen, die Protein enthielten, wurden daraufhin in einem Reaktionsgefäÿ
vereinigt. Nach der Aufreinigung wurde das eluierte Protein in
PBS umgepuert. Dies geschah mit der Hilfe von zwei PD-10-Säulen (GE
Healthcare) nach dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll. Zur Erhöhung
der Proteinkonzentration wurden die Proteineluate in einer Zentrifuge
mit Hilfe von Vivaspin-2-Säulen (sartorius stedim biotech) ultraltriert. Die
erreichte Konzentration wurde über die Messung der OD bei 280 nm mittels
des NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Scientic) gemessen.
Die Reinheit der Proteine wurde im Anschluss daran mit SDS-Polyacrylamid-
Gelektrophorese und Silberfärbung überprüft.
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4 Ergebnisse
4.1 Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs
4.1.1 Überprüfung der Plasmide
Abb.2: Agarose-Gel mit dem Ergebnis der PCR, ganz links auf dem Gel
der Marker, in der nächsten Spalte die Probe vom Leerplasmid und ganz
rechts die des Plasmids mit IL-35
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Abb.3: Agarose-Gel mit dem Ergebnis des Restriktionsverdaus, ganz links
der Marker, in der mittleren Spalte die Probe des Plasmids mit IL-35 nach
dem Verdau und ganz rechts die Probe des Leerplasmids
4.1.2 Transfektion
Bei den Ergebnissen der durchusszytometrischen Untersuchung ist der Sidewards
Scatter (SSC-A) jeweils auf der y-Achse aufgetragen. In Abbildung
4 ist auf der x-Achse der Forward Scatter angetragen (FSC-A), bei den darauf
folgenden Abbildungen der FL2-Kanal (in der Abbildung: FL2-A, weist
Licht mit Wellenlängen zwischen 546 und 602 nm nach). In Abbildung 4
wird mit P1 auf Zellen gegated. P2 markiert die Zellen, die im Kanal FL2 soviel
Fluoreszenz zeigen, dass Bindungen durch den verwendeten Fluoreszenzgekoppelte
Antikörper an den Zellen als nachgewiesen gelten können.
16

Abb.4: Negativkontrolle nach 24 h
Abb.5: Negativkontrolle nach 24 h
17

Abb.6: Mit dem Leerplasmid transzierten Zellen nach 24 h
Abb.7: Mit IL-35-Plasmid transzierte Zellen nach 24 h
18

Abb.8: Mit dem Leerplasmid transzierten Zellen nach 48 h
Abb.9: Mit IL-35-Plasmid transzierten Zellen nach 48 h
19

4.2 Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien
4.2.1 Proteingewinnung
Auf den Gelen ist jeweils ganz links der Marker aufgetragen. ZP 1 steht
für das entnommene Aliquot zum Zeitpunkt 1, also vor der Induktion der
Proteinproduktion, ZP 2 für das Aliquot nach der Proteinproduktion. Die
Abkürzung T steht für Tagkultur, aus ihr wurden auch Pellet und Überstand
1 (P1, ÜS 1) entnommen. N steht für Nachtkultur, dazu gehören Pellet und
Überstand 2 (P2, ÜS 2).
Abb.10:
SDS-PAGE-Gel der TRAP-F-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt
20

Abb.11:
SDS-PAGE-Gel der TRAP-H-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt
Abb.12:
SDS-PAGE-Gel der TRAP-H-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt
21

4.2.2 Proteinaufreinigung
Abb.13: SDS-PAGE-Gel mit Silberfärbung von der TRAP-F-Aufreinigung,
aufgetragen sind das Lysat der Bakterien, der Durchlauf (DL), drei Waschschritte
(W1, W2, W3), verschiedene Fraktionen des Eluats (E3, E5, E7,
E10, E13), das Eluat (E-P), das aufkonzentrierte Eluat (E-conc.) und der
Durchlauf der Vivaspin-Säule (DL-V.)
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Abb.14: SDS-PAGE-Gel mit Silberfärbung von TRAP-H-Aufreinigung, aufgetragen
sind das Lysat der Bakterien, der Durchlauf (DL), drei Waschschritte
(W1, W2, W3), verschiedene Fraktionen des Eluats (E3, E5, E7, E10, E13),
das Eluat (E-P) und das aufkonzentrierte Eluat (E-conc.)
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4.2.3 Western-Blot zur Identizierung von TRAP-H
Abb.15: Western Blot mit Proben der nicht induzierten TRAP-H-Bakterien
(n.ind.Bakterien), den Lysaten der TRAP-F und TRAP-H-Bakterien (Lysat
F, Lysat H), dem Durchlauf bei der Proteinaufreinigung (DL F, DL H), dem
jeweils fünften Eluat der Proteinaufreinigungen (E5 F, E5 H) und den aufkonzentrierten
Eluaten (TRAP F conc. und TRAP H conc.)
Die schwachen Banden bei den Proben von TRAP-F rühren daher, dass
der Film beim Entwickeln verrutscht ist.
24

5 Diskussion
5.1 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs
5.1.1 Überprüfung der Plasmide
Die Banden auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen der PCR lassen vermuten,
dass diese nicht erfolgreich war. Es hätten sowohl für das Leerplasmid
als auch für das Plasmid, auf welches zusätzlich das genetische Material für
IL-35 eingefügt worden ist, jeweils drei Banden sichtbar sein müssen.
Auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen des Restriktionsverdaus sieht
man deutlich, dass das IL-35-Plasmid in zwei DNA-Stücke gespaltet worden
ist, das Leerplasmid jedoch nicht. Die kleinere, weiter gewanderte und somit
leichtere Bande entspricht also der DNA für IL-35, die weniger weit gewanderte
Bande und somit schwerere dem Leerplasmid. Damit ist bewiesen, dass
sich das Gen für IL-35 tatsächlich noch auf dem Plasmid bendet.
5.1.2 Transfektion
Die Negativkontrolle fungiert als Kontrolle um unspezische Bindungen des
verwendeten Nachweisantikörpers zu anderen Strukturen der Zellen anzuzeigen.
Bei den transzierten Zellen wurden nur geringfügig mehr Fluoreszenz
nachgewiesen als bei der Negativkontrolle und somit auch nicht viel mehr
Bindungen des Antikörpers gemessen. Das bedeutet dass entweder der Nachweis
der Transfektion oder die Transfektion nicht erfolgreich war.
Die niedrige Transfektionsrate kann verschiedene Ursachen habe. Es können
beispielsweise Fehler bei der Durchführung der Transfektion aufgetreten
sein oder das Transfektionsmedium könnte nicht mehr funktioniert haben.
Die Zellen können auch aus verschiedenen Gründen nicht ausreichend kompetent
gewesen sein für eine Transfektion.
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5.2 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien
Auf dem mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE-Gel, auf welches die Aliquots,
die vor und nach der Induzierung der Proteinproduktion in den TRAP-F-
Bakterien genommen worden sind, und die Proben des Probelysats aufgetragen
worden sind, ist deutlich die Produktion von TRAP-F nachvollziehbar,
da auf Höhe von 25 kDa sowohl in den Aliquots der Tag- und der Nachtkultur
und der Probe des Pellets des Probelysats eine deutliche Zunahme der
Bande sichtbar ist.
Während der Aufreinigung scheint TRAP-F jedoch verloren gegangen zu
sein, da auf dem nach der Aufreinigung hergestellten SDS-PAGE-Gel keine
Banden auf 25 kDa-Höhe zu entdecken sind. Der Verlust kann mit der schweren
Löslichkeit des Proteins zusammenhängen, so dass es bei der Lyse der
Bakterien nicht freigesetzt worden ist. Es wäre interessant zu wissen, welches
Protein stattdessen aufgereinigt worden ist, da im konzentrierten Eluat auf
Höhe von 70 kDa eine deutliche Bande sichtbar ist.
Auf dem SDS-PAGE-Gel mit den Aliquots, die vor und nach der Induzierung
der Proteinproduktion in den TRAP-H-Bakterien genommen wurden,
ist nur auf dem zweiten angefertigten Gel im Pellet der Übernachtkultur die
70 kDa schwere Bande, im Verhältnis zu den anderen Banden, dicker geworden.
Dies lässt darauf schlieÿen, dass entweder kein TRAP-H hergestellt
wurde oder dieses im Verhältnis zu dem ansonsten in den Bakterienzellen
vorhandenen Protein nicht viel ausmacht.
Da auf dem nach der Proteinaufreinigung hergestellten SDS-PAGE-Gel
in der Probe des konzentrierten Eluats eine deutliche Bande in Höhe von 70
kDa sichtbar ist, könnte man davon ausgehen, dass es sich dabei um TRAP-H
handelt. Da sich allerdings auch auf dem nach der Aufreinigung von TRAP-F
hergestellten SDS-PAGE-Gel eine Bande in Höhe von 70 kDa bendet und
diese mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht von TRAP-H stammt, wäre auch
an der Identität des aufgereinigten TRAP-H zu zweifeln.
26

Gewissheit darüber konnte ein nach meiner Abreise angefertigter Western
Blot geben. Es wurde TRAP-spezisches Mausserum eingesetzt, welches nur
TRAP-H nachweist. Man sieht, dass TRAP-H bereits vor der Induzierung
der Proteingewinnung in den Bakterien zu nden ist und dass das aufkonzentrierte
Protein TRAP-H ist. Es bleibt unklar welches Protein an Stelle
von TRAP-F aufgereinigt wurde.
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6 Fazit
Durch mein Praktikum habe ich weitere Einblicke in die Arbeit im Labor
und an einem Institut erhalten. Mein Bild eines durchaus interessanten und
abwechslungsreichen Berufs hat sich dadurch bestätigt. Besonders gefällt mir
an der Arbeit, dass es sich nicht um einen reinen Schreibtischjob handelt
und man vielfältige Tätigkeiten auszuführen hat, wie etwa Recherche zum
jeweiligen Thema, die Arbeit im Labor und die Verarbeitung der Ergebnisse.
Zudem wurde mir die Problematik der Verwendung von Mäusen und anderen
Tieren als Modellorganismen bewusster, da sie zwar für viele Experimente
unverzichtbar sind, aber man dennoch nicht vergessen darf dass es sich um
zu respektierende Lebewesen handelt.
In der Arbeitsgruppe wurde ich sehr freundlich aufgenommen und habe
am Anfang vor allem den Anderen über die Schulter geschaut, nach kurzer
Zeit habe ich aber unter der Betreuung von Dr. Susanne Tartz und Marthe
Janÿen mit den oben näher beschriebenen Arbeiten mit den CHOs und den
Bakterien begonnen. Während ich mit den CHOs und den Bakterien gearbeitet
habe, wurden mir auch weiterhin allgemeine Arbeitstechniken vorgestellt,
die sonst noch in der Gruppe verwendet werden, wie etwa die Herstellung von
Gewebsschnitten mit dem Kryostat und ich konnte jederzeit überall Fragen
stellen, die mir immer mit sehr viel Mühe und Geduld erklärt wurden.
Mein Dank geht an PD Dr. Thomas Jacobs für die Organisation des
Praktikums und die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, sowie an die gesamte
Arbeitsgruppe, speziell Dr. Susanne Tartz und Marthe Janÿen, die sich die
meiste Zeit um mich gekümmert haben. Weiterhin geht mein Dank an den
Förderverein der Bioolympiade e.V. für die Finanzierung und Organisation
des Praktikums und speziell an Dennis Kappei, der von Seiten des Vereins
mein Praktikum und mich betreut hat.
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Literatur
[1] Löscher, T.; Burchard, G.-D. (Hrsg.), Tropenmedizin in Klinik und Praxis,
Stuttgart, New York: Georg Thieme Verlag 2010 4 .
[2] Wenk, P.; Renz, A., Parasitologie. Biologie der Humanparasiten, Stuttgart,
New York: Georg Thieme Verlag 2003 6 .
[3] Anleitung zur verwendeten Proteinaufreingungssäule:
tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/xprpur_man.pdf, letzter
Zugri am 9.9.2010
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