Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Einleitung
eine übernormale Aktivierung des Pi3-K-Signalweges detektiert werden. Außerdem zeigten
diese Zellen eine stark gesteigerte Invasivität (Gambaletta et al., 2000).
Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen scheinen Patienten mit Mammakarzinomen, bei
denen eine Überexpression nachgewiesen wurde, eine wesentlich schlechtere Prognose
zu haben. Bei diesen Patienten zeigten die Karzinome eine wesentlich höhere
Metastasierungsneigung als die Kontrollgruppe (Shaw et al., 1997).
Die molekularen Interaktionsmechanismen, mit denen Pi3-K aktiviert, sind bisher nicht
bekannt.
1.3 Zielsetzung
Die Funktion des Integrins beschränkt sich nicht nur auf seine Adhäsionsfunktion,
sondern das Integrin kann über Signaltransduktion die Genexpression, proliferative
Aktivität und Differenzierung beeinflussen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher,
Interaktionsproteine zu identifizieren, die für Aktivierung oder Regulation der
Signalübertragungen oder der Adhäsionsfunktion via der zytoplasmatischen Domäne der
Untereinheit verantwortlich sein können. Hierzu sollte das Yeast-Two-Hybrid System
verwendet werden, welches ein weitverbreitetes System zur Detektion interagierender
Proteine darstellt. Der erste Teilaspekt dieses Vorgehens ist die Konstruktion sogenannter
Fusionsproteine, die eine Fusion eines Teils der zytoplasmatischen Domäne der
Untereinheit und eines Yeast-Two-Hybrid-Vektors darstellen. Als nächster Schritt folgte die
Etablierung des Yeast-Two-Hybrid-Systems und die simultane Transformation der
Fusionsproteine mit einer cDNA-Bibliothek in Hefezellen, mithilfe dessen interagierende
Proteine identifiziert werden sollen. Da dieser Schritt häufig mit falsch positiven Ergebnissen
einhergeht, mußte die Verifizierung der positiven beziehungsweise der Ausschluß der falsch
positiven Proteine erfolgen.
Um eine genauere Aussage über die Wahrscheinlichkeit einer in vivo Interaktion treffen zu
können sollen die Ergebnisse des Yeast-Two-Hybrid-Systems anschließend
proteinbiochemisch überprüft werden. Dazu sollen eventuell positive Proteine mit den
Fragmenten der zytoplasmatischen Domäne der Untereinheit coimmunopräzipitiert
werden.
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