Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Material und Methoden
1 mM ZnCl 2
10 mM Spermidin
Bei der Dephosphorylierung von 5´-überhängenden Termini wird insgesamt 60 Min. bei 37°C
inkubiert, wobei nach den ersten 30 Min. erneut Phosphatase zugegeben wird. Für die
Dephosphorylierung von glatten oder 5´-rezessiven (3´-überhängenden) Enden wird 15 Min.
bei 37°C, dann 15 Min. bei 56°C, inkubiert, erneut Phosphatase zugegeben und weitere 15
Min. bei 37°C inkubiert. In der Regel wurde die Vektor-DNA des Dephosphorylierungsansatzes
aus einem Agarose-Gel eluiert (siehe 2.2.3.4), um insbesondere bei kombinierten
Restriktionsspaltungen den geschnittenen Vektor von herausgespaltenen DNA-Fragmenten zu
trennen.
2.2.3.6.4 DNA-Ligation
Die Ligation dient der Verknüpfung linearisierter Vektor-DNA mit der zu klonierenden
Fremd-DNA (Insert). Bedingung hierfür ist die Existenz von komplementären oder glatten
Enden an den zu verbindenden Doppelsträngen. Zur Ligation wird die ursprünglich aus
E. coli-Phagen T4 gewonnene und jetzt klonierte T4 DNA-Ligase verwendet (Weiss et al.,
1968), die in Gegenwart von ATP neue Phosphodiesterbindungen zwischen den
benachbarten, freien 3´-Hydroxyl- und 5´-Phosphatgruppen knüpft. Die Effizienz der Ligation
hängt stark vom Verhältnis der eingesetzten DNA-Fragmente ab. Deshalb wird die Menge an
Insert-DNA bei konstanter Menge Vektor-DNA in 3 Schritten um den Faktor 5-15 variiert,
um so das optimale Verhältnis Vektor zu Insert-DNA abzudecken. Die Fremd-DNA sollte
hierbei im Überschuß, im Unterschuß und im gleichen molaren Verhältnis zur Vektor-DNA
vorliegen. Die Qualität des Vektors wird durch zwei Ligationskontrollen analysiert. Eine
Reaktion wird ohne Fremd-DNA und Ligase (Kontrolle des Anteils von ungeschnittenen
Vektor) und eine Reaktion ohne Fremd-DNA (Kontrolle für eine kombinierte Spaltung oder
der Dephosphorylierungseffizienz) durchgeführt. Die Inkubation des Ligationsansatzes erfolgt
bei einer Temperatur von 14°C für mindestens 5 Std. oder über Nacht. Für die nachfolgende
Transformation (siehe 2.2.2.1.2) von Bakterienzellen mit rekombinanter DNA wird die Hälfte
(7,5 des Ligationsansatzes eingesetzt. Der restliche Teil wird bei –20°C gelagert.
Ein exemplarischer Reaktionsansatz:
1-10 Vektor-DNA
1-10 Fremd-DNA (Insert)
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