Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Ergebnisse
100 µl 50 µl
Kolonieanzahl 752 670 152 333
Kolonieformende Einheiten/ml 7,11 x 10 9 cfu/ml 4,85 x 10 9 cfu/ml
Mittelwert
5,98 x 10 9 cfu/ml
Tabelle 7: Bestimmung der kolonieformenden Einheiten (cfu) pro ml der cDNA-Bibliothek nach
Plattierungsvolumen.
Die Amplifikation auf LB-Agarplatten wurde gewählt, da bei Aufzucht in Flüssigmedium ein
Selektionsnachteil für einige Klone nicht ausgeschlossen werden konnte. Um die maximale
Kolonienzahl pro LB-Agarplatte nicht zu überschreiten (laut Herstellerangaben 20000-40000
cfu), wurde in der vorliegenden Arbeit eine Kolonienzahl pro Platte von 31250 cfu gewählt.
Insgesamt wurden in vier Schritten jeweils 100 LB-Platten mit 100 µg/µl Ampicillin mit je
31250 cfu beimpft und 18 Std. bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die gewachsenen
Kolonien vollständig mit einem Digalski-Spatel von den Platten entfernt und in je 4,5 ml LB-
Flüssigmedium überführt. Die auf diese Weise von je 50 Platten gewonnene Zellsuspension
wurde in insgesamt 225 ml LB-Medium vereint. Diese Zellsuspension wurde 20 Min. bei
5000 Upm. und 4°C zentrifugiert, das erhaltene Pellet zunächst in Stickstoff eingefroren und
anschließend bei –80°C gelagert. Für die präparative Plasmidisolierung (siehe 2.2.3.2.2)
wurden die Pellets aufgetaut und jeweils eines auf vier Anionenaustauschersäulen (TIP500
der Firma Qiagen) aufgeteilt (siehe Abb. 12). Anschließend wurden die Nukleinsäuren in H 2 O
gelöst und alle Plasmidpräparationen vereint.
Tabelle 8 erfaßt die durch die Amplifikation gewonnenen Mengen an DNA.
Insgesamt konnten ~12,5 x 10 6 Klone amplifiziert werden.
400 x 31250 cfu = 12.500.000 cfu.
Die Anzahl der unabhängigen Klone wurde durch die Amplifikation ~3,9 mal vervielfältigt.
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