Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Ergebnisse
Die Molekulargewichte der sequenzierten Proteinsegmente wurden mit Hilfe des
Computerprogramms DNA-Strider 1.1 sowie des durch die Internetseite
http://www.ultranet.com (Gill und Hippel, 1989) zur Verfügung gestellten Programms
theoretisch kalkuliert und mit den durch die elektrophoretische Auftrennung ermittelten
Molekulargewichten verglichen. Tabelle 11 gibt Aufschluß über die Produkte der in vitro
Translation.
Klon
Anzahl der
theoret. Molekulargewicht
apparentes Molekulargewicht
Aminosäuren (n)
(kDa)
(kDa)
pAS EcoRV/BamHI 185 20,1 20
pAS PvuII/CT 131 13,8 14
442/9 201 21,1 21
445/1 178 18,7 19
450/7 66 9,9 10
455/3 115 12,1 12
457/1 233 24,5 24
501/1 202 21,2 21
512/3 135 14,2 14
517/2 128 13,4 13
Tabelle 10: IVT-Produkte
Anzahl der Aminosäuren ermittelt von ATG Start-Codon bis zu Stopp-Codon.
Durch die Verwendung von 35 S-Methionin in der in vitro Translation wurden die Proteine
radioaktiv markiert.
Nach der in vitro Transkription wurden Bait- und Libraryprotein für 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Anschließend erfolgte die spezifische Präzipitation der in vitro translatierten
Proteine über das Myc- bzw. HA-Epitop mit den entsprechenden an die Dynabeads ®
gekoppelten Antikörper. Durch mehrere Waschschritte wurde ungebundenes Protein entfernt.
Die Proteine wurden anschließend in einer Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und
auf einem X-OMAT-Film (Kodak) visualisiert. Hatte eine Interaktion zwischen Bait- und
Libraryprotein stattgefunden, waren zwei Proteinbanden sichtbar.
Als Positivkontrollen wurden wiederum p53 und T-Antigen verwendet (siehe 3.4), wie in
Abbildung 21 exemplarisch dargestellt.
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