Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Material und Methoden
Verfahren: Da dem molaren Extinktionskoeffizienten und d der Küvettendicke entprechen,
konnte mit Hilfe der Extinktion (E) die Konzentration (c) der Nukleinsäuren berechnet
werden. Dazu wurde die Absorption einer geeigneten Verdünnung der Nukleinsäure in 1x TE-
Puffer bei einer Wellenlänge von 260 nm gegenüber 1x TE-Puffer gemessen. Eine
Absorbtionseinheit (1 OD) entspricht bei doppelsträngiger DNA etwa 50
2.2.3.6 Enzymkatalysierte Reaktionen an DNA
2.2.3.6.1 Restriktionsspaltung von DNA
Restriktionsendonukleasen spalten sequenzspezifisch DNA. Nach dem Schneiden ihrer
Erkennungssequenzen hinterlassen sie je nach verwendetem Enzym sogenannte stumpfe
(„blunt“) oder 3´- bzw. 5´- überhängende („sticky“) Enden.
Verfahren: Für die Spaltung doppelsträngiger DNA wurden Restriktionsendonukleasen des
Typs II benutzt, die spezifisch 4-8 Nukleotide lange palindromische Sequenzabschnitte
erkennen und an definierbaren Stellen schneiden. Bei dem Reaktionsansatz wurden die
Pufferbedingungen dem Restriktionsenzym entsprechend gewählt. Das Volumen des
eingesetzten Enzyms, welches in Glycerin gelöst ist (50 % (v/v)) betrug nicht mehr als 10 %
des Volumens des Gesamtreaktionsansatzes, da eine erhöhte Glycerinkonzentration die
Ursache vermehrter Fehlspaltungen sein kann.
Ein exemplarischer Reaktionsansatz:
0,5 g/l DNA
1 / 10 Volumen 10x Puffer
1 / 10 Volumen Restriktionsenzym (1 Unit pro DNA)
Zunächst wurden die Reagenzien in eine entsprechende Menge H 2 O pipettiert, um ein
geeignetes Volumen (10-20 zu erhalten. Anschließend erfolgte eine 2-stündige Inkubation
bei enzymspezifischer Temperatur.
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