Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Material und Methoden
Verfahren: Die Herstellung des Gels erfolgte in zwei Schritten. Zuerst wurde das Trenngel
gegossen und sofort mit n-Butanol überschichtet. Dabei diente APS als Radikalstarter und
TEMED als Katalysator und Stabilisator intermediär auftretender Radikale. Nach
Polymerisation des Trenngels wurde das n-Butanol abgegossen und das Sammelgel eingefüllt.
In das noch flüssige Sammelgel wurde ein Kamm eingesetzt, um Taschen für die
Proteinproben zu formen. Nach Polymerisation wurde das Gel in eine Elektrophoresekammer
gespannt und diese mit Elektrophoresepuffer (siehe Tab. 5) gefüllt. Nach Pipettieren der
zuvor denaturierten Proben in die vorgeformten Taschen liefen diese bei einer Spannung von
100 V durch das Sammelgel. Erreichten die Proben das Trenngel wurde die Spannung auf
160-180 V erhöht. Das Proteingel wurde nach Abschluß der Elektrophorese entweder
weiterverarbeitet (Western-Blot) oder photographiert und getrocknet.
Trenngel Sammelgel Elektrophoresepuffer
3,75 ml Trenngelpuffer
5,0 ml Acrylamid(30%)
6,0 ml H 2 0
0,25 ml 4% APS
7,0 l TEMED
1,25 ml Sammelgelpuffer
0,75 ml Acrylamid(30%)
2,9 ml H 2 0
0,1 ml 4% APS
7,0 l TEMED
25 mM Tris
150 mM Glycin
0,1 % SDS
Tabelle 5: Zusammensetzung der Polyacrylamidgele
2.2.4.2 Transfer elektrophoretisch aufgetrennter Proteine auf Membranen
Durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennte Proteine (siehe 2.2.4.1) können elektrophoretisch
mit Hilfe einer sogenannten semi-dry Blotapparatur auf eine PVDF-Membran übertragen
werden.
Verfahren: Hierzu wurde die Membran auf ein geringfügig größeres Maß als das des zu
blottenden Gels zurechtgeschnitten, mit Methanol benetzt und für 2 Min. in Blotpuffer
äquilibriert.
Zwei Filterpapiere wurden ebenfalls für 5 Min. im gleichen Puffer inkubiert.
Die Komponenten wurden hiernach in der Blotkammer luftblasenfrei nach folgendem Schema
zusammengesetzt:
Kathode
Blotpuffer-getränkte Filterpapiere
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