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Ergebnisse Bp 2000 1500 1100 800 600 400 300 200 100 100 bp Leiter 1 2 3 1 2 3 1 2 3 100 bp 1 2 3 1 2 3 Leiter 477 479 480 483 485 100 bp Leiter Abbildung 17: Restriktionsanalyse aus HB101 Dargestellt ist eine elektrophoretische Auftrennung einer Restriktionsspaltung mit AluI der PCR-Amplifikate 477, 479, 480, 483 und 485. Zusätzlich wurde 100 bp Größenstandard aufgetragen. Einige Library-Proteine sind in der Lage, die Transkription der Reportergene direkt, d. h. ohne eine Interaktion mit dem Fusionsprotein, zu aktivieren. Um diese falsch positiven Klone zu eliminieren, wurden alle bisher positiven Screenklone in verschiedenen Kontrollkombinationen in Hefe retransformiert (siehe Tab. 8). Weiterhin wurde in den Retransformationen das Bait pAS PvuII/CT eingesetzt, um eine genauere Aussage über die an der Interaktion beteiligten Regionen der Untereinheit treffen zu können. Als Positivkontrollen wurden die Plasmide pCL, pVA3-1 und pTD1-1 verwendet (siehe 3.3). Insgesamt waren 28 der 62 überprüften Screenklone in der Retransformation negativ, 23 zeigten eine autonome Transaktivierung der Reportergene. Nur Klone, welche in den korrekten Kombinationen positiv oder negativ waren (siehe Tab. 8), wurden als endgültig positiv bestätigt. Insgesamt traf dies auf 11 Klone zu, wie die Abbildungen 18 und 19 verdeutlichen. Positiv- und Negativkontrollen, die bei allen Retransformationen durchgeführt wurden, sind in Abbildung 18 exemplarisch dargestellt. 63
Ergebnisse Plasmid 1 Plasmid 2 Wachstum (+/-) lacZ-Färbung (+/-) Abbildung pAS2-1 pACT2 - - 17 pAS EcoRV/BamHI pACT2 - - 17 pAS2-1 Libraryplasmid - - 18 pAS EcoRV/BamHI Libraryplasmid + + 18 pAS PvuII/CT Libraryplasmid +/- +/- 18 pLAM5´-1 Libraryplasmid - - 18 Tabelle 8: Retransformationen Positivkontrollen pCL1 pVA3-1 + pTD1-1 Negativkontrollen pAS2-1 + pACT2 pAS -EcoRV/BamHI + pACT2 pAS-PvuII/CT + pACT2 Abbildung 18: Positiv- und Negativkontrollen der Retransformation. 64
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