Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Material und Methoden
dieser Übernachtkultur inokuliert und bei 30°C und 220-250 Upm. inkubiert bis zu einer OD
von 0,6-0,9 (Dauer ca. 4-8 Std.).
Anschließend wurde die Zellsuspension 5 Min. bei 4000 x g und Raumtemperatur
zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 100 ml YPD-Medium resuspendiert und die OD bestimmt.
Um den Zielwert der OD von 0,12-0,16 zu erreichen, wurde ein Teil dieser Zellsuspension
mit einer entsprechenden Menge YPD-Medium versetzt, bis wiederum 100 ml Zellsuspension
zur Verfügung standen. Nachfolgend wurden die 100 ml Zellsuspension bei 30°C und
220-250 Upm. in einem Warmluftschüttler bis zu einer OD 600 von 0,5 (~4 h) inkubiert.
Anschließend wurden diese 100 ml auf zwei 50 ml Falconröhrchen aufgeteilt und 5 Min. bei
4000 x g und 4°C zentrifugiert. Die weitere Verarbeitung erfolgte unter ständiger Eislagerung
der Röhrchen. Nach der Zentrifugation wurden die Pellets mit je 5 ml eisgekühltem PBS
resuspendiert, zusammengeführt und mit PBS auf 50 ml aufgefüllt. Hiernach erfolgte ein
weiterer Zentrifugationsschritt unter oben beschriebenen Bedingungen. Der Überstand wurde
dekantiert und das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das gefrorene Pellet wurde
in ein mit Stickstoff vorgekühltes Teflongefäß überführt und dann in einem
Mikrodismembrator (Fa. B.Braun) dismembriert. Diese Probe wurde in 675 „Gritz-Puffer“
resuspendiert und nachfolgend für 5-10 Min. denaturiert. Nun wurde die Probe 5 Min. bei
15000 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt.
Dieser Überstand enthielt die zu extrahierenden Proteine, konnte aliquotiert und bei –80°C
gelagert werden.
Bei Bedarf konnte die Probe gelelektrophoretisch aufgetrennt und beispielsweise einer
Western-Blot-Analyse unterzogen werden.
2.2.4.5 In vitro Translation
In dieser Arbeit wurde das In vitro Translation-Kit TNT-Master-Mix verwendet und nach
vorgegebenen Protokoll vorgegangen.
Für die Transkription ist eine einzel- oder doppelsträngige Matrize nötig, die von der RNA-
Polymerase des Phagen T7 in mRNA umgeschrieben werden kann. Diese RNA-Polymerase
benötigt einen doppelsträngigen Promotorbereich (siehe Abb.5), der entweder bereits bei
Plasmiden vorhanden ist oder mittels PCR angefügt werden muß.
5´-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3´
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