Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Material und Methoden
gebundenes Protein und freie Antikörper zu entfernen. Anschließend wurde der Ansatz mit
15 SDS-Loading-Puffer versetzt und für 3 Min. auf 90°C erhitzt. Dadurch wurde das
gebundene Protein von den Antikörpern gelöst. Nachfolgend wurden die Proteine mittels
einer SDS-Gelelektrophorese (siehe 2.2.4.1) ihrer Größe nach aufgetrennt.
Ein exemplarischer Reaktionsansatz:
10 IVT-Produkt
10 Dynabeads ® (Dynal)
Die Coimmunopräzipitation dient dem Nachweis einer Interaktion zweier Proteine.
Verfahren: Zwei Proteine (gewonnen durch eine IVT (siehe 2.2.4.5)) wurden mittels einer
einstündigen Inkubation bei 30°C zur Interaktion angeregt. Anschließend wurden die Proben
wie bei einer Immunopräzipitation behandelt (siehe oben). Die Proteine wurden dann in einer
SDS-Gelelektrophorese (siehe 2.2.4.1) voneinander getrennt und durch die radioaktive
Markierung auf einem X-OMAT-Film visualisiert. Waren zwei statt einer Proteinbande zu
erkennen, hatte eine Interaktion stattgefunden.
Ein exemplarischer Reaktionsansatz:
10 IVT-Produkt1
10 IVT-Produkt2
10 l Dynabeads ®
2.2.5 Colony-Lift Filter Assay
Diese Methode ermöglicht, die Messung der Aktivität von Galaktosidase.
Verfahren: Pro Platte wurde je ein Filterpapier mit 2,5 ml Z-Puffer/X-gal-Lösung befeuchtet.
Anschließend wurde ein unbehandeltes Filterpapier auf die Oberfläche einer mit Kolonien
bewachsenen Platte gedrückt, um so die Zellen am Filterpapier zu fixieren. Filterpapier und
Petrischale wurden markiert, um die Orientierung des Filterpapiers auch später noch
nachvollziehen zu können. Danach wurde das Filterpapier mit einer Pinzette abgenommen
und für 10-15 Sek. in flüssigen Stickstoff gehalten. Das gefrorene Filterpapier wurde danach
bei Raumtemperatur aufgetaut, luftblasenfrei auf das mit Lösung durchtränkte Filterpapier
aufgebracht und bei 30°C bis zur Blaufärbung der Kolonien inkubiert. Die Blaufärbung
signalisierte die Expression der Galaktosidase.
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