Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Ergebnisse
bp
600
500
400
300
100 bp-
Leiter
FNIII-1 FNIII-2
CS
FNIII-3 FNIII-4
CT
100 bp-
Leiter
1 706
FN III FN III FN III FN III
1725
319 bp 346 bp
436 bp
CS
CT
367 bp
337 bp
292 bp
Abbildung 11: Spezifische Amplifikation von DNA-Fragmenten mit cDNA-Bibliothek
Die oben dargestellte PCR zeigt die einzelnen PCR-Amplifikate, aus der unteren graphischen Darstellung ist der
Bezug der einzelnen Amplifikate zur cDNA zu entnehmen.
Die cDNA-Bibliothek mußte amplifiziert werden, um genügend Plasmid-DNA für den Screen
zu gewinnen. Die Bewahrung der Vollständigkeit der cDNA-Bibliothek nach Amplifikation
und Plasmidisolierung machte es notwendig die Anzahl der unabhängigen Klone, die im Falle
der Prostata-cDNA-Bibliothek 3,2x 10 6 betrug, 2-3x zu vervielfältigen.
Um jedem Bakterienklon die Möglichkeit auf Wachstum zu geben, wurde zunächst eine
Titerbestimmung der E. coli BNN132-Zellen, in welche die cDNA-Bibliothek transformiert
worden war, durchgeführt. Dazu wurde eine 1:10 6 Verdünnung der entsprechenden Bakterien
hergestellt. Jeweils 50 µl und 100 µl wurden auf je 2 LB-Platten mit 100 µg/µl Ampicillin
ausgestrichen. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurde die Anzahl der gewachsenen
Kolonien bestimmt, dadurch konnten die kolonieformenden Einheiten pro ml (cfu/ml)
errechnet werden (siehe Tab. 7).
Die Berechnung der kolonieformenden Einheiten pro ml erfolgte nach folgender Formel:
Kolonienzahl x Verdünnung (10 6 )
Plattierungsvolumen
55