Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern des ...

Ergebnisse
Bakterien vermittelt dieses Plasmid eine Ampicillinresistenz (amp r ) und Hefen die Produktion
des Enzyms Dehydrogenase (leu2). Dieses Enzym ist essentiell für den
Metabolismus der Aminosäure Leucin, einer zum Wachstum von Hefezellen notwendigen
Aminosäure. Durch die Verwendung eines Leu-auxotrophen Hefestammes (S. cerevisiae
CG1945) wurde ein Selektionsvorteil für plasmidtragende Hefezellen geschaffen.
Die Plasmide (pACT2) wurden durch den Hersteller (Clontech) bereits in den E. coli-Stamm
BNN132 transformiert und die cDNA-Bibliothek auf Vollständigkeit überprüft.
Die Inserts hatten eine durchschnittliche Länge von 1,4 kb (0,4 - 4,5 kb), die Höhe des Titers
betrug >10 8 cfu/ml und die Anzahl der unabhängigen Klone 3,2x 10 6 .
Die Expression von in Prostatagewebe konnte bereits nachgewiesen werden (Knox et al.,
1994). In dieser Arbeit wurde die cDNA-Bibliothek auf das Vorhandensein von cDNA
überpüft (siehe Abb.11). Dazu wurden Primer zu sechs verschiedenen Bereichen der
Nukleotidsequenz der zytoplasmatischen Domäne der Untereinheit generiert (FN2-5´;
TAM-3´; TAM5´; FN3-3´; FN4-5´; CT-3´). Für den Nachweis der cDNA wurde mit
diesen Primern eine PCR durchgeführt. Anschließend wurde je 1 / 5 des 50 Ansatzes auf
einem 1,5%-igen Agarosegel aufgetrennt und mittels des interkalierten Ethidiumbromids
durch UV-Licht visualisiert.
Abbildung 11 zeigt, daß die cDNA-Bibliothek alle Bereiche der cDNA der zytoplasmatischen
Domäne der Untereinheit beinhaltet.
54