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Blitzlicht Funktionelle ProteinanalyseAbb. 3: In vivo-Markierung von COS-7-Zellen. Transfizierte COS-7-Zellenexprimieren mitochondrial codiertesCytochrom-8A als SNAP-tag-Fusionsprotein(eingesetzter Vektor: pSNAP-Cox8A). Das fluoreszierende SubstratTMR-Star passiert die Zellmembranund markiert das Zielprotein (rot).Blau: Zellkern-Markierung mitHoechst 33342Auch eine sequenzielle Markierung mit mehrals zwei Fluorophoren ist mit den neuen Tagsmöglich. Solche Mehrfarb-Markierungsexperimentewurden beispielsweise für die Untersuchungder Zellwandsynthese während derHefeknospung eingesetzt 14 . Darüber hinauseröffnet die nicht überlappende Substratspezifitätder SNAP- und CLIP-tags gleichzeitigePulse/Chase-Experimente zur VisualisierungAbb. 4: COS-7-Zellen exprimieren den SNAP-Transferrin-Rezeptor. Pulse/Chase-Experiment mit SNAP-Surface 547(rot) und anschließender SNAP-488-Markierung (grün).verschiedener Generationen zweier unterschiedlicherProteine in einer Zelle, was dasPotential dieses Versuchsansatzes nochweiter erhöht 3 .Protein-Protein-InteraktionsstudienProtein-Protein-Interaktionen spielen eineSchlüsselrolle in den meisten biologischenProzessen. Die SNAP-Tag-Technologie bietetauch hier vielfältige Möglichkeiten,relevante Wechselwirkungen zwischen demFusionsprotein und putativen Ligandenzu charakterisieren. Proteine können dazumit Fluorophoren markiert werden, diespeziell auf FRET-Experimente (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer) ausgelegt sind,und mit denen bereits Untersuchungen zurHomo- und Heterodimerisierung von GPCRsdurchgeführt wurden 9-10 . Verglichen mit derklassischen Fluoreszenzmarkierung zeigensich auch hier Vorteile der neuen Markierungstechnologie.Neben der Möglichkeit,Fluorophor-Paare zu selektieren, die fürFRET-Experimente optimal geeignet sind,bieten die SNAP/CLIP-tag-Markierungen denVorteil, dass unreife oder fehlgefaltete – alsonoch im Sektretionsweg steckende – Proteinenicht zum beobachteten Signal beitragen.Außerdem können die FRET-Experimentemit traditionellen biochemischen Versuchsansätzenkombiniert werden: Magnet-Beads, die mit dem Substrat des SNAP-tagsgekoppelt wurden, können etwa für Pull-Down-Experimente zur Identifizierung undCharakterisierung von Interaktionspartnerndes zu untersuchenden Proteins eingesetztwerden.Daneben erweisen sich SNAP-tag-Fusionenauch als interessant für Hochdurchsatz-Experimentezur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionin vitro: entweder FRET-basiertin der Oberflächen-Plasmon-Resonanz 15oder auch bei der Entwicklung von Protein-Microarrays 16-17 . Die Möglichkeit, einzelnewissenschaftliche Fragestellungen durcheine Vielzahl verschiedener experimentellerAnsätze zu untersuchen, macht die SNAP-tag-Technologie besonders interessant für dieAnalyse von Protein-Protein-Interaktionen.AusblickEine zunehmende Zahl wissenschaftlich publizierterStudien dokumentiert das Potentialinsbesondere der SNP-tag- und Clip-tag-Technologiezur Untersuchung zellbiologischerund biochemischer Fragestellungen mit denderzeit verfügbaren Substraten. Fortschrittein der Chemie eröffnen die Synthese vollkommenneuartiger SNAP/CLIP-tag-Markierungenund damit ganz neue Wege in der Analysevon Proteinfunktionen. Als Beispiele seienan dieser Stelle die vor kurzem eingeführten„optical switches“ genannt, die die Sensitivitätbei FRET-Experimenten erhöhen 18 . Auchder Einsatz von Farbstoffen, die auf Einflüsseaus ihrer Umgebung reagieren 19 , sollte nichtunerwähnt bleiben. Mit Hilfe vorgefertigteraktivierter Benzylguanin-Derivate („BuildingBlocks“) kann der Experimentator unkompliziertauch eine Markierung seiner Wahlankoppeln. Dadurch kann er ein SNAP-Tag-Substrat – zum Beispiel mit Farbstoffen oderBeads – erzeugen, das auf seine spezifischewissenschaftliche Fragestellung zugeschnittenist.Während der Einsatz von Fluoreszenzproteinenden Experimentator auf eineWellenlänge festgelegt und eine Änderungdes Versuchsansatzes stets zu neuen Klonierungenmit anschließender Charakterisierungführt, bietet die SNAP-tag-Technologie mehrFlexibilität – durch einfachen Wechsel desSubstrats lassen sich verschiedene Fluorochromeoder Markierungen rasch und ohnegroßen Aufwand einbringen.Literatur[1] Shuman, H.A., Silhavy, T.J., and Beckwith, J.R. (1980) J.Biol. Chem. 255, 168.[2] Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T. et al. (2003)Nat. Biotechnol. 21, 86.[3] Gautier, A., Juillerat, A., Heinis, C. et al. 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