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Blitzlicht ToxizitätsassaysAFig. 2: PBMCs als Testsystem für antiinflammatorische Substanzen. A: Messung derCytokinfreisetzung und Toxizität. B: Der Vergleich der Cytokinfreisetzung mit derToxizität erlaubt die Abschätzung des möglichen therapeutischen Fensters.Effekte in humanen Zellen, die aufgrund vonSpeziesunterschieden im Tiermodell verborgenbleiben.Beim Einsatz von PBMCs sind jedoch aucheinige Besonderheiten zu berücksichtigen.Zum Beispiel sind die Beschaffung und Logistikschwieriger als bei stabilen Zelllinien, unddie Ausbeute an Zellen aus einer Spende istbegrenzt, so dass mit vergleichsweise kleinenChargen gearbeitet werden muss. Zur Gewinnungder PBMCs werden die Zellen durchZentrifugation über einen Ficoll-Gradientenvon Plasma und Erythrozyten abgetrennt undVerunreinigungen durch Erythrozyten überhypotonische Lyse entfernt. Nach der Isolationkönnen die Zellen sofort eingefroren oder fürdas Experiment verwendet werden. Die frischgewonnenen Zellen sollten sich überwiegendim arretierten Zustand befinden, könnenjedoch bei Bedarf mit Agenzien wie Phytohämagglutininoder durch Mischen von Zellenverschiedener Spender zur Zellteilung angeregtoder nach Bedarf stimuliert werden.PBMC-Anwendung: Testungantimitotischer AgenzienEin Beispiel für den Nutzen der PBMCs zurCharakterisierung von Wirkstoffen in derHit-to-Lead-Phase ist das Testen antimitotischerReagenzien. Wir haben Inhibitoren derAurora-Kinase und der Zyklin-abhängigenKinasen (CDKs) auf antimitotische Wirkunggetestet. Dabei lautete die Arbeitshypothese:Substanzen, die selektiv ZellzyklusregulierendeCDKs oder Aurora inhibieren,sollten auf proliferierende Zellen toxischwirken, ruhende Zellen jedoch nicht beeinflussen.Auf dieser Basis wurde eine Reihevon CDK-Inhibitoren entwickelt, die derzeitin klinischen Studien erprobt werden. DieEignung des Testsystems aus ruhenden/replizierendenPBMCs wurde zunächst mittelsbekannter Substanzen mit antimitotischerWirkung validiert. Dabei konnte gezeigtwerden, dass bekannte Substanzen wie Doxorubicinoder Taxol auf sich teilende ZellenBtoxischer wirken als auf ruhende Zellen, ebensowie Inhibitoren der Aurora-Kinase (Abb. 1Aoben), zu denen es bereits wissenschaftlichpublizierte Daten gibt. Für Inhibitoren ausdem internen Aurora-Projekt ermöglicht dasSystem eine deutliche Rangfolge hinsichtlichder Selektivität gegenüber proliferierendenZellen und liefert eine Entscheidungsgrundlagefür die Auswahl der aussichtsreichstenVerbindungen.Überraschend ist jedoch die Wirkungbekannter sowie intern entwickelter CDK-Inhibitoren. Lediglich der publizierte CDK-Inhibitor PD-332991 ist selektiv gegenüberproliferierenden PBMCs, während alle übrigenInhibitoren auf ruhende Zellen genauso toxischwirken wie auf proliferierende. Tatsächlichist dieser Toxizitätsmechanismus mit großerWahrscheinlichkeit der Hauptgrund für denmäßigen Erfolg der diversen CDKis in präklinischenund klinischen Studien. Eine Korrelationsanalyseder CDKi-vermittelten Aktivitätenauf ruhende/replizierende Zellen sowie biochemischeAktivitätsbestimmungen ergabeneine deutliche Korrelation der Toxizität zurHemmung von CDK7 und/oder CDK9 und/oder weiteren unbekannten Targets (Abb. 1B).Dabei ist bekannt, dass die selektive Hemmungvon CDK9 pharmakologisch toleriert wird. Tatsächlichist diese Erkenntnis zur Toxizität vonBedeutung, da bis heute in der Medizinalchemiewenig Wert auf die Selektivität der CDKisinnerhalb der CDK-Familie gelegt wurde. Sehrinteressant ist hier der Befund, dass der CDK4-und CDK6-spezifische CDK-Inhibitor PD332991selektiv auf proliferierende PBMCs wirkt, wasauf ein wichtiges pharmazeutisches Prinzipzur Hemmung von proliferierenden Zellenhindeuten könnte.Ein weiterer mechanistischer Aspekt derselektiven Wirkung von CDK-Inhibitoren aufTumorzellen ist nicht nur die Hemmung vonproliferierenden Zellen per se, sondern einedurch Mutationen bedingte besondere Abhängigkeitder Tumorzelllinien von einzelnenCDKs („oncogene addiction“). Dies könnteeine selektive Inhibition von Tumorzellengegenüber ruhenden Zellen bedingen, aberauch gegenüber nicht transformierten proliferierendenZellen, so dass tumorselektiveCDK-Inhibitoren im Testsystem der ruhenden/replizierendenPBMCs nicht auffallenwürden.Um entsprechend wirksame CDK-Inhibitorenzu identifizieren, wurden diese aufToxizität in einer Reihe von Tumorzellliniengetestet und die so erhaltenen Daten mitder Toxizität gegenüber ruhenden PBMCsverglichen (Abb. 1C). Auffallend ist hier, dassRo-0506220 selektiv auf proliferierende Tumorzelllinienwirkt, sowohl verglichen mitruhenden als auch proliferierenden PBMCs.PBMCs als Testsystem fürantiinflammatorische SubstanzenEine weitere Einsatzmöglichkeit für PBMCsist die Charakterisierung antiinflammatorischerSubstanzen. Eine Alternative zuden verbreiteten NF-κB Reportergenassaysbietet das Screenen in PBMCs auf Inhibitionder Zytokinfreisetzung. Bei diesem Assaywird nach Stimulation der PBMCs mit LPSdie Freisetzung von Zytokinen gemessen.In dem in Abbildung 2A dargestellten Beispielist die Inhibition der Freisetzung derZytokine IL1β, IL6, IL8 und TNFα dargestellt,die zum Beispiel problemlos per ELISA- oderMesoScale-Technologie im 96-oder 384-well-Format quantifiziert werden kann. Die Vorhersagekraftdieses Assays ist mit anderenin vitro-Systemen kaum zu erreichen, da allerelevanten humanen Blutzelltypen beteiligtsind und verschiedene Zytokine gleichzeitiggemessen werden können. Das System bieteteine noch bessere Grundlage zur Auswahl aktiverSubstanzen, wenn parallel (bzw. zeitlichnachgeschaltet) zur Zytokinfreisetzung dieToxizität der Verbindungen gemessen wird.Der Quotient aus Toxizität und Inhibition derZytokinfreisetzung kann zur Abschätzung destherapeutischen Fensters in vivo eingesetztund als Auswahlkriterium für aktive Substanzenherangezogen werden (Abb. 2B).Der logistische Aufwand für den Einsatzvon PBMCs ist zwar höher als beim Einsatzvon etablierten Zelllinien, wird jedoch durchdie wesentlich höhere Aussagekraft mehr alsausgeglichen. Bei geeigneter Logistik eignetsich das PBMC-System auch für primäreScreeningkampagnen.KorrespondenzadresseDr. Jan EickhoffLead Discovery Center GmbHEmil-Figge-Str. 76A44226 DortmundTel.: +49-(0)231-9742-7005+49-(0)163-656-7005Fax: +49-(0)2231-9742-7039eickhoff@lead-discovery.de6 | 10. Jahrgang | Nr. 4/2009 LABORWELT
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