Olfaktorische Rezeptoren mit speziellen topographischen ...

Material und Methoden
zwischen 1,8 und 2,2. Niedrigere Werte deuten auf eine Kontamination durch
Proteine oder organische Lösungsmittel hin.
2.2 Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen mit Hilfe der ”Polymerase-
Kettenreaktion” (PCR)
Die Amplifikation von DNA durch PCR erfolgt mit Hilfe von Oligonukleotiden mit
spezifischen Eigenschaften: Die Spezifität der Reaktion wird durch die Homologie der
Primer zur jeweiligen Zielsequenz der DNA sowie über den GC-Gehalt der Primer
bestimmt. Primer dürfen weder ausgeprägte Sekundärstrukturen bilden noch sollten
sie mit sich selbst oder mit dem jeweiligen gemeinsam verwendeten Primer zur
Dimerisierung neigen. Typischerweise werden synthetische Oligonukleotide mit
einer Länge von 17 bis 18 bp und einem GC-Gehalt von ca. 50% eingesetzt.
Abhängig von der jeweils verwendeten DNA-Polymerase erfolgten die Reaktionen in
unterschiedlichen Reaktionen:
Tabelle 2: Reaktionenlösungen der verwendeten DNA-Polymerasen.
Eppendor Master Taq Titanium Taq
Tris-HCl pH8 20 mM 20 mM
KCl 50 mM 50 mM
dNTPs 0,4 mM 2 mM
Primer je 100 pM 100 pM
Template ca. 100 ng ca. 100 ng
Die Reaktion erfolgten in einem Volumen von 20 µl bzw. 50 µl und wurden bis zum
Start der PCR auf Eis gekühlt. Die Amplifikation erfolgte in einem Thermo Cycler.
Die Temperatur für die Elongationsschritte müssen an das verwendete Enzym
angepasst werden. Sie erfolgte bei 72°C bei Verwendung der Master Taq und bei
68°C bei Verwendung der Titanium Taq. Für den Ablauf der Reaktionen wurden
folgende Temperaturprofile verwendet:
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