Olfaktorische Rezeptoren mit speziellen topographischen ...

Material und Methoden
Berechnung der Schmelztemperatur von Nukleinsäure-Hybriden wurde die von
Meinkoth und Wahl (1984) bestimmte Formel verwendet.
Tm = 81,5°C + 16,6 log M + 0,41 (% G+C) – (500/n) - 0,61 (% Formamid)
Tm = Schmelztemperatur der Hybride in C
M = Molarität an NaCl
G+C = Basenzusammensetzung der verwendeten RNA-Sonde
n = Länge der eingesetzten RNA-Sonde
Die Schmelztemperatur gibt an, bei welcher Temperatur 50% der Basenpaarungen
zwischen Sonde und Zielsequenz gelöst sind. Aus der Formel wird ersichtlich, dass
zum Einen durch Erhöhung des Formamid-Gehalts die Schmelztemperatur
erniedrigt, zum Anderen auch durch hohe Hybridisierungs- bzw. Waschtemperaturen
die Bedingungen stringenter werden. Bei den in dieser Arbeit durchgeführten in situ-
Hybridisierungen wurden stets Bedingungen hoher Stringenz angewandt, d.h.
hochstringente Hybridisierungsbedingungen (50% Formamid, bei 55°C) sowie
hochstringente Waschbedingungen (0,1 fach SSC bei 60°C). Zur Denaturierung von
Sekundärstrukturen wurden die RNA-Sonden in Hybridisierungspuffer für 10 Minuten
bei 65°C erhitzt und danach sofort 5 Minuten auf Eis abgekühlt, um ein Renaturieren
der RNA zu verhindern. Auf jeden Objektträger wurden etwa 3 ng DIG bzw. Biotin
markierte RNA in 100 µl Hybridisierungspuffer gegeben und ein Deckglas blasenfrei
aufgelegt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 55°C in einer mit 50% Formamid
befeuchteten Kammer.
2.13.5 Waschen nach der Hybridisierung
Die Schnitte wurden unter leichtem Schütteln zweimal 30 Minuten mit 0,1 fach SSC
bei 60°C gewaschen.
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