Olfaktorische Rezeptoren mit speziellen topographischen ...

Material und Methoden
bei 37°C in 1 ml SOC zum Aufbau der Ampicilin-Resistenz kultiviert. 200 µl der
Transformation wurden auf LB/Amp-Platten (LB-Medium mit 1,5% Agar und
100µg/ml Ampicillin) ausplattiert. Zur blau/weiß-Selektion rekombinanter Kolonien
wurden die Agar-Platten zwei Stunden vor dem Ausplattieren mit 70 µl 100 mM IPTG
in H2O und 70 µl 2% X-Gal in DMSO beschichtet. Die Kultivierung der Bakterien
erfolgte bei 37°C über Nacht.
2.4 Herstellen von cDNA
Eine genetische Analyse der Expression von Genen zu bestimmten Zeitpunkten oder
Stadien kann nur durch die Identifizierung der jeweils transkribierten und gereiften
RNA im jeweiligen Gewebe durchgeführt werden. Dafür wird die gesamte im Gewebe
vorliegende RNA isoliert und in die enzymatisch weniger anfällige cDNA
umgeschrieben.
2.4.1 Gewebepräparation und Isolierung von RNA
Die in dieser Arbeit entnommenen Gewebe waren das hauptolfaktorisches Epithel
und das Vomeronasalorgan. Zur Isolierung des Gewebes wurde der RNA-
Extraktions-Kit der Firma Palm bzw. Stratagene verwendet. Das entnommene
Gewebe wurde in ein RNase freies Eppendorf Reaktionsgefäß gegeben und mit
Lysepuffer bis zur vollständigen Auflösung inkubiert. Knochen des
hauptolfaktorischen Epithels und des Vomeronasalorgans wurden zuvor mit RNase
freien Miniaturpottern zerrieben. Die Isolierung der RNA erfolge über die Bindung von
RNA und DNA an eine Matrix in Zentrifugenröhrchen (Palm/Stratagene). Die DNA
wurde 30 Minuten durch Zugabe einer DNase verdaut und mit Hilfe der im Kit
enthaltenen Puffern zusammen mit den im Gewebe enthaltenen Proteinen von der
Matrix abzentrifugiert. Abschließend wurde die RNA mit 70%igem Ethanol
gewaschen und mit 70 µl Bidest bei 55°C eluiert. Für die darauffolgende cDNA-
Synthese wurden 20 µl RNA Lösung verwendet. RNA Proben der VNOs wurden
zuvor mit der Speed-Vac Konzentrator auf 20 µl eingeengt.
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