Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

Methoden zur Evaluation von Zytotoxizität
und
Struktur-Wirkungs-Beziehungen an
Trypanosoma brucei brucei
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Verena Hörr
aus Bad Mergentheim
Würzburg 2008

Eingereicht am:..................................................
bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie
1. Gutachter:.....................................................
2. Gutachter:.....................................................
der Dissertation
1. Prüfer:.............................................................
2. Prüfer:.............................................................
3. Prüfer:.............................................................
des Öffentlichen Promotionskolloquiums
Tag des Öffentlichen Promotionskolloquiums:.............................
Doktorurkunde ausgehändigt am:.............................

The trouble with the world is
that the stupid are cocksure and
the intelligent are full of doubt.
Bertrand Russell (1872-1970)
Britischer Philosoph und Mathematiker
Nobelpreis für Literatur 1950

INHALTSVERZEICHNIS 5
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 11
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.1.1 Bakterielle Infektionen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.1.1.1 Arzneimittelsituation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.1.1.2 Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft? . . . . . 13
1.1.2 Humane Afrikanische Trypanosomiasis (HAT) . . . . . . . . . . . 14
1.1.2.1 Erkrankung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.1.2.2 Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.1.2.3 Kombinationstherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.1.2.4 ”Public-Private-Partnership” . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.1 ”hits”, “leads” und Arzneistoffkandidaten . . . . . . . . . . . . . 21
1.2.2 ”In-vitro-whole-cell-bioassays” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS) . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2 Problemstellung und Ziele der Arbeit 27
3 Theoretische Grundlagen 30
3.1 Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2 Prokaryoten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.1 Klassifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.1.1 Zellwand . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.1.1.1 Gram-negative Bakterien . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.1.1.2 Gram-positive Bakterien . . . . . . . . . . . . . 32
3.2.1.2 Stoffwechsel aerober und anaerober Bakterien . . . . . . 33
3.2.2 Kolloidchemie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.2.2.1 Zeta-Potenzial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.2.2.2 Elektrophoretische Mobilität . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.2.2.3 Stabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.2.2.4 Wechselwirkung zwischen Licht und Materie . . . . . . 38
3.2.2.5 Praktische Anwendung: Turbidimetrie . . . . . . . . . . 40

6 INHALTSVERZEICHNIS
3.3 Optische Spektroskopie an Molekülen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.3.1 Absorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.3.2 Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.3.3 Fluoreszenzlöschung (”Quenching”) . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4 Kapillarelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.1 Apparatur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.4.1.1 Injektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.4.1.2 ”Sample stacking” . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.4.1.3 Detektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.4.1.4 Auflösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.4.2 Trennprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.4.3 Elektroosmotischer Fluss (EOF) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.4.4 Kapillarelektrophoretische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.4.4.1 Kapillarzonenelektrophorese (CZE) . . . . . . . . . . . . 50
3.4.4.2 Kapillargelelektrophorese (CGE) . . . . . . . . . . . . . 50
3.4.5 Eigenschaften von “fused silica” Oberflächen . . . . . . . . . . . . 50
3.4.6 Wandbeschichtung (”Coating”) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.4.6.1 Permanente Beschichtung . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.4.6.2 Dynamische Beschichtung . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.5 Magnetische Kernresonanz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.5.1 Messprinzip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
3.5.2 Klassische Darstellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.5.2.1 Relaxation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5.2.1.1 Bloch-Gleichungen . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5.2.1.2 Spinecho . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.5.2.2 Chemischer Austausch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.5.3 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.5.4 Bildgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.5.4.1 Schichtselektionsgradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.5.4.2 Lesegradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.5.4.3 Phasenkodiergradient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.5.4.4 k-Raum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4 Ergebnisse und Diskussion 63
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT . . . . . . . . . . . . . . 63
4.1.1 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.1.2 AlamarBlue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
4.1.3 AlamarBlue-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.1.3.1 Lösungsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

INHALTSVERZEICHNIS 7
4.1.3.2 Referenzsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.1.3.3 Etabliertes Testsystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4.1.4 Struktur-Wirkungs-Beziehungen benzannelierter Systeme . . . . 71
4.1.4.1 Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) . . . . . . . . . . 71
4.1.4.1.1 C,C-verknüpfte NIQs . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.1.4.1.2 N,C-verknüpfte NIQs . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.1.4.2 Fluorchinolone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganis-
men . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
4.2.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels Kapillarelektrophorese 80
4.2.2 Auswahl verschiedener Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . 80
4.2.3 Problematik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.2.4 Standardisierung der Bakterienkulturen . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.2.4.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
4.2.4.2 Wachstumskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.2.4.3 Kalibrierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.2.5 Trenntechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.2.6 Entwicklung eines Trennpuffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.2.6.1 Überblick über literaturbekannte Puffersysteme . . . . . 86
4.2.6.2 Eignung verschiedener Puffersysteme . . . . . . . . . . 87
4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode . . . . . . . . . . . . . . 92
4.2.6.3.1 Pufferkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.2.6.3.2 PEO Konzentration und Viskosität . . . . . . . 94
4.2.6.3.3 Probenpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . 96
4.2.6.3.4 Probenkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . 98
4.2.6.4 Mechanistische Betrachtung . . . . . . . . . . . . . . . . 100
4.2.7 Reproduzierbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
4.2.7.1 Pufferinstabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.2.7.2 Probeninstabilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
4.2.7.3 Elektrophoretische Heterogenität . . . . . . . . . . . . . 104
4.2.7.4 Biologische und statistische Einflüsse . . . . . . . . . . . 105
4.2.8 Übertragung der Methode auf: P. fluorescens und S. vestibularis . . 106
4.2.9 Anwendungsbreite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.2.9.1 N. cinerea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4.2.9.2 Trypanosoma brucei brucei . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
4.2.10 Trennung verschiedener Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . 110
4.2.11 Validierung der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
4.2.11.1 Linearität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
4.2.11.2 Präzision . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

8 INHALTSVERZEICHNIS
4.2.12 Fazit: CE-Analyse von Mikroorganismen . . . . . . . . . . . . . . 115
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkie-
rung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid . . . . . . . . . . 117
4.3.3 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR) . . . . . . . . . . 120
4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . 120
4.3.4.1.1 Sättigungskonzentration . . . . . . . . . . . . . 120
4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung . . . . . . . . 121
4.3.4.2 Testung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
4.3.5 LIF-CE zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation . . . . . 124
4.3.5.1 Injektionstechnik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung . . . . . . . . . 127
4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung . . . . . . . . 127
4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE . . . 128
4.3.5.3 Charakteristische “fingerprints” . . . . . . . . . . . . . . 129
4.3.5.4 Testung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
4.3.6 Möglichkeiten und Grenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136
4.3.6.1 Lösungsmittel-Effekt und Wirkmechanismus . . . . . . 136
4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilität-Ausblick . . . . . . . . . . . . . 139
4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays” . . . . . . . 139
4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum . . . . . . . . . . 140
4.4.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels NMR . . . . . . . . . 140
4.4.2 Chemischer Austausch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
4.4.3 Anwendungsbreite des Parameters T2 . . . . . . . . . . . . . . . . 141
4.4.4 Analyse der Zellproliferation von S. vestibularis . . . . . . . . . . 144
4.4.4.1 Korrelation zwischen T2, Zellzahl und pH . . . . . . . . 144
4.4.4.2 Komponenten im BHI-Medium . . . . . . . . . . . . . . 146
4.4.4.3 Metabolite . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150
4.4.4.4 Quantitative Beiträge zur T2-Änderung während der
Zellproliferation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
4.4.4.4.1 Nährstoffverbrauch im Medium . . . . . . . . 151
4.4.4.4.2 pH-Einfluss durch Bakterienmetabolismus . . 153
4.4.4.4.3 Effekt der Zellzunahme . . . . . . . . . . . . . . 154
4.4.4.4.4 Metabolitenkonzentrationen . . . . . . . . . . . 155
4.4.4.4.5 Maßgebende Einflussfaktoren . . . . . . . . . . 156
4.4.5 T2 als Maß für die antibiotische Wirksamkeit . . . . . . . . . . . . 157
4.4.5.1 Auswahl des Testsystems . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

INHALTSVERZEICHNIS 9
4.4.5.2 T2-Beeinflussung durch Vancomycin . . . . . . . . . . . 158
4.4.5.3 Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit . . . . . . 158
4.4.5.4 Potenzial-Praktikabilität-Ausblick . . . . . . . . . . . . . 159
4.4.6 Fazit: T2 als Marker für Zellwachstum . . . . . . . . . . . . . . . . 160
5 Experimenteller Teil 161
5.1 Bakteriologische Untersuchungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
5.1.1 Kapillarelektrophorese (CE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
5.1.1.1 Messapparatur und Geräteparameter . . . . . . . . . . . 161
5.1.1.2 Spülschritte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
5.1.1.3 Wasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
5.1.1.4 CE-Trennpuffer (pH = 8.7) . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
5.1.3 Mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
5.1.4 Ultraschallbad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
5.1.5 Magnetische Kernresonanz (NMR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
5.1.5.1 Bildgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
5.1.5.1.1 Messapparatur und Geräteparameter . . . . . . 163
5.1.5.1.2 Sequenz und Parameter . . . . . . . . . . . . . 164
5.1.5.1.3 Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
5.1.5.2 Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . 165
5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid . . . . . . . . . 165
5.1.7 Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
5.1.7.1 Antibiotika-Lösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
5.1.7.2 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
5.1.7.2.1 Bakterien-Stämme . . . . . . . . . . . . . . . . . 166
5.1.7.2.2 Kultur-Medien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
5.1.7.2.3 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
5.1.7.2.4 Zellkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
5.1.7.2.5 Zellpräparation und Stammsuspensionen zur
kapillarelektrophoretischen und fluoreszenz-
spektroskopischen Analyse . . . . . . . . . . . 168
5.1.7.2.6 Zellpräparation und Stammsuspensionen für
die NMR-Messungen . . . . . . . . . . . . . . . 168
5.1.8 Zytotoxizität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR) . . . . . 169
5.1.8.2 LIF-CE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 169

10 INHALTSVERZEICHNIS
5.1.8.3 Mikrodilutionsverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
5.2 Zytotoxizitätstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei . . . 170
5.2.1 Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
5.2.1.1 Baltz-Medium-Basis-Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . 170
5.2.1.2 Baltz-Medium zur Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . 171
5.2.2 Parasitenkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.2.2.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.2.2.2 Stabilate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.2.2.3 Zellkonzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
5.2.3 Referenz- und Testsubstanzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
5.2.3.1 Stammlösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
5.2.3.2 Arbeitslösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
5.2.4 AlamarBlue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
5.2.5 Durchführung des Zytotoxizitätstests . . . . . . . . . . . . . . . . 174
5.3 Berechnung von ED50-Werten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
6 Zusammenfassung 176
7 Summary 179
A Abkürzungsverzeichnis 182
B Prozessierung der Rohdaten 185
C Region of Interest (ROI) 188
D Literaturverzeichnis 191
Danke 215

Kapitel 1
Einleitung
1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases”
Der Begriff “Orphan Drugs” (Orphan auf englisch die Waise) wurde 1983 erstmals für
Arzneimittel zur Behandlung seltener Krankheiten verwendet [94]. Mit der Gründung
des Orphan-Drug-Status durch das U. S. Orphan-Drug-Gesetz versuchte man die Ent-
wicklung von Arzneistoffen gegen diese Krankheiten anzukurbeln, da unter norma-
len Umständen aufgrund des teilweise kleinen Marktes und des geringen Umsatzes
während des gesetzlichen Patentschutzes für diese Arzneimittel keine Chance besteht,
die Entwicklungskosten einzuspielen. Ähnliche Gesetzgebungen folgten in Japan, Au-
stralien und 2000 in der Europäischen Union. Hier entscheidet das “Committee for
Orphan Medicinal Products” (COMP) über die Aufnahme in die Liste der “Orphan
Drugs”. Die Zuerkennung des Status kann sich sowohl auf epidemiologische, d. h.
nicht mehr als fünf Patienten unter 10.000 Personen in der EU dürfen davon betroffen
sein, als auch auf wirtschaftliche Kriterien stützen. Die EU-Verordnung vom 22.01.2000
verpflichtet dabei die europäische Zulassungsagentur EMEA (”European Medicines
Agency”), Firmen bei der Entwicklung, insbesondere bei Design und Durchführung
klinischer Studien für solche Arzneimittel zu unterstützen [94].
Wirtschaftlichkeit und Rentabilität definieren nicht nur den Begriff des “Orphan Drug”
sondern auch den Begriff der “Neglected Diseases”. Dabei handelt es sich um Krank-
heiten, die hauptsächlich in Kaufkraft schwachen Teilen Afrikas, Asiens und Amerikas
vorkommen und deren Arzneimittelforschung und -entwicklung durch effektive Ko-
operationen zwischen öffentlichen und privaten Unternehmen bzw. Organisationen
(”public-private-partnerships for product development”, PD-PPP) gewährleistet wer-
den soll.
Ob Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft sind und wie sich die Arzneimittel-
situation der Afrikanischen Trypanosomiasis, einer der zehn Krankheiten, die von der
“World Health Organization” (WHO) als “Neglected Diseases” gelistet sind [5], in den
11

12 1. Einleitung
letzten Jahren zuspitzte, wird nachfolgend diskutiert.
1.1.1 Bakterielle Infektionen
1.1.1.1 Arzneimittelsituation
In den letzten Jahren nahm die Zahl an Organ- und Systeminfektionen durch Gram-
positive multiresistente Bakterien wie Methicillin-resistente Staphylococcus-aureus-
(MRSA)-Stämme, Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE), Penicillin-resistentem
Streptococcus pneumoniae (PRSP) und Fluorchinolon-resistentem Pseudomonas aerugino-
sa (FQRP) stetig zu [50, 104, 113, 116, 261]. Abbildung 1.1 gibt einen Überblick über
die Resistenzentwicklung der letzten Jahre [50]. Vor allem stieg die Anzahl registrier-
ter MRSA-Fälle dramatisch an. Bei MRSA handelt es sich um Staphylococcus-aureus-
Stämme, gegen die alle β-Lactam-Antibiotika (Penicilline, Cephalosporine, Carbape-
neme) inklusive des Penicillinase-festen Methicillins (Oxacillin, Flucloxacillin) und
häufig auch andere Antibiotika-Gruppen wie Makrolide, Clindamycin und Fluorchi-
nolone, ihre Wirksamkeit verloren haben [197, 203]. Während seit über 40 Jahren
MRSA-Stämme als nosokomiale (”hospital-acquired”, HA) Problemkeime bekannt
sind, werden in letzter Zeit weltweit neue Varianten von MRSA-Stämmen beobachtet,
sogenannte ubiquitär auftretende (”community-acquired”, CA) MRSA-Keime [159].
Als letzte Waffen gegen diese multiresistenten Staphylococcus-aureus-Erreger galten
lange Zeit die beiden Glykopeptide Vancomycin und Teicoplanin, bis 2002 der erste
Fall von Vancomycinresistenz mit gleichzeitiger Kreuzresistenz gegenüber Teicopla-
nin auftrat [10, 27, 245].
Auch wurde die Therapie einiger Gram-negativer Keime wie Acinetobacter bauman-
nii und “extended spectrum”-β-Lactamase (ESBL)-bildenden Enterobacteriaceae und
Klebsiella-Spezies in den letzten Jahren immer schwieriger [260]. In einigen Teilen
der Vereinigten Staaten sind viele Isolate von Acinetobacter-Keimen bereits gegen alle
Aminoglykoside, Cephalosporine und Fluorchinolone resistent [156].
Mittlerweile stehen neue Therapiealternativen zur Behandlung dieser multiresisten-
ten, HA- und CA-Keime zur Verfügung bzw. befinden sich gerade in der klini-
schen Prüfung [131]. Durch Molekülvariationen bekannter Wirkstoffe einer Arznei-
stoffgruppe versuchte man den Resistenzmechanismus zu überwinden. Beispiele sol-
cher Schrittinnovationen der letzten Jahre sind: Tigecyclin (Glycylcycline als Weiter-
entwicklung der Tetracycline), Dalbavancin und Oritavancin (Glykopeptide), Telithro-
mycin (Ketolide als Weiterentwicklung der Makrolide) und Quinupristin/Dalfopristin
(Streptogramine). Doch wurde schon nach kurzer Zeit von Resistenzen gegen Telithro-
mycin und Quinupristin/Dalfopristin berichtet [119, 142]. Ebenso zeigte sich bei den
im Jahr 2000 und 2003 neu auf den Markt gekommenen Wirkstoffgruppen der Oxazo-
lidinone (Linezolid) und zyklischen Lipopeptide (Daptomycin), die erste Resistenzbil-

1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 13
dung [167,181,233]. Diese schnelle Resistenzentwicklung ist vor allem auf den Einsatz
als Breitbandantibiotika zurückzuführen.
1.1.1.2 Antibiotika die “Orphan Drugs” der Zukunft?
Abbildung 1.1: Anstieg resistenter
und multiresistenter
Bakterien. (PRSP=Penicillinresistenter
Streptococcus pneumoniae,FQRP=FluorchinolonresistentePneumokokken,MRSA=Methicillin-resistenter
Staphylococcus aureus,
VRE=Vancomycin-resistente
Enterokokken) [50].
Trotz der zunehmenden Häufigkeit und Schwere antimikrobieller Resistenzen ist die
zukünftige Entwicklung neuer Antiinfektiva durch die Einstellung dieses Forschungs-
gebietes vieler großer Pharmaunternehmen bedroht [75, 183, 188, 248, 279]. Für die
Großunternehmen ist die Entdeckung und klinische Entwicklung von neuen Anti-
infektiva im Vergleich zu Arzneistoffen gegen chronische Erkrankungen unrentabel
[52, 210, 213, 244]. Kleinere Firmen unternehmen derzeit den Versuch die Antibioti-
kaforschung aufzunehmen und auf die medizinische Notwendigkeit aufmerksam zu
machen, doch ist ungewiß, ob die notwendigen finanziellen Mittel, die klinische Ent-
wicklung und die Kooperationsmöglichkeiten mit den großen pharmazeutischen Un-
ternehmen ausreichend sind, um die Therapiesicherheit bakterieller Infektionserkran-
kungen zu gewährleisten [211,242]. Im März 2003 wurde die “Antimicrobial Availabi-
lity Task Force” (AATF) der “Infectious Diseases Society of America” (IDSA) ins Leben
gerufen. Ihre Aufgabe besteht darin den derzeitigen Trend in Bezug auf Forschung,
Entwicklung und Herstellung von Antiinfektiva zu bewerten, und ihre zukünftige
Verfügbarkeit zu gewährleisten. In ihrem Bericht vom Juli 2004: ”Bad Bugs, no drugs:
As antibiotic R&D stagnates, a public health crisis brews” schlug die IDSA deshalb
staatliche Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Therapiesicherheit vor [260].
Derzeit befindet sich lediglich ein Antibiotikum, das Ramoplanin, in Amerika in der
dritten Phase der klinischen Prüfung. Es handelt sich dabei um eine neuartige Antibio-
tikaklasse, einem Lipoglykodepsipeptid, und soll bei Blutinfektionen durch Vancomy-
cin-resistente Enterokokken zum Einsatz kommen. Die Rechte an diesem Arzneistoff
wurden 2001 von dem italienischen Biotechnologieunternehmen Biosearch Italia einli-
zensiert. Am 9.10.2001 bekam Ramoplanin in Europa bereits den Orphan-Drug-Status
zugesprochen, wodurch im Falle einer Zulassung das Medikament etwa 10 Jahre ex-
klusiv vermarktet werden kann (Marktexklusivrecht) [283].

14 1. Einleitung
1.1.2 Humane Afrikanische Trypanosomiasis (HAT)
1.1.2.1 Erkrankung
Die Afrikanische Schlafkrankheit (human African trypanosomiasis, HAT) ist eine der
wichtigsten, aber gleichzeitig auch die am meisten in Vergessenheit geratene tropische
Infektionskrankheit. Die Erreger sind einzellige Parasiten der Gattung Trypanosoma,
dem Stamm der Protozoen angehörend und werden von Tsetse-Fliegen (Glossina spp.)
übertragen. Die humane Afrikanische Trypanosomiasis existiert in zwei Formen mit
unterschiedlichen klinischen Symptomen. Man unterscheidet zwischen Trypanosoma
brucei gambiense (Erreger der Westafrikanischen Schlafkrankheit) und Trypanosoma bru-
cei rhodesiense (Erreger der Ostafrikanischen Schlafkrankheit). Trypanosoma brucei brucei
ein den humanpathogenen Subspezies morphologisch identischer Krankheitserreger,
verursacht die bovine Trypanosomiasis (Nagana-Seuche) und wird aufgrund seiner
humanen Apathogenität häufig als Teststamm im Labor eingesetzt [175]. Eine Klassi-
fizierung dieser drei Erreger ist ausschließlich anhand biologischer Kriterien wie In-
fektionsspektrum, Pathogenität, Übertragungsmodus und geographische Verbreitung
möglich [1]. Durch das Biotop des Vektors, welches von Senegal bis zur nördlichen
Grenze der Kalahari und Namibias reicht, ist die Erkrankung auf den afrikanischen
Kontinent beschränkt [175]. Berichten der WHO zufolge sind derzeit eine halbe Milli-
on Menschen mit Trypanosomen infiziert [251]. Die Erkrankung verläuft über klinisch
unterschiedliche Stadien. Die ersten Symptome zeigen sich nach höchstens fünf Tagen
nach Infektion durch eine lokale Hautreaktion an der Einstichstelle, dem sogenannten
Trypanosomen-Schanker [251]. Einhergehend mit Fieber verbreiten sich die Erreger
dann im weiteren Verlauf von der Einstichstelle über Blut und Lymphe im gesam-
ten Organismus aus (Stadium I), durchdringen allmählich die Blut-Hirn-Schranke und
erreichen schließlich das Zentralnervensystem (Stadium II). Dort führen sie zu einer
chronischen Enzephalopathie mit schweren Kopfschmerzen, Wesensveränderungen
und unterschiedlichen neurologischen Ausfällen. Namensgebend für die Erkrankung
ist das Endstadium, bei dem die Patienten in einen Dämmerzustand verfallen, immer
wieder einschlafen, zu ihrer Umgebung keinen Kontakt mehr halten und schließlich
versterben. Während die Westafrikanische Schlafkrankheit langsam beginnt und un-
ter allmählicher Progression das Stadium II erreicht, zeigt die Ostafrikanische Schlaf-
krankheit einen akuten Beginn mit häufig auftretendem Haut-Schanker und führt oft
bereits nach wenigen Wochen im Stadium I zum Tod [253].
1.1.2.2 Therapie
Gegen die Afrikanische Schlafkrankheit gibt es keine Impfstoffe und die Aussichten
auf eine prophylaktische Immunisierung sind schlecht, da die Parasiten ihre aus Anti-
genen bestehende Oberfläche periodisch ändern [253,271]. Zur Therapie bleiben somit

1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 15
ausschließlich Arzneistoffe. Die therapeutischen Strategien sind weitgehend auf dem
Stand der 60er Jahre stehen geblieben und basieren auf den fünf Arzneistoffen: Sura-
min, Melarsoprol, Pentamidin, Eflornithin und Nifurtimox (Abbildung 1.2). Die ein-
zigen wesentlichen Neuerungen ergaben sich in der Begleittherapie, wodurch unter
dem Einsatz von Glukokortikoiden die schweren Therapiekomplikationen abgemil-
dert werden können [201]. Nifurtimox verfügt über keine Zulassung zur Therapie der
HAT, sondern lediglich zur Therapie der Amerikanischen Trypanosomiasis (Chagas
Krankheit) [26]. Dennoch wird es bei Patienten, die gegenüber Melarsoprol resistent
sind und bei denen keine anderen Therapiealternativen bestehen, zur Behandlung von
T.-b.-gambiense-Infektionen eingesetzt. Die Wahl des Medikamentes hängt vor allem
davon ab, in welchem Stadium die Krankheit diagnostiziert wurde - und zwar vor
oder nach dem Eindringen in die Zerebrospinalflüssigkeit. In Tabelle 1.1 sind die der-
zeitigen Therapieoptionen zusammengefaßt:
Westafrikanische Ostafrikanische
Schlafkrankheit Schlafkrankheit
Trypanosoma brucei Trypanosoma brucei
gambiense rhodesiense
Stadium I 1.Wahl: Pentamidin 1.Wahl: Suramin
(hämo-lymphatischer Befall) 2.Wahl: Suramin 2.Wahl: Melarsoprol
Stadium II 1.Wahl: Melarsoprol 1.Wahl: Melarsoprol
(Meningoenzephalitis) 2.Wahl: Eflornithin 2.Wahl: Melarsoprol
+Nifurtimox
Tabelle 1.1: Therapiestrategien zur Behandlung der Afrikanischen Trypanosomiasis (nach Referenz
[250]).
Alle Therapieansätze sind unbefriedigend aufgrund ihrer:
• Unakzeptablen hohen Toxizität. Beispielsweise liegt die Letalität unter Thera-
pie beim Melarsoprol zwischen 4 % bis 12 % [84]. Mit großer Wahrscheinlich-
keit würde keines dieser Medikamente heute die Kriterien für eine internationale
FDA-Zulassung erfüllen [250].
• Schlechten Wirksamkeit und ihrer aufwändigen Applikation [90]. Bis auf Nifur-
timox, welches oral verabreicht werden kann, ist bei allen anderen Arzneistof-
fen nur eine intramuskuläre bzw. intravenöse Applikation möglich [49, 250]. Die
Melarsoprol-Behandlung dauert minimal 10 Tage und erfordert zumindest im
Stadium II eine intensive medizinische Behandlung und Überwachung [251].
• Arzneistoffresistenz [48]. Eine zunehmende Resistenzentwicklung gegen Melar-
soprol wird vor allem aus Angola und Uganda berichtet, wo in manchen Stand-

16 1. Einleitung
orten eine Resistenzrate von 30 % erreicht wurde [250].
• Fehlenden internationalen Standardisierung. Trotz einiger Vorgaben der WHO
N
H 2
N
H 2
sind Therapieschemata (Dosierung und Therapiedauer) international nicht stan-
dardisiert und nahezu jedes Land verwendet eigene Richtlinien und Behand-
lungskonzepte [250].
Na +
Na +
-
O3S O O
- Na +
N
H
-
O3S SO3 CH3 C
NH
Eflornithin
HOOC
Pentamidin
CHF 2
NH 2
O
NH
O O
N
H
Suramin
O
H 3
N
H
O
NH
NH
NH 2
N
H 2
-
Na +
N
H
O S 3
N N
SO 3
N N H
Melarsoprol
O 2 N
NH 2
-
Nifurtimox
SO 3
Na +
-
Na +
S
As
S
O N N
Abbildung 1.2: Strukturen der Arzneistoffe, die zur Behandlung des frühen und späten Stadiums der
Afrikanischen Trypanosomiasis eingesetzt werden. Zu beachten ist, dass Nifurtimox keine Zulassung
zur Therapie besitzt, jedoch bei Versagen von Melarsoprol eingesetzt wird.
Im Folgenden werden die zur Verfügung stehenden fünf Arzneistoffe mit ihren mögli-
chen Wirkmechanismen näher beschrieben:
1. Suramin (Germanin ® , Bayer AG)
C
H 3
O
S
O
Bei Suramin handelt es sich um ein farbloses vielfach sulfoniertes, symmetri-
sches Naphthylamin, welches erstmals 1922 zur Therapie der HAT eingesetzt
OH

1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 17
wurde [276]. Es ist im Stadium I sowohl gegen T. b. gambiense als auch T. b. rho-
desiense wirksam. Aufgrund seiner hohen negativen Ladung weist es eine hohe
Affinität gegenüber Serumproteinen auf, einschließlich dem “low density lipo-
protein” (LDL) [272]. Für dieses Lipoprotein besitzen Trypanosomen einen Re-
zeptor und man vermutet, dass Suramin über Rezeptor-vermittelte Endozyto-
se an LDL gebunden aufgenommen wird [70]. Sein Wirkmechanismus ist nicht
vollständig bekannt, beruht aber möglicher Weise auf der Hemmung zahlreicher
Enzyme aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen [49]. Die Therapie mit Su-
ramin versagt zwischen 25 % bis 35 % der Fälle [49]. Der Grund für diese ho-
he Versagensrate liegt möglicherweise in einer reduzierten LDL-Aufnahmerate.
Vielfach wurden Übelkeit, Erbrechen, Hautausschlag, vorübergehendes Fieber,
Leber- und Nierenschäden sowie Thrombocyto- und Neutropenie als Nebenwir-
kungen beschrieben [26, 65].
2. Pentamidin (Lomidine ® , Aventis AG)
Pentamidin ist ein aromatisches Diamidin und wurde 1937 entdeckt [235]. Es
ist das Medikament der Wahl in der frühen Phase der Westafrikanischen Schlaf-
krankheit. Es wirkt direkt gegen den Parasiten unabhängig von seiner physiolo-
gischen Stoffwechselaktivität im Wirt und wird, wie auch die Melaminylphenyl-
Arsenverbindungen (Melarsoprol, vide infra), unter anderem über P2-Amino-
Purin-Transporter, im Parasiten hoch-konzentriert angereichert [54, 55]. Der Ver-
lust dieses Transporters kann bei den Parasiten zur Kreuzresistenz gegenüber
Diamidinen und Arsenverbindungen führen. Der Wirkmechanismus ist nicht
vollständig geklärt. Aufgrund der hohen Arzneistoffkonzentrationen von eini-
gen Millimolar [54] liegt die Vermutung nahe, dass der zytotoxische Effekt sei-
ne Ursache in der Hemmung vieler zellulärer Zielstrukturen (Proteine, Lipide,
kleine Furche der DNA) [20, 69, 185] hat, hervorgerufen durch elektrostatische
Wechselwirkungen. Als Nebenwirkungen können Hypotonie, Übelkeit, Nieren-
schäden und Diabetes mellitus auftreten. Diese Folgeerscheinungen sind teilwei-
se durch eine große Affinität zu Imidazolin-Rezeptoren zu erklären [281].
3. Melarsoprol (Mel B, Arsobal ® , Aventis AG)
Melarsoprol ist eine melaminhaltige Arsenverbindung und wurde 1949 als trypa-
nozides Medikament vor allem zur Therapie der späten Phase von T. b. gambien-
se und T. b. rhodesiense eingeführt [100]. Aufgrund seiner Lipophilie diffundiert
es ungehindert durch zelluläre Membranen, wird aber zusätzlich durch den P2-
Amino-Purin-Rezeptor in den Parasiten angereichert [20, 21, 54, 55]. Melarsoprol
ist ein Prodrug, in welchem die Reaktivität des trivalenten Arsens des Melarsen-
oxids mit 2,3-Dimercaptopropanol maskiert wurde [90]. Nach Applikation spal-
tet sich die Schutzgruppe schnell ab und es entsteht freies Melarsenoxid (Ab-

18 1. Einleitung
N
H 2
bildung 1.3), welches schnell und reversibel an Serumproteine insbesondere an
Thiole bindet, unter anderem an Trypanothion [76, 145]. Auf diese Weise können
wichtige Stoffwechsel- und Transportfunktionen inhibiert werden. Wahrschein-
lich führt ein Zusammenspiel aus Trypanothionerschöpfung und Hemmung der
Trypanothionreduktase zum Zelltod (Abbildung 1.5, vide infra) [90,93]. Trypano-
thion und Trypanothionreduktase sind die Grundbausteine des Redoxstoffwech-
sels der Trypanosomatiden [92, 150] und ersetzen das Glutathion/Glutathionre-
duktase-Paar in Pro- und fast allen Eukaryoten [91]. Da Melarsoprol in Wasser
nahezu unlöslich ist, wird es intravenös, in Propylenglykol gelöst, verabreicht.
Propylenglykol führt jedoch häufig zu Irritationen im Gewebe. Darüber hinaus
verursacht Melarsoprol in 5 % bis 10 % der Fälle eine akute Enzephalopathie, wo-
bei die Hälfte der Fälle tödlich verläuft [90, 200]. Weitere Nebenwirkungen sind
Übelkeit, periphere Neuropathie, Gelenkschmerzen und Thrombophlebitis [90].
N
N
H
N
N
NH 2
Melarsoprol
S
As
S
OH
HS
Das Grundgerüst dieser Arzneistoffgruppe
wird als Melarsen (Melaminylphenyl-Arsen) bezeichnet
SH
OH
N
H 2
2,3-Dimercaptopropanol
As
N
H
N
N
H
N
N
NH 2
N
N N
NH 2
Melarsenoxid
Abbildung 1.3: Spaltung von Melarsoprol in das therapeutisch wirksame Melarsenoxid.
4. Eflornithin (Difluormethylornithin (DMFO), Ornidyl ® , Aventis AG)
Eflornithin wurde in den frühen 80er Jahren ursprünglich zur Krebstherapie ent-
wickelt, jedoch in der klinischen Prüfungsphase gegen neoplastische Erkran-
kungen als zu toxisch eingestuft [22, 26]. Es erwies sich jedoch im Stadium II
der Westafrikanischen Trypanosomiasis als wirksam und ist seit 1990 zur The-
rapie der HAT zugelassen. Nach seiner Einführung in die Therapie glänzte es
durch seine Wirksamkeit und bekam den Beinamen “Resurrection Drug”, das
NH 2
As
O

1.1 ”Orphan Drugs and Neglected Diseases” 19
“Auferstehungsmedikament” [253]. Eflornithin ist als Ornithin-Analogon ein ir-
reversibler Inhibitor des Enzyms Ornithin-Decarboxylase (ODC) im Polyamin-
Biosyntheseweg [170]. Die Folgen der Hemmung sind ein Verlust an Putrescin
und Spermidin und letztendlich eine Verringerung des Trypanothion-Spiegels
(Abbildung 1.5, vide infra) [90]. Die Arzneistoffaufnahme geschieht sowohl über
passive Diffusion als auch über Transporter [24, 207]. Trotz einer ähnlichen Affi-
nität zur Ornithin-Decarboxylase in Säugetierzellen wirkt Eflornithin spezifisch
auf Trypanosomen aufgrund einer geringeren Replikationsrate der Ornithin-
Decarboxylase [206]. In vitro wirkt Eflornithin zytostatisch [51]. Zur Beseitigung
der Blutstromformen in vivo ist somit ein intaktes Immunsystem notwendig,
denn nichtteilungsfähige Trypanosomen können ihre antigene Oberfläche nicht
mehr ändern und sind somit immunologisch angreifbar [90]. Die Nebenwirkun-
gen sind relativ gering, obwohl es zur Beeinflussung der Blutbildung kommen
kann.
5. Nifurtimox (Lampit ® , Bayer AG)
Nifurtimox besitzt eine Nitrofuran-Struktur und wurde in den 60er Jahren auf
den Markt gebracht. Die Aufnahme erfolgt wahrscheinlich durch passive Diffu-
sion [49]. Der Wirkmechanismus beruht auf einer periodischen Reduktion und
Oxidation der Nitrogruppe am Furangerüst (Abbildung 1.4). Durch ein Fla-
voenzym wird zunächst in einer Einelektronenreduktion das Radikalanion ge-
bildet. Dieses reagiert nachfolgend mit molekularem Sauerstoff zu Superoxid-
Anionen, die unter Dismutation Wasserstoffperoxid produzieren [80, 221]. Der
letzte Schritt wird durch das in allen aeroben Zellen gegenwärtige kupferhalti-
ge Enzym Superoxid-Dismutase (SOD) katalysiert. Dieser oxidative Stress, ver-
ursacht die Zerstörung zellulärer Komponenten wie DNA, Membranlipide und
Proteine. Säugetierzellen haben zwar im Vergleich zu Parasiten einen besseren
Schutz gegenüber oxidativer Zerstörung, dennoch sind Nebenwirkungen, wie
neurologische Schäden extrem häufig und führen bei 50 % der Patienten zum
Abbruch der Therapie [49, 90].
R NO 2
Flavoenzym
R NO 2 -
.
R NO - O 2 + 2
R NO2 +
. .
Superoxid-
O - 2 + O2 - + 2H+
H O O 2 2 + 2
Dismutase (SOD)
.
.
O 2 -
Abbildung 1.4: Enzymkatalysierte
REDOX-Reaktion
der Nitrogruppe des Nifurtimox
und Bildung von Superoxiden
und Wasserstoffperoxid.

20 1. Einleitung
1.1.2.3 Kombinationstherapie
Da derzeit kein neues Medikament in Sichtweite ist, tendiert die Behandlungsstrate-
gie zunehmend zur Kombinationstherapie. Besonders geeignet sind dabei Melarso-
prol, Eflornithin und Nifurtimox, die alle drei den Trypanothion-Spiegel beeinflus-
sen - entweder durch Hemmung der Trypanothion-Produktion, durch Eingriff in des
dazugehörige REDOX-System (durch oxidativen Stress gebildetes DNA-, Lipid- oder
Wasserstoffperoxid und gebildeter Radikale wird Trypanothion zu Trypanothiondisul-
fid oxidiert) oder durch Inhibition der Trypanothion-Reduktase (Abbildung 1.5). Ihre
synergistische Wirkung konnte im Tiermodell gezeigt werden und eine Kombinations-
therapie von Nifurtimox-Eflornithin wurde bereits bei Patienten, die sich gegenüber
jeglicher Therapie unempfindlich zeigten, durchgeführt [137, 246].
TRYX
TRYP
Nifurtimox
.
REDOX-System
N
H 2
ROOH 2 RS RSSR
ROH+
H 2 O
RSSR 2 RSH
N
N
H
N
N
NH 2
Ornithin
ODC
Putrescin
Spermidin
Trypanothion
S
As
S
TRYS
TRYR
Trypanothiondisulfid
+ H3N + H N 3
OH
NADP+
+ H3N + H3N COO-
COO-
COO-
COO-
O
O
?
H
N
N
H
NADPH + H+
O
O
DMFO
H
N
N
H
O
SH
SH
O
N
H
H
N
O
S
S
O
N
H
H
N
O
O
H
N
N
H
O
O
H
N
N
H
NH 2 +
N
H 2
N
N
H 2
NH 2 +
N
H 2
N
N
N
H
N
N
+ H N 3
+ H N 3
H
N
N
NH 2
Melarsenoxid
COO-
COO-
As
O
P2-Purin-
Transporter
H
N
O
S
As
S
O
N
H
Mel T
Weitere Targets ?
Abbildung 1.5: Synergie-Effekt von Eflornithin (DMFO), Melarsoprol und Nifurtimox (Modell nach
Referenz [90]). Alle drei Arzneistoffe beeinflussen den Trypanothion-Metabolismus. Abkürzungen:
ODC, Ornithin-Decarboxylase; TRYP, Tryparedoxin-Peroxidase; TRYR, Trypanothion-Reduktase; TRYS,
Trypanothion-Synthetase; TRYX, Tryparedoxin.
O
O
N
H
H
N
O
O
H
N
N
H
NH 2 +

1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 21
1.1.2.4 ”Public-Private-Partnership”
Um die Jahrtausendwende kam die Arzneimittelforschung und -entwicklung für “Ne-
glected Diseases” nahezu zum Erliegen [199, 267]. Zwischen 1975 und 1999 kamen
1393 neue Medikamente auf den Markt. Davon waren nur 13 gegen Tropenkrank-
heiten [268]. Das Interesse an der Arzneimittelentwicklung schwand mit dem Ende
des Kolonialismus, den Änderungen in der Firmenpolitik der pharmazeutischen Indu-
strie, den steigenden Kosten für die Arzneimittelforschung und -entwicklung und den
zunehmenden Auflagen [72]. Argumente der Unrentabilität Produkte gegen Krank-
heiten für eine Bevölkerungsgruppe ohne Kaufkraft zu entwickeln, führten zuneh-
mend zu einer ablehnenden Haltung seitens der Industrie. Ende der 90er Jahre wurde
ein Produktionsstopp für die Medikamente gegen die Afrikanische Schlafkrankheit
angekündigt. Gleichzeitig wurde Eflornithin als Bestandteil einer Enthaarungscreme
(Vaniqa ® , Bristol-Myers-Squibb) zur Behandlung des Damenbartes eingeführt. Eine
Produktion als Injektionslösung wurde zunächst weiterhin abgelehnt [252]. Erst inten-
sive Lobbyarbeit unter der Führung der Nicht-Regierungsorganisation “Médecins sans
Frontières”, Träger des Friedensnobelpreises 1999, bewog Entscheidungsträger der
pharmazeutischen Industrie zu einer Änderung ihrer Firmenpolitik. Im Mai 2001 wur-
de zwischen dem Aventis-Konzern und der Weltgesundheitsorganisation eine Über-
einkunft getroffen, in der sich Aventis zu einer Neuproduktion und einer kostenlo-
sen Bereitstellung von Pentamidin, Melarsoprol und Eflornithin für die Therapie der
Schlafkrankheit verpflichtet. Die BAYER AG schloss sich kurze Zeit später mit ihren
beiden Produkten Suramin und Nifurtimox dieser Vereinbarung an. Diese “Public-
Private-Partnership” (PPP) unterliegt derzeit einer Evaluation durch die Partner. Es
ist von entscheidender Bedeutung für Kontrollprogramme der Schlafkrankheit und
für Patienten in Afrika, weiterhin verlässlich mit diesen essenziellen Medikamenten
rechnen zu können. Die Bedeutung der Public-Private-Kooperationen liegt in der Ver-
teilung von Schlüsselfunktionen auf Universitäten, Pharmaindustrie und “Not-for-
profit-Organisationen” [72]. Beispiele für kürzlich entwickelte PPPs mit dem Ziel der
antiparasitären Arzneistoffauffindung sind: “Medicines for Malaria Venture” (MMV),
“Drugs for Neglected Diseases Initiative” (DNDi) und das “Institute for One World
Health” (IOWH).
1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva
1.2.1 ”hits”, “leads” und Arzneistoffkandidaten
Der einfachste Weg zur Auffindung neuer Antiinfektiva ist die sogenannte Label-
Extension-Strategie. Sie wird häufig bei der Suche nach Arzneimitteln gegen tropi-
sche Erkrankungen angewandt, deren Forschung nicht von kommerzieller Seite an-

22 1. Einleitung
getrieben wird. Bei dieser Strategie wird die Indikation bereits bestehender Arznei-
mittel zur Therapie anderer humaner oder animaler Erkrankungen ausgeweitet, wo-
durch vor allem die Forschungs- und Entwicklungskosten erheblich gesenkt werden
können [208, 225, 280]. Erfolgreich war diese Strategie z. B. bei Praziquantel, einem ur-
sprünglich als Anthelminthikum zugelassenen Arzneimittel, das nun in der Therapie
der Schistosomiasis eine wichtige Rolle spielt [132, 190].
Die Auffindung neuer Arzneistoffe ist jedoch zunehmend notwendig. Ihr Weg ist ein
iterativer Prozess und verläuft wie in Abbildung 1.6 dargestellt über viele Zwischen-
stufen.
Potenzielle
Inhibitoren
Testung auf Wirksamkeit und Toxizität
“Target- and cellbased
screening“
“hits“
Tiermodell, ADME,
Toxizität
Iterative medizinische Chemie
Optimierung von Wirkung und
pharmazeutischer Eigenschaften
“leads“
Detailliertere
Untersuchungen,
Optimierung
Arzneistoffkandidaten
Abbildung 1.6: Stadien der Arzneistoffauffindung, modifiziert nach [208]
Klinische Studien
Arzneistoff
Der Prozess der Arzneimittelauffindung impliziert die Synthese, die Identifizierung
von Vorstufen möglicher Arzneistoffkandidaten, die physikalisch-chemische Charak-
terisierung und die Testverfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit
potenzieller Wirksubstanzen. In den letzten Jahren konnten auf dem Gebiet der Syn-
these große Fortschritte erzielt werden. Die Methode der kombinatorischen Chemie
mit systematischer Kombination verschiedener Bausteine und die Methode der “ran-
dom chemistry”, einem Verfahren, bei welchem Substanzen nach dem Zufallsprinzip
aus γ-bestrahlten Ausgangs-Cocktails entstehen, ermöglichen die schnelle Erstellung
großer Substanzbibliotheken. Doch unabhängig davon ob die Suche nach neuen Leit-
strukturen von Naturstoffen, Synthese, kombinatorischer Synthese oder “random che-
mistry” ausgeht, der Prozess der Arzneistoffauffindung erfordert immer vollautomati-

1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 23
sierte In-vitro-Testsysteme an Enzymen, Rezeptoren, Bakterien und Zellen, sogenannte
High-Throughput-Screening-Verfahren (HTS). Die Testung der Substanzen auf Wirk-
samkeit erfolgt dabei entweder speziell an einem bestimmten Target (”target-based-
assay”) oder direkt bezüglich des ganzen Erregers (”whole-cell-based-assay”). Sub-
stanzen, welche in vitro gegen ganze Zellen eine Aktivität ≤ 1 µM zeigen und diese
bezüglich des Erregers mindestens 10fach stärker ist als gegenüber Säugetierzellen,
werden als “hits” bezeichnet [190, 208]. Diese sind Kandidaten für weitere Testungen
in Tiermodellen der Krankheit. In diesem Stadium fließen bereits Untersuchungen zu
physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Löslichkeit, Permeabilität, Lipophilie, pka
und Stabilität ein, aus deren Profilen Vorhersagen zu den pharmazeutischen Eigen-
schaften Adsorption, Distribution, Metabolismus und Elimination (ADME) gewonnen
werden können. Substanzen die sich in Tiermodellen aktiv zeigen und zusätzlich ei-
ne hohe Selektivität der Wirkung, gute Verfügbarkeit, lange Wirkdauer und eine gute
Verstoffwechslung bei geringer Toxizität zeigen, bezeichnet man als “leads”. In iterati-
ven Schritten werden diese Leitsubstanzen bezüglich Wirkung und pharmazeutischer
Eigenschaften (ADME) optimiert. Hierzu werden verschiedene Strukturabkömmlinge
einer Leitstruktur getestet, um anhand von Struktur-Wirkungs-Beziehungen (”struc-
ture activity relationship”, SAR) Zusammenhänge zwischen Struktur und pharmako-
dynamischer und -kinetischer Eigenschaften zu analysieren. Erreicht eine Substanz ein
Stadium, in dem sie an Patienten erprobt werden kann, spricht man von einem Arznei-
stoffkandidaten. Ab hier beginnen die klinischen Studien.
Bisher basierte die Testungs-Strategie hauptsächlich auf Target-Based-HTS-Verfahren
(sogenannte Piggy-Back-Strategie) [190]. Als besonders günstig erwies es sich, wenn
das mikrobielle Target auch zur Therapie anderer Erkrankungen relevant ist und so-
mit zur Testung die gleichen Ausgangsverbindungen eingesetzt werden können [105].
Die Cystein-Protease, einem vielversprechenden Target in der Forschung antitrypano-
somaler Arzneistoffe wurde z. B. ursprünglich für die Entwicklung von Inhibitoren zur
Therapie der Osteoporose eingesetzt [225]. Zu bemerken ist, dass die aus der Parasiten-
Testung hervorgegangenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen, sich von denen der ur-
sprünglichen Indikation stark unterscheiden.
Trotz aller Bemühungen erwies sich diese Strategie auf dem Gebiet der Antiinfektiva
bis jetzt als nicht sehr erfolgreich [112, 195]. Schwierigkeiten zeigten sich vor allem in
der Korrelation zwischen Enzyminhibition und der Aktivität gegenüber ganzen Er-
regerzellen [19, 165]. Ursachen hierfür sind entweder die schlechte Permeabilität der
Testsubstanzen durch die Zellmembran intakter Zellen oder die fehlende Relevanz des
gewählten Targets [190]. So gibt es abgesehen vom Cystein-Protease-Inhibitor K777,
welcher sich zur Therapie der Chagas-Krankheit in Entwicklung befindet, derzeit kei-
ne Substanz, die als Antiinfektivum aus Target-Based-Screening-Verfahren hervorge-
gangen ist. Deshalb gewinnen “in-vitro-whole-cell-bioassays” zunehmend an Bedeu-

24 1. Einleitung
tung [190, 208].
1.2.2 ”In-vitro-whole-cell-bioassays”
Die meisten Bioassays an ganzen Zellen basieren auf der Beobachtung der Zellprolife-
ration bei Exposition mit Testsubstanzen in Flüssigkultur, sogenannte Dilutionsverfah-
ren. Die Auswertung erfolgt in der Regel mittels optischer Spektroskopie im visuellen
Wellenlängenbereich. Als “Indikator” dient entweder die Zunahme der Zellzahl an
sich, oder die Änderung der Zusammensetzung des Kulturmediums. Die folgenden
vier Techniken sind die auf der Basis der Lichtdetektion am häufigsten angewandten
Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit:
• Turbidimetrie: Tritt ein Lichtstrahl durch eine Zellsuspension, so wird er an den
Zellen gestreut und abgeschwächt. Diese Lichtabschwächung ist in erster Nähe-
rung zur Zellzahl proportional und wird über die Extinktion bzw. die optische
Dichte (OD) quantifiziert. Üblicherweise wird der OD-Wert bei 600 nm zur Be-
stimmung des Wachstumszustandes gemessen [23].
(Siehe auch Abschnitt 3.2.2.4)
• Nephelometrie: Ähnlich wie in der Turbidimetrie wird die Lichtstreuung an Zel-
len zur Bestimmung der Zellzahl genutzt. Jedoch wird in diesem Fall nicht die
Extinktion gemessen, sondern die Intensität des seitlich austretenden Streulich-
tes [182]. Häufig verwendet wird die Laser-Nephelometrie [204].
• Kolorimetrie (auch Absorptionsphotometrie genannt): Eine lichtabsorbierende
Substanz wird als Indikator stoffwechselbedingter Änderungen während der
Zellproliferation eingesetzt. Seine spektrale Charakteristik ist in der Regel pH-
oder REDOX-sensitiv und seine Konzentration kann durch Messung der Absorp-
tion bei einer bestimmten Wellenlänge nach dem Lambert-Beerschen Gesetz er-
mittelt werden. Der Indikator kann entweder intrazelluläre oder extrazelluläre
Änderungen, hervorgerufen durch Mediumverbrauch und Stoffwechselproduk-
tion, indizieren. Häufig verwendet werden AlamarBlue, Tetrazoliumsalze oder
Phenolrot [180, 189].
• Fluorimetrie: Diese Methode ist der Kolorimetrie sehr ähnlich. Der Unterschied
beruht lediglich auf dem Einsatz von Fluorophoren als Indikatoren (AlamarBlue
oder BCECF-AM) und einer fluorimetrischen Detektion [191, 217].
Neben diesen optischen Methoden werden in bekannten Literaturwerken [204] drei
weitere Methoden zur Bestimmung der Zellproliferation als brauchbar beschrieben.
Zwei dieser Methoden beruhen auf der Quantifizierung der Stoffwechselaktivität.
Zum einen eignet sich dazu die Radiometrie. Hier kann entweder die Freisetzung

1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 25
von radioaktiv markiertem 14 CO2 (im Bac-Tec-Verfahren realisiert) oder die Aufnahme
radioaktiv markierter Nukleotide wie [ 3 H]-Thymidin, [ 3 H]-Hypoxanthin oder Ami-
nosäuren gemessen werden [47, 78, 214]. Solche Methoden erfordern im Medium ei-
ne radioaktive Kohlenstoff- bzw. Wasserstoffquelle, wodurch ihre Durchführung auf-
grund gesetzlicher Auflagen problematisch ist. Eine andere Möglichkeit Stoffwechsel-
produktion und unter anderem CO2-Freisetzung zu messen, stellt die Kalorimetrie dar.
Hier wird mit einem Infrarot-Messsystem die durch den mikrobiellen Stoffwechsel
freiwerdende Wärme gemessen, wodurch ein Rückschluss auf die Zahl der Mikroor-
ganismen möglich ist.
Letztendlich eignet sich noch die Impedanzmessung. Gemessen wird der Widerstand
gegen den elektrischen Strom in der Zellkultur. Eine Verminderung der Impedanz ist
eine Folge von Zellvermehrung und -stoffwechsel, denn Nährstoffverzehr und Stoff-
wechselprodukte ändern die Komposition des Mediums.
All diese Detektionsmethoden können zur Auswertung von Testsystemen zur Bestim-
mung von Zytotoxizität angewandt werden. Sie wurden ursprünglich zur Messung
eines kleinen Probenumfanges entwickelt und ihre Anwendung in High-Throughput-
Screening-Verfahren mit Testungen von mehreren 100.000 Substanzen pro Tag ist
durch ihre Technik beschränkt.
1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS)
Schlüsselfaktoren für Testsysteme mit großer Durchsatzzahl, sogenannte High-
Throughput-Screening-Verfahren sind Miniaturisierung, Parallelisierung und Auto-
matisierung. Diese Kriterien sind durch den gesamten etablierten Testablauf von Pro-
benvorbereitung bis Detektion festgelegt. Zur Realisierung von Hochdurchsatz sollte
das Testverfahren aus nur wenigen einfachen Schritten bestehen, die vollautomatisier-
bar sind. Nicht selten werden Arzneistoff-exponierte Kulturen unter Einsatz von Robo-
tern in Mikrotiterplatten mit 1536-2080 Vertiefungen simultan präpariert. Die Miniatu-
risierung ist dabei maßgeblich zur Senkung der Kosten für Verbrauchsmaterialien und
Reagenzien. Zur parallelen Auswertung eignet sich vor allem die optische Detektion.
Ob in der Spektroskopie oder in der Bildgebung, die Turbidimetrie, Fluorimetrie und
Kolorimetrie sind die am häufigsten angewandten Verfahren. Diese Art der Detekto-
ren ist relativ kostengünstig und realisiert in einem “array” können sie die einzelnen
Proben separat aufzeichnen. Jede Methode erfordert jedoch für den Einsatz in High-
Throughput-Screening-Verfahren ein individuell angepasstes Design.
Konventionell wird zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit potenzieller An-
tiinfektiva das Mikrodilutionsverfahren nach DIN-Vorschrift (DIN 58940) [2] ange-
wandt. Es handelt sich dabei um ein Dilutionsverfahren mit turbidimetrischer Aus-
wertung, das in Mikrotiterplatten durchgeführt wird und die antimikrobielle Wirkung

26 1. Einleitung
durch den MIC(minimum inhibitory concentration)-Wert charakterisiert. Dieser ent-
spricht der Wirkstoffkonzentration, ab welcher gerade kein sichtbares Zellwachstum,
d. h. keine Trübung mehr zu erkennen ist. In anderen antimikrobiellen Testverfahren
auf der Basis der Fluorimetrie und Kolorimetrie wird die Aktivität einer Substanz zu-
meist als ED50(effective dose, 50%)-Wert angegeben. Die Variable wird häufig auch
als IC50(inhibitory concentration, 50%)- oder EC50(effective concentration, 50%)-Wert
bezeichnet und definiert diejenige Wirkkonzentration, die zu einer halbmaximalen In-
hibition oder Abtötung führt.
Sowohl bei der turbidimetrischen Detektion als auch bei den meisten fluorimetrischen
oder kolorimetrischen Methoden wird jedoch die Gesamtzellzahl erfasst, wodurch
eine Differenzierung der antimikrobiellen Wirksamkeit in statisch und toxisch nicht
möglich ist. In der Bakteriologie erfolgt diese meist in einem zweiten Schritt durch
Auszählung koloniebildender Einheiten (colony forming units, CFU) auf Agarplatten,
in der Parasitologie dagegen durch mikroskopische Betrachtung und Untersuchung
der Erreger auf Beweglichkeit. Beide Verfahren sind sehr zeitintensiv und es besteht
Bedarf an schnellen Testverfahren mit hoher Aussagekraft und Differenzierbarkeit.
Ein weiterer Nachteil der optischen Detektion eines Probenarrays in Mikrotiterplatten
ist die fehlende Möglichkeit senkrecht zum einfallenden Licht zu detektieren. Dadurch
sind nephelometrische Methoden ausgeschlossen und fluorimetrische stark limitiert.
Hinzu kommt, dass die Detektion des Lichtes aus einer Vertiefung durch Streulicht
aus der Umgebung gestört werden kann, wodurch Interesse an alternativen Detekti-
onsmethoden besteht.

Kapitel 2
Problemstellung und Ziele der Arbeit
Wie in Kapitel 1 bereits beschrieben ist die Arzneimitteltherapie der humanen Afrika-
nischen Trypanosomiasis problematisch. Sie ist auf dem Stand der 60er Jahre stehen
geblieben und es existieren keine probaten neuen Arzneistoffe. Aufgrund fehlender
Rentabilität zeichnet sich auf dem Gebiet der bakteriellen Infektionserkrankungen ein
ähnlicher Trend ab. Durch zunehmende Einstellung der Arzneistoffforschung und -
entwicklung ist auch hier die Therapiesicherheit gefährdet.
Die notwendige Auffindung neuer Arzneimittel wird zunehmend in Public-Private-
Kooperationen realisiert und erfordert neben der Synthese neuer Verbindungen
zuverlässige High-Throughput-Screening-Verfahren zur Identifizierung potenzieller
Leitstrukturen.
Diese Arbeit war eingebettet in den SFB 630, dessen Ziel in der “Erkennung, Gewin-
nung und funktionalen Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten” lag.
Auf der Suche nach neuen Leitstrukturen zur Therapie der humanen Afrikanischen
Trypanosomiasis sollte während dieser Arbeit
• ein robustes In-vitro-High-Throughput-Screening-Verfahren an den Blutstrom-
formen des TC 221-Stammes von Trypanosoma brucei brucei etabliert werden, wel-
ches sich zum “screening” großer Substanzbibliotheken eignet.
• eine Vielzahl von Substanzen, die im Rahmen der verschiedenen Teilprojekte
synthetisiert und isoliert wurden, auf ihre Wirksamkeit gegen Trypanosomen ge-
testet werden.
• Struktur-Wirkungs-Beziehungen analysiert werden, die zur weiteren Optimie-
rung der antiparasitären Wirkung bereits getesteter Substanzen beitragen sollen.
Neben der zielgerichteten Suche nach neuen Antiinfektiva standen aber auch die Tech-
nologie und die Methodik an sich im Interesse des SFBs. Zur Evaluation der antiinfek-
tiven Wirksamkeit neu synthetisierter Substanzen sollte nicht nur auf bekannte Me-
thoden zurückgegriffen werden, sondern auch die Innovationen der letzten Jahre auf
27

28 2. Problemstellung und Ziele der Arbeit
dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (capillary elektrophoresis, CE) und der ma-
gnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR) zur Entwicklung neuer
“in-vitro-whole-cell-bioassays” genutzt werden.
Ziel war es Alternativen und Ergänzungen zum Mikrodilutionsverfahren nach DIN
(DIN 58940), dem konventionell zur Testung an Bakterien angewandten High-
Throughput-Verfahren, zu entwickeln. Dieses Verfahren beruht ausschließlich auf der
Bestimmung der Gesamtzellzahl einer Bakterienkultur unter Exposition verschiedener
Testsubstanzen mittels optischer Detektion und erlaubt keine Aussage über die Art der
antimikrobiellen Wirkung . Erst in einem zeitaufwändigen zweiten Schritt kann durch
Auszählen koloniebildender Einheiten zwischen bakteriostatischer und bakterizider
Wirksamkeit unterschieden werden.
In der Kapillarelektrophorese boten vor allem die Arbeiten von Armstrong und Mit-
arbeitern neue Perspektiven [13–15, 77, 240]. Es gelang sowohl die simultane kapil-
larelektrophoretische Trennung, Identifizierung, Quantifizierung und Charakterisie-
rung von Bakterien und deren Agglomeraten, ohne die Mikroben bei der Messung
signifikant zu schädigen [86], als auch die Aufzeichnung der Elektropherogramme
mittels Fluoreszenz-Detektion zur Unterscheidung lebender und toter Bakterienzellen
nach Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid. Mit der Kapillarelektrophorese
bestand somit ein Potenzial, durch Trennung von Agglomeraten und Ketten unter-
schiedlicher Größe bakterienspezifische “fingerprints” zu erstellen und deren Ände-
rung unter dem Einfluss zytotoxischer Substanzen im Kontext mit der lebend/tot-
Rate der Bakterienpopulation zu diskutieren. Dadurch könnte innerhalb 15 Minuten
die Wirksamkeit der Testsubstanzen differenziert bestimmt werden. Da die CE Mi-
kroben gleichzeitig trennen und quantifizieren kann, sollte der Einfluss antiinfektiver
Wirksubstanzen in einem Ansatz messbar sein, wodurch der Durchsatz des Testverfah-
rens erheblich gesteigert werden kann. Da bisher die antibiotische Wirksamkeit mittels
SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung noch nicht bestimmt worden ist, waren Mes-
sungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät (FMR) mit eingeschlossen.
Der Aufbau des Test-Verfahrens auf der Grundlage der CE implizierte:
• Die zielorientierte Auswahl verschiedener Bakterienspezies und deren Kul-
turaufbau.
• Die Untersuchung elektrophoretischer Eigenschaften von Mikroben und die
Analyse physikalisch-chemischer Einflussfaktoren zum Verständnis der kapillar-
elektrophoretischen Mikroben-Analyse. Da zu diesem Zeitpunkt im Arbeitskreis
noch keine Erfahrung in der kapillarelektrophoretischen Charakterisierung von
Biokolloiden bestand, musste zunächst eine dafür geeignete CE-Methode eta-
bliert werden.

• Die Standardisierung einer CE-Methode zur Trennung, Identifizierung, Charak-
terisierung, Quantifizierung von Mikroorganismen und die Erstellung charakte-
ristischer “fingerprints”.
• Die Prüfung von Möglichkeiten und Grenzen der CE-Methode.
• Die Validierug der Fluoreszenzmarkierung von Bakterien mit den beiden DNA-
Markern SYTO9 und Propidiumiodid am FMR und an der CE (mit Laser-
induzierter-Fluoreszenz-Detektion, LIF-CE) zur Charakterisierung einer Bakte-
rienpopulation und zur Bestimmung ihrer lebend/tot-Rate.
• Die Standardisierung der Zytotoxizitätsbestimmung verschiedener Antibiotika
mit unterschiedlichem Wirkmechanismus mittels FMR und LIF-CE.
Eine weitere nicht invasive Methode zur Untersuchung von Zellkulturen stellt die
magnetische Kernresonanz dar. Bereits 1972 wurden die ersten Studien zum Metabo-
lismus an lebenden Hefezellen mittels NMR-Spektroskopie durchgeführt [85]. Hin-
zu kommt, dass die NMR-Spektroskopie zunehmend zum “screening” von Wirkstof-
fen (Ligand-Protein-Wechselwirkungen [114]) und zur klinischen Untersuchung von
Wirkstoffen gegen Infektionen in verschiedenen Wirtszellen in vitro und in vivo einge-
setzt wird [79,120]. Auch konnte im Bildgebungsexperiment die transversale Relaxati-
on als NMR-Parameter identifiziert werden, welcher sensitiv auf wachstumsbedingte
Änderungen in Bakterienkulturen reagiert [192].
Von diesen Tatsachen ausgehend, sollte ein Test-Verfahren potenzieller Wirkstoffe
auf Basis der CPMG-präparierten magnetischen Kernresonanztomographie entwickelt
werden. Die Etablierung der Methode beinhaltet:
• Die Untersuchung der Anwendungsbreite der T2-Parametrisierung des mikrobi-
ellen Wachstums.
• Die Quantifizierung und Interpretation der einzelnen Beiträge zur wachs-
tumsbedingten T2-Änderung durch Kombination von NMR-Spektroskopie und-
Bildgebung, wobei Untersuchungen zum Energie- und Aminosäurestoffwechsel
und zur Proteinkonzentration enthalten sind.
• Die Quantifizierung der antibiotischen Wirksamkeit.
Sowohl bei der CE- als auch bei der NMR-Methode sollte durch Vergleich der Daten
mit denen aus konventionellen mikrobiologischen Standardtechniken Anwendungs-
breite und Grenzen aufgezeigt werden.
29

30 3. Theoretische Grundlagen
Kapitel 3
Theoretische Grundlagen
3.1 Mikroorganismen
Mikroorganismen, auch Mikroben genannt, gelten als die kleinsten, mikroskopisch
darstellbaren Lebewesen. Zu ihrer Gruppe zählen unter anderem Bakterien, Algen,
Pilze, Hefen und Protozoen. Viren werden trotz ihrer geringen Größe nicht den Mikro-
organismen zugeordnet. Sie sind nicht in der Lage sich selbstständig zu reproduzieren,
sondern sind auf Stoffwechselleistungen ihrer Wirtszellen angewiesen. Unter den Mi-
kroorganismen gibt es zwei Grundformen der Zellorganisation: Pro- und Eukaryoten,
deren Unterscheidungsmerkmale in der Zellkompartimentierung liegen [101].
Da im Rahmen dieser Arbeit analytische Verfahren für Bakterien angewandt und ent-
wickelt werden, wird auf die Gruppe der Prokaryoten insbesondere eingegangen.
3.2 Prokaryoten
Die Familie der Prokaryoten definiert sich durch einen freien nicht von einer Kern-
membran umgebenen Zellkern, dem sogenannten Nucleoid, welcher aus einem zir-
kulären geknäuelten DNA-Molekül besteht. Die Zelle bildet in der Regel keine Kom-
partimentierung in Organellen aus, so dass sie im Wesentlichen aus Zellwand, Cyto-
plasmamembran, Cytoplasma mit Ribosomen und Nucleoid besteht. Mitglieder dieser
Familie sind Bakterien (Bakteria) einschließlich Actinomyceten und Cyanobakterien,
welche zur Gruppe der Archaeen gehören. Traditionell wird die Bezeichnung “Bakte-
rien”, abgeleitet vom griechischen Wort “bakterion”= Stäbchen, für alle zu den Proka-
ryoten gehörenden Organismen verwendet. Die meisten Bakterien besitzen eine Größe
zwischen 1 und 5 µm und liegen damit im oberen Größenbereich von Kolloiden [129].
Die Anwendung analytischer Methoden auf Bakterien unterliegt somit den Gesetzen
der Kolloidchemie (Abschnitt 3.2.2).

3.2 Prokaryoten 31
3.2.1 Klassifikation
Bakterien werden häufig aufgrund ihrer Form und Organisation eingeteilt. Die folgen-
den morphologischen und stoffwechselphysiologischen Gesichtspunkte gelten dabei
als Kriterium [237]:
• Drei Grundformen: Kokken, Stäbchen, Schrauben. Diese Grundformen können
einzeln auftreten oder sich zu typischen Formen (Cluster, Ketten) zusam-
menfügen.
• Vier Haupttypen der Begeißelung: monotrich, monopolar polytrich, bipolar po-
lytrich und peritrich.
• Die Ausbildung von Kapseln und Schleimen, die überwiegend aus Polysacchari-
den und Polypeptiden bestehen.
• Die Lebensweise insbesondere der Stoffwechsel und die Umweltbedingungen
wie Nährstoffe, pH-Wert, Temperatur und Sauerstofftoleranz.
• Der Aufbau der Zellwand, der aufgrund der Gram-Färbung identifiziert wird.
Auf die letzten drei Gesichtspunkte wird im nachfolgenden näher eingegangen. Sie
spielen neben der Grundform der Bakterienzelle eine zentrale Rolle bei der Methoden-
entwicklung zur Charakterisierung verschiedener Bakterienstämme mittels Kapillar-
elektrophorese und MRI (magnetic resonance imaging) und der daraus abgeleiteten
Etablierung von Testsystemen zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit poten-
zieller Wirksubstanzen.
3.2.1.1 Zellwand
Die Bakterienzellwand determiniert die Form und Festigkeit der Zelle und stellt einen
Schutz vor Pathogenen einschließlich Bioziden und Antibiotika dar [115, 173, 186].
Nach ihrem Verhalten bei dem von C. Gram entwickelten Färbeverfahren [110] un-
terscheidet man zwischen Gram-positiven (blau gefärbte) und Gram-negativen (rot
gefärbte) Bakterien. Unterschiedliche bakterielle Oberflächenstrukturen sind für die-
se Unterscheidung verantwortlich. Diese sind neben morphologischen Eigenschaften
auch für spezifische Immunreaktionen maßgeblich und bestimmen die Oberflächenla-
dung, sowie das Verhalten im elektrischen Feld [77].
3.2.1.1.1 Gram-negative Bakterien
Die Zellwand Gram-negativer Bakterien (Abbildung 3.1) besteht aus einer dünnen bis
10 nm dicken Mureinschicht (Peptidoglycanlayer, geknüpft aus N-Acetylmuramin-
säure, N-Acetylglucosamin und verschiedenen Aminosäuren), die von einer zweiten

32 3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.1: Zellwandaufbau
Gram-negativer Bakterien. Charakteristisch
ist die dünne Mureinschicht
und die äußere Membran,
deren äußeres Blatt überwiegend
aus Lipopolysacchariden
besteht. Alle anderen Membranen
werden von Phospholipiden
gebildet. In die Membran
sind Proteine integriert [143].
Zellmembran, der äußeren Membran (outer membrane, OM) bedeckt ist. Diese ist mit
der Mureinschicht über die “outer membrane proteins” (OmpA) und das Murein-
Lipoprotein verbunden. Sie besteht im Wesentlichen aus Lipopolysacchariden (LPS),
Proteinen und Phospholipiden [232]. Viele Proteine so z.B. das OmpF fungieren als Po-
rine, über welche Lösungen in die Zelle diffundieren können [222]. Die Lipopolysac-
charide, welche aufgrund ihrer pathophysiologischen Wirkung auf den Organismus
auch als Endotoxine bezeichnet werden [82,219], bestehen aus dem Lipoid A (Zytokin-
induktor), dem Kern-Polysaccharid (Core) und der O-spezifischen Polysaccharidkette
(das O-Antigen) und verleihen den Bakterien in wässriger Lösung ihre Oberflächenla-
dung [77].
3.2.1.1.2 Gram-positive Bakterien
Gram-positive Bakterien haben im Vergleich zu den Gram-negativen einen relativ ein-
fachen Zellwandaufbau (Abbildung 3.2b). Sie besitzen eine 20-80 nm dicke Murein-
schicht aus bis zu 40 Mureinlagen. In dieser sind verschiedene Lipoteichon- und Tei-
chonsäuren kovalent gebunden. Diese sind meist Polymere aus Ribitol- oder Glyce-
rolphosphaten (Abbildung 3.2a), geknüpft an Glycosyl oder D-Alaninesterresten und
stellen die Haupbestandteile der Zellwand dar. Sie ragen in die Umgebung und akti-
vieren z.B. das Komplementsystem oder Makrophagen. Daneben sind in der Zellwand
verschiedene Polysaccharide und Proteine zu finden. Letztere sind für die Adhärenz
und die Pathogenität verantwortlich [232].

3.2 Prokaryoten 33
(a) Strukturen der Glycerin- (b) Charakteristisch ist die Dicke der Mureinschicht, sowie die darin
und Ribitol-Teichonsäure, mo- kovalent gebundenen Lipoteichon- und Teichonsäuren [143].
difiziert nach [236].
Abbildung 3.2: Zellwandaufbau Gram-positiver Bakterien.
Am Beispiel von E. coli und S. aureus konnte z. B. gezeigt werden, dass die Lipopolysac-
charid-Schicht Gram-negativer Bakterien (E. coli) bei gleicher Elektrolytumgebung im
Vergleich zur Peptidoglycan-Schicht Gram-positiver Bakterien (S. aureus) zu einer ne-
gativeren Oberflächenladung führt [151].
3.2.1.2 Stoffwechsel aerober und anaerober Bakterien
Die Lebensweisen von Bakterien sind vielfältig und ihre Klassifizierung erfolgt häufig
aufgrund ihrer unterschiedlichen Milieubedingungen wie z. B. der Wasseraktivität, der
Nährstoffe, des pH-Wertes, der Temperatur und der Sauerstofftoleranz. Letztere defi-
niert den Stoffwechseltypus, womit eine Unterscheidung zwischen Aerobiern und An-
aerobiern ermöglicht wird. Der Gesamtstoffwechsel der Bakterien gliedert sich in die
beiden Bereiche Katabolismus, der Energiegewinnung, und den Anabolismus, in dem
aus einfachen Vorstufen biologische Makromoleküle unter Energieverbrauch syntheti-
siert werden. Für den Aufbau der Zellsubstanz sind unter anderem Kohlenstoff, Sauer-
stoff, Stickstoff, Wasserstoff, Phosphor, Schwefel, Kalium, Calcium, Magnesium, Eisen
notwendig. Je Bakterium können dabei unterschiedliche Quellen verwendet werden.
Die katabolen Reaktionen und damit die Verarbeitung organischer Nährsubstrate zur
Herstellung der Grundbausteine für die Synthese der Zellsubstanz erfolgt über eine
vielfältige Reihe enzymatischer Prozesse. Glucose stellt eine der wichtigsten C-Quellen
der katabolen Reaktionen dar [237]. Aerobe Bakterien benötigen für die Oxidation des

34 3. Theoretische Grundlagen
Zuckers Sauerstoff, weisen eine hohe Energieausbeute auf und oxidieren das organi-
sche Substrat vollständig zu CO2 und H2O. Für anaerobe Bakterien hingegen kann der
Sauerstoff toxisch sein. Sie spalten den Zucker nur enzymatisch und haben dabei eine
sehr geringe Energieausbeute. Bei der Fermentation entstehen je nach Art der Spal-
tung Gärungsendprodukte wie Ethanol, Milchsäure, Essigsäure, Propionsäure, Amei-
sensäure, Bernsteinsäure.
3.2.2 Kolloidchemie
Das Wort Kolloid stammt aus dem Griechischen “κoλλα”=Leim, womit eine charakte-
ristische Eigenschaft der Kolloide, eine trübe, leimartige Beschaffenheit aufzuweisen,
beschrieben wird. Dem Vorschlag der “International Union of Pure and Applied Che-
mistry” (IUPAC) von 1971 folgend, werden Kolloide als Objekte definiert, bei denen
mindestens eine Dimension im Bereich von 1 nm bis 1000 nm liegt, womit Bakterien
eingeschlossen sind [128]. Aus dieser Dimension ergeben sich Eigenschaften, die das
Verhalten von Bakterien im Strahlengang, in flüssigem Medium oder im elektrischen
Feld, bestimmen. Die geringe Dimension führt z. B. zu einem sehr großen Verhält-
nis von Oberfläche zu Volumen, so dass die Oberflächeneigenschaften gegenüber den
Festkörpereigenschaften dominieren und damit chemisches Verhalten und Reaktio-
nen bestimmen [129]. Wie in den vorherigen Kapiteln beschrieben, besteht die Bak-
terienhülle größten Teils aus Aminosäuren, Zuckerderivaten und Glykolipiden, wel-
che aufgrund dissoziierbarer und reaktiver funktioneller Gruppen (-OH, -COOH, -
OPO3H, oder -SH) geladen sein können. In aquatischem Medium weisen diese Biokol-
loide meist eine negative Oberflächenladung auf. Zwei unterschiedliche Mechanismen
können zur Entstehung der Oberflächenladung beitragen:
• Ionisierung der Oberflächengruppen als Ergebnis der Protonierung oder Depro-
tonierung basischer oder azider Oberflächenmoleküle. Der Ionisierungsgrad der
Oberfläche ist vom pH-Wert des Mediums abhängig. Dementsprechend ist die
Ladung negativ für hohe pH-Werte und positiv für niedrige pH-Werte. Die Che-
mie der äußeren Zellwand Gram-positiver und -negativer Bakterien unterschei-
det sich. Es ist die überwiegend in den Zellwänden Gram-positiver Bakterien
auftretende Teichonsäure, die den Zellen eine negative Ladung bei pH-Werten
≥ 5 verleiht, während die Oberflächenladung Gram-negativer Bakterien durch
die Lipopolysaccharide der äußeren Membran bestimmt wird [77].
• Adsorption von Ionen aus der umgebenden Lösung [239].
Die elektrostatisch wirksamen Oberflächeneigenschaften von Biokolloiden lassen sich
durch ihr elektrophoretisches Verhalten in einem äußeren elektrischen Feld bestim-
men.

3.2 Prokaryoten 35
3.2.2.1 Zeta-Potenzial
Geladene kolloidale Partikel bilden in wässrigen Lösungen eine Solvathülle aus, in
welcher dipolare Wassermoleküle und Gegenionen nahe der geladenen Oberfläche
des Kolloids akkumulieren und eine elektrische Doppelschicht bilden [77]. Hier lagern
sich zunächst festgebundene Ionen an der Partikeloberfläche an (Helmholtz-Schicht),
gefolgt von weiteren Ionen, die zu einer lockeren, diffusen Schicht führen. Dadurch
erscheint das Partikel in großer Entfernung elektrisch neutral. Die elektrische Doppel-
schicht bildet die Grundlage aller elektrokinetischen Phänomene unter dem Einfluss
eines elektrischen Feldes [136,164,234]. Bewegt sich ein Partikel in flüssigem Medium,
bildet sich durch Reibungskräfte in der diffusen Schicht eine Scher-Ebene aus. An ihr
ist die Geschwindigkeit der umgebenden Flüssigkeit relativ zum Partikel null [193].
Durch die Aufspaltung der diffusen Schicht in einen bewegten und einen unbewegten
Teil, erscheint das Partikel nicht mehr elektrisch neutral, sondern besitzt wieder ein Po-
tenzial, welches als Zeta-Potenzial ζ an der Scher-Ebene wie folgt definiert wird [129].
q
ζ =
(3.1)
4 · π · ε · a
q : Ladung des Teilchens
ε : Dielektrizitätskonstante
a : Teilchenradius r plus bewegter elektrischer Doppelschicht
Das Zeta-Potenzial ist damit abhängig von den Oberflächeneigenschaften der Teilchen,
die z. B. vom pH und der Konzentration der Elektrolyten beeinflusst werden [129].
Die Theorie der elektrischen Doppelschicht nach Gouy, Chapman, Debye und Hückel,
welche später nach Stern modifiziert wurde, ist in Abbildung 3.3 veranschaulicht [88].
Nach diesem Modell fällt das Potenzial im Bereich der Helmholtz-Schicht linear, in
der diffusen Schicht exponentiell. Die Debye-Länge ( 1)
definiert dabei die charakteri-
κ
stische Länge, auf welcher das Potenzial des elektrischen Feldes auf des 1
-fache abge-
e
fallen ist. Sie wird häufig auch als Dicke der Doppelschicht bezeichnet und ist durch
folgende Gleichung definiert [88]:
1
κ =
1
� 1000e 2 NA
ekT
� z 2 i ci
e : Elementarladung
NA : Avogadrokonstante
k : Boltzmann-Konstante
T : absolute Temperatur in Kelvin
zi : Ladungszahl des Ions
ci : Konzentration des Ions
(3.2)

36 3. Theoretische Grundlagen
Diffuse
Schicht
Helmholtz-
Schicht
Gouy-Ebene
Scher-Ebene
Bulk-
Lösung
Stern-Ebene
+
Partikeloberfläche
+
-
+
-
-
+
-
+ - + +
-
+ - + + -
-
++ +
+
-
+
- -
+
- -
- +
- - --
-
+ - + -
+ + +
+
+
-
+ +
-
- - - -
-
++ +++
+
+ +
+
+ +
+
+
+++
+ +
+ +
+
+
+
-
+
+
1/κ: Debye-Länge,
Dicke der Doppelschicht
ς: Zeta-Potenzial Potenzial
Stern-Ebene: Abgrenzung zur
diffusen Schicht
Gouy-Ebene: Definiert 1/κ ς
1/κ
Abstand von der
Partikeloberfläche
Abbildung 3.3: Modell der elektrischen Doppelschicht, modifiziert nach [88].
Mit der Ionenstärke I = 1 � 2 z 2 i ci ist folglich die reziproke Debye-Länge κ direkt proportional
zu √ I. Die Eigenschaften und die Dicke der elektrischen Doppelschicht
sind von großer Bedeutung, denn die Überlappung ihrer diffusen Schichten bestim-
men die Interaktionen zwischen geladenen Partikeln. Leider ist es nicht möglich das
Stern-Potenzial direkt zu messen, so dass das Zeta-Potenzial, welches experimentell
bestimmt werden kann, häufig als Maß für das Oberflächenpotenzial verwendet wird.
3.2.2.2 Elektrophoretische Mobilität
Die elektrophoretische Mobilität µ der geladenen kolloidalen Partikel, d. h. die Parti-
kelgeschwindigkeit pro angelegter elektrischer Feldstärke, ist proportional zum Zeta-
Potenzial ζ des Partikels. Außerdem wird die Mobilität noch von einer Reihe weiterer
Faktoren wie der Oberflächenladungsdichte, des pH-Wertes, der Elektrolytkonzentra-
tion (Ionenstärke), der Dielektrizitätskonstante des Mediums und seiner Viskosität, der
Temperatur und der Partikelgeometrie und -größe beeinflusst [234]. Dadurch trägt die
Dicke der Doppelschicht auch zur Mobilität kolloidaler Partikel bei. Die einfachste ma-
thematische Beschreibung der elektrophoretischen Mobilität kolloidaler Partikel stellt
die Theorie von Smoluchowski dar [275]:
µ = εrε0
ζ (3.3)
η

3.2 Prokaryoten 37
εr : Dielektrizitätskonstante des Mediums
ε0 : Dielektrizitätskonstante des Vakuums
η : Viskosität der Elektrolytlösung
ζ : Zeta-Potenzial
Diese Formel beschreibt die Mobilität großer Kolloide ohne Berücksichtigung der
Form, solange die Dimension des Partikels sehr viel größer als die Debye-Länge ist.
Dadurch kann die Partikeloberfläche lokal als planar angenommen werden. Für eine
Kugel mit Radius r ergibt sich somit die Bedingung: κr ≫ 1 [193]. Die physikalischen
Zusammenhänge sind hier idealisiert und basieren auf den folgenden Vereinfachun-
gen [9, 133]:
1. Das Partikel ist kugelförmig, starr und nicht leitend.
2. Die umgebende Flüssigkeit geht keine Wechselwirkungen ein.
3. Das Zeta-Potenzial ist über die gesamte Partikeloberfläche gleich.
Diese Forderungen haben zur Folge, dass die elektrischen Ladungen bei einem nicht-
leitenden, starren Partikel auf der Oberfläche lokalisiert sein müssen. Es wird an-
genommen, dass entweder das Potenzial oder die Ladungsdichte auf der Ober-
fläche der Partikel unverändert bleibt. Für eine Zelle werden diese Smoluchowski-
Forderungen jedoch unrealistisch, da die Zellmembran mit ihren dissoziierbaren funk-
tionellen Gruppen ein “dynamisches System” darstellt. Auf diese Weise wird zum
einen die Oberflächenladung durch den Dissoziationsgrad funktioneller Gruppen re-
guliert [61–64, 118, 187], zum anderen ist die Oberfläche einer Zelle für Elektrolyte oft
durchdringbar. Jedoch wird über diese Tatsachen oft hinweg gesehen, um eine ein-
fachere mathematische Behandlung zu ermöglichen [282]. Aus diesem Grund soll an
dieser Stelle auf die mathematischen Formulierungen der Modelle polymerbeschich-
teter Partikel [81, 193, 194, 241] verzichtet werden.
3.2.2.3 Stabilität
Stabile Kolloide ändern während einer Beobachtungsphase den Dispersionsgrad nicht.
Dagegen neigen instabile kolloidale Lösungen zum Agglomerieren und beginnen ab
einer kritischen Kolloidgröße zu sedimentieren. Ursache sind die relativ großen Ober-
flächen dispergierter Kolloide mit einer hohen Oberflächenenergie. Durch Agglome-
ration wird die Oberflächenenergie herabgesetzt und ein thermodynamisch stabilerer
Zustand erreicht [128, 257]. Zur Kolloidstabilität kommen zwei grundlegend verschie-
dene Mechanismen in Betracht [111, 128]:

38 3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.4: Stabilität kolloidaler Lösungen in Abhängigkeit von der Oberflächenladung (A) und der
Ionenstärke (B), modifiziert nach [128].
• Sterische Stabilisierung:
Die Adsorption von Polymeren an die Kolloidoberfläche führt zu einer absto-
ßenden Wechselwirkung, da ein Kolloid-Kolloid-Kontakt die Polymerschichten
komprimieren müsste.
• Elektrostatische Stabilisierung:
Wie in Abbildung 3.4 dargestellt, führen eine hohe Oberflächenladung und ei-
ne geringe Ionenstärke zu einem flachen Abfall des Potenzials in der diffusen
Doppelschicht und somit zu stabilen kolloidalen Lösungen, während niedrige
Oberflächenladungen und hohe Ionenstärken den Potenzialabfall beschleunigen
und folglich eine geringe oder vollständig fehlende Energiebarriere verursachen.
3.2.2.4 Wechselwirkung zwischen Licht und Materie
Lichtschwächung beim Durchgang durch Materie findet ihre Ursache in elastischen
und inelastischen Streuprozessen. Als Lichtstreuung bezeichnet man die Wechselwir-
kung von Photonen an einem Ensemble von Atomen, Molekülen, Kolloiden, Staubpar-
tikeln, Kristalliten etc. Durch Reflexion, Brechung, Beugung und Absorption ändert

3.2 Prokaryoten 39
sich meist die Intensität, Polarisation und Richtung des einfallenden Lichtstrahles.
Während bei elastischer Streuung kein Energietransfer zwischen Lichtquanten und
streuender Materie stattfindet und somit nur eine Impulsänderung der einfallenden
Strahlung auftritt, wird bei der inelastischen Streuung zunächst Energie vom beteilig-
ten Molekül absorbiert und darauffolgend in Form eines Lichtquantes anderer Energie
wieder abgestrahlt. Für die elastische Streuung existieren im Falle der Einzelstreuung
(hier streuen die Teilchen unabhängig von einander unter der Voraussetzung, dass der
mittlere Teilchenabstand mindestens dem doppelten Durchmesser der Teilchen ent-
spricht) zwei strenge Theorien [202]:
• Rayleigh-Streuung: bei Streuung an Molekülen, die klein sind gegen die Wel-
lenlänge λ: d. h. 2πr/λ < 0.1 [148].
• Mie-Streuung: bei Streuung an isotropen, kugelförmigen Teilchen beliebiger
Größe unter der Bedingung: 2πr/λ ≥ 10) [148, 177, 270],
wobei r der Teilchenradius ist. Tritt Licht durch eine kolloidale mikrobielle Lösung, so
ist die Mie-Streuung der zur Lichtabschwächung führende dominierende Prozess. Ab-
sorptionsprozesse aufgrund von Oberflächenmolekülen können vernachlässigt wer-
den [23]. Die gesamte Lichtschwächung beim Durchgang durch eine Probe wird als
Extinktion E, oder als optische Dichte (OD) bezeichnet und ist über den Anteil der
transmittierten Lichtmenge T definiert.
E(λ) = OD(λ) = −logT(λ) = −log I
T : transmittierte Lichtmenge
I : Intensität des austretenden Lichtes
I0 : Intensität des eingestrahlten Lichtes
I0
(3.4)
Unter der Annahme, dass die Lichtschwächung ausschließlich durch elastische Streu-
ung verursacht wird, verringert sich die Lichtintensität I0 beim Durchgang durch
eine Probe der Konzentration c und der Schichtdicke x, in Analogie zum Lambert-
Beerschen Gesetz exponentiell (Abschnitt 3.3.1):
I = I0e −sncx
sn : natürlicher Streukoeffizient
c : Zelldichte
x : Schichtdicke (Länge des Lichtweges durch die Suspension)
(3.5)

40 3. Theoretische Grundlagen
3.2.2.5 Praktische Anwendung: Turbidimetrie
Aufgrund von Streuprozessen erscheint eine Bakteriensuspension bereits ab einer
Konzentration von 10 7 Zellen/ml mit dem Auge wahrnehmbar trübe. Im Labor wer-
den für Trübungsmessungen, die häufig zur Bestimmung der Zellkonzentration und
-masse dienen, meist die primär für die Absorptionsphotometrie konstruierten Pho-
tometer verwendet. Bei der Messung müssen folgende Einflussfaktoren beachtet wer-
den, um mögliche Fehlerquellen auszuschließen [23]:
• Wellenlänge:
Die gestreute Strahlungsleistung (
Ist, Streuintensität
I0, Intensität des einfallenden Lichtes
) zeigt im Falle der
Rayleigh-Streuung bezüglich der Wellenlänge λ eine λ −4 -Abhängigkeit. Mit zu-
nehmender Partikelgröße wird der Exponent der λ-Abhängigkeit größer, bis die
Streustrahlung von λ unabhängig wird. Bei kugelförmigen Bakterien oder kurz-
en Stäbchen verhält sich die gestreute Strahlungsleistung proportional zu λ −2 bei
langen, dünnen, zufällig orientierten Stäbchen dagegen zu λ −3 [23, 147]. Deswei-
teren nimmt der Streuwinkel mit größer werdender Wellenlänge zu. Insgesamt
besitzt die Auswahl der Wellenlänge und die spektrale Reinheit der Messstrah-
lung jedoch bei der Trübungsmessung im Vergleich zur Absorptionsmessung ei-
ne geringere Bedeutung.
• Ausrichtung der Zellen in der Küvette:
Wird durch Schütteln oder Rühren eine Strömung in der Küvette erzeugt, so rich-
ten sich stäbchenförmige Zellen aufgrund der inneren Reibung vertikal aus, wo-
durch es zu einer optischen Anisotropie und Zunahme der Extinktion kommt.
• Zelldichte:
Überschreitet die Extinktion einer Zellsuspension einen Wert von 0.5, dann
weicht mit zunehmender Zelldichte die gemessene Extinktion mehr und mehr
von dem nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz zu erwartenden Wert ab. Die Ex-
tinktion fällt in diesem Fall zu gering aus. Ursache ist die durch die Mie-Theorie
begründete antisymmetrische Winkelverteilung der Streuintensität mit bevor-
zugter Vorwärtsstreuung, wodurch neben der geschwächten Primärstrahlung
auch ein Teil des Streulichtes in den Detektor fällt. Ferner gilt für das Verhältnis
zwischen Konzentration und Extinktion die in der Absorptionsphotometrie be-
obachtete Abweichung von der Linearität bei OD-Werten

3.3 Optische Spektroskopie an Molekülen 41
bildung nicht gegeben ist, liefert die Trübungsmessung lediglich einen Orientie-
rungswert.
Eine praktische Anwendung findet die Turbidimetrie in der Mikrobiologie zur Bestim-
mung von Wachstumskurven, welche den zeitlichen Verlauf der Zellproliferation be-
schreiben (Abbildung 3.5). Dabei passt sich der Zellstoffwechsel zunächst in der An-
laufphase an die Nährstoffbedingungen an und die Zellen nehmen lediglich in ihrer
Masse, nicht jedoch in ihrer Anzahl zu [143]. Über die Beschleunigungsphase beginnt
darauffolgend die Zellvermehrung exponentiell und endet nach mehreren Stunden in
der stationären Phase. In dieser Phase, die mehrere Stunden bzw. Tage andauern kann,
sind die Zellen noch vollständig lebensfähig, haben aber ihren Stoffwechsel und ih-
re Replikation eingestellt. Letztendlich mündet die Wachstumskurve in der Absterbe-
phase, durch allmähliches Lysieren der Zellen. Neben der vollständigen Beschreibung
einer Zellkultur kann die Turbidimetrie natürlich auch zur Abschätzung der Zellzahl
einer Zellsuspension herangezogen werden.
3.3 Optische Spektroskopie an Molekülen
Abbildung 3.5: Typische
OD-Wachstumskurve von
Bakterien.
Die Grundlage der optischen Spektroskopie an Molekülen bildet in der Regel die in-
elastische Streuung von Licht am beteiligten Molekül. Dabei wird zunächst ein Licht-
quant einer bestimmten Energie vom Molekül durch Anregung des Elektronensystems
absorbiert und darauffolgend entweder ein Lichtquant kleinerer Energie wieder emit-
tiert oder der angeregte Zustand strahlungslos deaktiviert. Damit Licht mit Molekülen
in Wechselwirkung treten kann, müssen folgende Voraussetzungen erfüllt sein [155]:
• Resonanzbedingung: die Energie (hν) des absorbierten Photons muss genau der
Energiedifferenz ∆E zwischen Grund- und angeregtem Zustand des beteiligten
Elektrons entsprechen.

42 3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.6: Jablonski-
Termschema ohne Berücksichtigung
der Rotationsenergieniveaus:
F: Fluoreszenz, P:
Phosphoreszenz, IC: Internal
Conversion, ISC: Intersystem
Crossing, VR: Schwingungsrelaxation,
Sx: Singulettzustände,
Tx: Triplettzustände, modifiziert
nach [198].
• Die Übergangswahrscheinlichkeit muss ungleich null sein, d. h. es darf sich nicht
um einen verbotenen Übergang handeln.
Die möglichen Elektronenübergänge in einem Molekül werden im sogenannten
Jablonski-Termschema (Abbildung 3.6) veranschaulicht, wodurch die beteiligten Pro-
zesse Absorption und Emission näher beschrieben werden können. Zur Vereinfachung
wurden keine Rotationsenergieniveaus eingezeichnet.
Wird vom Molekül ein Lichtquant absorbiert, so führt die Anregung meist in den
ersten elektronisch angeregten Singulettzustand S1. Die Anregung des Moleküls in
höhere elektronische Singulettzustände (S2, S3) findet zum einen selten statt, zum an-
deren haben diese Zustände eine sehr kurze Lebensdauer und gehen innerhalb von
10 −12 s strahlungslos (Internal Conversion, IC) durch Wechselwirkung mit benach-
barten Lösungsmittelmolekülen und Abgabe von Schwingungsenergie in den ersten
elektronisch angeregten Singulettzustand S1 über.
Im Gegensatz zu Atomen zeigen Moleküle jedoch keine definierten Absorptionslinien,
sondern Absorptionsbanden, die bis zu 100 nm betragen können. Die Ursache liegt in
den zahlreichen Freiheitsgraden des Moleküls, wodurch jedem elektronisch angereg-
ten Zustand 30-50 Schwingungs- und Rotationszustände überlagert sind.
Befindet sich ein Molekül im ersten elektronisch angeregten Zustand S1, so gibt es ver-
schiedene Möglichkeiten, den Grundzustand S0 wieder zu erreichen, d. h. zu relaxie-
ren:
• S1 → S0 + Wärme (Internal Conversion):
Diese Art der strahlungslosen Inaktivierung ist der häufigste Relaxationsprozess.
Hier wird die überschüssige Energie über Wechselwirkungen mit der Umgebung
in Form von Wärme abgegeben.
• S1 → S0 + hν (Fluoreszenz):
Innerhalb von Nanosekunden geht der angeregte S1-Singulettzustand unter

3.3 Optische Spektroskopie an Molekülen 43
Emission eines Photons in ein Rotations-Schwingungs-Niveau des Grundzustan-
des S0 über. Dadurch kann die Energie der emittierten Strahlung höchstens gleich
der absorbierten Energie hν sein.
• Eine weitere Möglichkeit zur Relaxation ist der strahlungslose Übergang in einen
Triplettzustand (Intersystem Crossing, ISC). Wegen der fehlenden Paarungsener-
gie der parallel stehenden Spins liegt dieser Zustand energetisch tiefer. Aufgrund
der Änderung der Spinmultiplizität ist dieser Übergang formell verboten. Von
hier aus relaxieren die Elektronen unter erneuter Spin-Umkehr in den Grundzu-
stand S0 entweder
1. strahlungslos und unter Erzeugung von Wärme (Internal Conversion):
T1 → S0 + Wärme oder
2. unter Aussendung eines Lichtquantes (Phosphoreszenz):
T1 → S0 + hν
3.3.1 Absorption
Das Maß der Lichtabsorption eines Moleküls wird durch den Absorptionskoeffizienten
α(λ) im Lambert-Beerschen-Gesetz beschrieben:
I = I0e −α(λ)cx
I : Intensität des austretenden Lichtes
I0 : Intensität des eintretenden Lichtes
c : Konzentration
α(λ) : Absorptionskoeffizient
x : Länge des Absorptionspfades
(3.6)
Dieser ist der Proportionalitätsfaktor zwischen der Schwächung dI eines Lichtstrahles
und dem Produkt aus der nach Durchtritt durch die Probe noch vorhandenen Inten-
sität I, der Probenkonzentration c und der durchlaufenden Schichtdicke dx:
−dI = α(λ) · I · c · dx (3.7)
Dieser als Bouguer-Lambert-Gesetz bekannte Zusammenhang gilt jedoch nur für mo-
nochromatisches, kollimiertes Licht und verdünnte Lösungen [238]. Ist der Absorpti-
onskoeffizient bekannt, kann durch Messung der Extinktion (E = −log I
I0 ) die Probenkonzentration
c bestimmt werden. In der Praxis wird die Konzentrationsbestimmung

44 3. Theoretische Grundlagen
mit Hilfe einer Kalibriergerade durchgeführt. Hierzu misst man die Absorption meh-
rerer Lösungen unterschiedlicher, aber bekannter Konzentrationen, die den interessie-
renden Messbereich abdecken. Aufgetragen in einem Diagramm wird durch die Mess-
punkte nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate eine Ausgleichsgerade gelegt.
Diese weist jedoch sowohl im sehr kleinen (0.1-0.2) als auch im sehr großen (> 0.8)
Extinktionsbereich Abweichungen vom Lambert-Beerschen-Gesetz auf. Die Ursachen
hierfür liegen zum einen in der Erfassungsgrenze und Empfindlichkeit des Detektors
und zum anderen, vor allem bei höherer Konzentration, in der zunehmenden Fehl-
strahlung durch Streulicht [230].
3.3.2 Fluoreszenz
Wird das Elektronensystem eines Moleküls durch Lichtabsorption angeregt, gibt es
neben der Fluoreszenzemission verschiedene Möglichkeiten in den Grundzustand zu
relaxieren (Abbildung 3.6). D. h. nicht jedes absorbierte Photon wird in Form eines
Photons wieder emittiert. Das Verhältnis der Anzahl der von einem Molekül emit-
tierten Nem- zu absorbierten Nabs-Photonen beschreibt das Maß der Fluoreszenz und
definiert die Quantenausbeute Q:
Q = Nem
Nabs
(3.8)
Die gesamte, vom Detektor erfasste Intensität Iλ des Fluoreszenzlichtes kann durch
folgende Beziehung beschrieben werden:
Iλ ∼ α(λ) · I0 · Q · K (3.9)
und ist damit proportional zu:
• α(λ) (Absorptionskoeffizient)
• I0 (Intensität des Anregungslichtes)
• Q (Fluoreszenzquantenausbeute)
• K (Gerätekonstante)
3.3.3 Fluoreszenzlöschung (”Quenching”)
Wechselwirkungen zwischen dem angeregten Molekül und der Umgebung können
das Maß der Fluoreszenz negativ beeinflussen. Eine dadurch bedingte Verringerung
der Quantenausbeute bezeichnet man als Fluoreszenzlöschung bzw. “Quenching”.
Diese Löschprozesse beruhen entweder auf Energietransfer, Stoßlöschung oder che-
mischen Reaktionen:

3.4 Kapillarelektrophorese 45
• Energietransfer:
Hier wird die Anregungsenergie eines angeregten Moleküls (Donor) durch
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf ein Akzeptor-Molekül (Quench-Molekül)
aus der räumlichen Umgebung übertragen, d. h. der Prozess erfordert keinen
direkten Kontakt der beiden Partner. Das Quench-Molekül befindet sich im Ver-
gleich zum Donor-Molekül in einem vergleichbaren oder niedrigeren Energiezu-
stand und sein Absorptionsspektrum überlappt mit dem Fluoreszenzspektrum
des Donors [97, 256].
• Stoßlöschung:
Durch einen Stoßprozess kann die Anregungsenergie des einen Stoßpartners ab-
gegeben werden, so dass sich beide Moleküle im elektronischen Grundzustand
befinden, jedoch Unterschiede in ihrer Schwingungs- und Rotationsenergie auf-
weisen.
• Chemische Reaktion:
Komplexbildung, Redoxreaktionen oder Säure-Base-Reaktionen können eben-
falls eine strahlungslose Deaktivierung des Anregungszustandes bewirken.
Die treibende Kraft für diese Reaktionen sind drastische Änderungen der
Redoxpotenziale und pka-Werte des Fluorophors bei Anregung in den S1-
Singulettzustand.
3.4 Kapillarelektrophorese
3.4.1 Apparatur
Die Kapillarelektrophorese (capillary electrophoresis, CE) ist eine elektrophoretische
Trenntechnik, bei der kleine geladene Moleküle und Biokolloide wie DNA, Proteine
oder Mikroorganismen unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes getrennt werden
können. Die Trennung erfolgt aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwin-
digkeit und -richtung der Teilchen in mit Puffer gefüllten Quarzkapillaren (amorphes
SiO2) [87]. Diese sind außen mit Polyimid beschichtet, um das Brechen der Kapillare
zu verhindern. Die Kapillaren sind üblicherweise 10 bis 100 cm lang und haben einen
Innendurchmesser von 25 bis 100 µm. Darin liegt der entscheidende Vorteil gegenüber
der klassischen Gelelektrophorese: Die große Oberfläche der englumigen Kapillaren
bezogen auf das Puffervolumen erlaubt einen schnellen Abtransport der Jouleschen
Wärme, so dass relativ hohe Spannungen (bis zu 35 KV) verwendet werden können,
d. h. hohe Analysengeschwindigkeiten möglich sind. In Abbildung 3.7 ist der schema-
tische Aufbau einer CE-Einheit dargestellt mit Kapillare, Spannungsquelle, Detektor,
Proben- und Puffergefäßen.

46 3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.7:
Schematischer Aufbau
einer CE-Apparatur.
3.4.1.1 Injektion
Zur Probeninjektion wird am aufgabeseitigen Ende der Kapillare das Gefäß mit Trenn-
elektrolyt gegen das Probengefäß getauscht. Das injizierte Probenvolumen liegt meist
zwischen 2 und 20 nl. Die Probenaufgabe kann anodisch oder kathodisch erfolgen.
Man unterscheidet die folgenden drei Injektionstechniken:
• Elektrokinetische Injektion durch elektrisches Feld:
Aufgrund einer kurzzeitig angelegten Spannung U zwischen den beiden Kapil-
larenden, wird in der Kapillare eine Flüssigkeitsströmung erzeugt, wodurch Pro-
benbestandteile in die Kapillare wandern.
• Hydrostatische Injektion durch Siphon-Effekt:
Eine Höhendifferenz ∆h zwischen den beiden Kapillarenden wird für eine kur-
ze Zeitspanne aufgebaut. Der daraus resultierende Fluss zieht die Probe in die
Kapillare.
• Hydrodynamische Injektion durch Druck bzw. Vakuum:
Eine kurzzeitig aufgebaute Druckdifferenz ∆p zwischen den beiden Kapillaren-
den ist für die Probenaufgabe verantwortlich. Für den Aufbau der Druckdiffe-
renz kann entweder der Druck beim Probengefäß erhöht werden oder am Kapil-
larende verringert werden.
Die hydrodynamische Injektion ist das am häufigsten angewandte Verfahren und wird
auch in dieser Arbeit eingesetzt. In der Regel werden Injektionszeiten zwischen 5 und
45 s verwendet.

3.4 Kapillarelektrophorese 47
3.4.1.2 ”Sample stacking”
Die Probenaufgabe ist aufgrund der kurzen Injektionszeiten in Bezug auf die Repro-
duzierbarkeit der Ergebnisse ein kritischer Faktor. Längere Injektionszeiten und damit
größere injizierte Probenvolumina führen jedoch durch Volumenüberladung in der
Kapillare sehr schnell zu Peakverzerrung und Auflösungsverlust. Man versucht so-
mit einerseits möglichst hohe Probenvolumina aufzugeben und andererseits die auf-
gegebene Probenzone zu “schärfen”, d. h. aufzukonzentrieren und damit Peakverzer-
rungen entgegenzuwirken. Letzteren Vorgang bezeichnet man als “sample stacking”.
Das häufigste angewandte Verfahren ist das “electro-stacking” [87]. Dieses Verfahren
nutzt Unterschiede in der Leitfähigkeit zwischen Trennpuffer und Probenlösung. Da-
bei versucht man die Probe aus einer rein wässrigen Lösung zu injizieren, d. h. aus
einer Lösung mit geringer Leitfähigkeit und hohem Widerstand. Nach der Injektion
wird die Probe somit zunächst bis zum Erreichen der Puffergrenzfläche in einer hohen
Feldstärke beschleunigt und wandert dann im Trennpuffer bei niedrigerer Feldstärke
weiter. Durch das Abbremsen der Proben beim Eintritt in den Pufferbereich werden
die Proben aufkonzentriert.
3.4.1.3 Detektor
In der Mehrzahl der Fälle erfolgt die Detektion der getrennten Teilchen über UV/VIS-
Absorptionsmessungen. Ein großer Nachteil ist jedoch die geringe Empfindlichkeit
der Methode. Da sich die Extinktion proportional zur Schichtdicke verhält (Abschnitt
3.3.1), die in diesem Fall nur einige µm beträgt, liegt die Detektionsgrenze norma-
lerweise bei 10 −8 M [179]. Mit einem Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektor (LIF-
Detektor) sind dagegen Nachweisgrenzen im Bereich einiger Yoktomol und Zeptomol
(10 −21 mol und 10 −24 mol) keine Seltenheit [16, 95].
3.4.1.4 Auflösung
Die Auflösung (resolution, Rs) ist ein Maß für die Qualität einer Trennung und je
besser die Trennung, um so zuverlässiger ist das Analysenergebnis [124, 162]. Ab ei-
ner Auflösung von 1.5 gelten zwei Peaks als basisliniengetrennt voneinander. In die
Auflösung fließen zwei Faktoren ein:
• Die Peak-zu-Peak-Trennung, d. h. die Selektivität. Hier wird der Abstand zweier
Peak-Maxima berechnet und
• Die Trennleistung, welche durch die Breite der Peaks bestimmt und als Anzahl
N der theoretischen Böden pro Meter berechnet wird. Je schmaler ein Peak desto
höher ist die Trennleistung.

48 3. Theoretische Grundlagen
Die Auflösung Rs und Anzahl N der theoretischen Böden werden nach folgenden Glei-
chungen berechnet:
Abbildung 3.8: Beiträge zur Auflösung, modifiziert
nach [77].
D. h. je größer die Peakbreite bei halber Höhe (W1/2) ist, desto niedriger ist der Wert für
N. Für eine hohe Auflösung müssen somit sowohl schmale Peaks als auch große Peak-
zu-Peak-Trennungen vorliegen. Während der Trennung kommt es häufig zur Disper-
sion des Analyten, wodurch Peakverbreiterungen verursacht werden. Diesem Effekt
kann jedoch durch “sample stacking” (Abschnitt 3.4.1.2) entgegengewirkt werden.
3.4.2 Trennprinzip
Die Trennung verschiedener Analyten im elektrischen Feld beruht auf ihrer un-
terschiedlichen elektrophoretischen Mobilität µelphor (Quotient aus Wanderungsge-
schwindigkeit und Feldstärke). Sie errechnet sich aus dem Kräftegleichgewicht zwi-
schen der Beschleunigungskraft Fel des elektrischen Feldes und der Reibungskraft Fr,
die durch das Stokesche Gesetz angenähert wird:
mit
Fel = q · E (3.10)
Fr = −k · µelphor · E = −6 · π · η · r · µelphor · E (3.11)
µelphor =
q
6 · π · η · r
q : effektive Ladung
∼ q
r
E : elektrische Feldstärke
k : Reibungskoeffizient
η : dynamische Viskosität
r : Stokescher Radius, der auch die Solvathülle beinhaltet
(3.12)
Die Zahl 6 gilt streng genommen nur für die Betrachtung sphärischer Partikel und ist
für kleine Ionen, deren Größe im Bereich von Lösungsmittelmolekülen liegt kleiner.

3.4 Kapillarelektrophorese 49
Die effektive Ladung ergibt sich aus der Ladung des Analyten abzüglich des Ladungs-
anteils der umgebenden entgegengesetzt geladenen Ionen, d. h. der Solvathülle bis
zur Scher-Ebene im Modell der starren Doppelschicht der Debye-Hückel-Theorie (Ab-
schnitt 3.2.2.1). Für die Trennung maßgeblich ist letztendlich das Verhältnis q/r.
3.4.3 Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Wie eingangs beschrieben bestehen die eingesetzten Kapillaren aus Quarz (fused sili-
ca). In wässriger Umgebung wird dessen Oberfläche durch Protolyse negativ aufgela-
den [278] und es kommt wie unter Abschnitt 3.2.2.1 für die Oberfläche von Kolloiden
in aquatischer Lösung beschrieben, zur Ausbildung einer elektrischen Doppelschicht
in der Kapillare (Abbildung 3.9).
Abbildung 3.9: Ausbildung
der elektrischen
Doppelschicht
in der Kapillare, modifiziert
nach [277].
Die gebildete elektrische Doppelschicht setzt sich aus der adsorbierten Helmholtz-
Schicht und der diffusen Debeye-Hückel-Schicht zusammen und besteht aus positi-
ven Gegenionen und Anionen. Das an der Grenzschicht ausgebildete ζ-Potenzial ist
verantwortlich für die Elektroosmose. Liegt parallel zur Oberfläche ein elektrisches
Feld an, werden die Kationen in der diffusen Schicht zur negativ geladenen Kathode
gezogen. Diese ziehen aufgrund ihrer Solvathülle die gesamte Pufferlösung mit sich
und verursachen auf diese Weise den elektroosmotischen Fluss (EOF). Dadurch wird
der elektrophoretischen Wanderung des Analyten zumeist ein mehr oder minder star-
ker EOF überlagert, der zwar aktiv zum Transport der Probenzone beiträgt, nicht aber
zu ihrer Trennung. Der EOF ist somit verantwortlich, dass bei anodischer Injektion
auch Anionen am Detektionsfenster “vorbeiwandern”. Die Geschwindigkeit des EOFs
bzw. dessen elektroosmotische Mobilität µelosm wird durch die Helmholtz-Gleichung
beschrieben
µelosm =
ε · ζ
4 · π · η
(3.13)

50 3. Theoretische Grundlagen
ε : Dielektrizitätskonstante
ζ : ζ-Potenzial
η : dynamische Viskosität
und kann experimentell aus der Migrationszeit eines Neutralmarkers bestimmt wer-
den.
3.4.4 Kapillarelektrophoretische Methoden
Die Vielseitigkeit der CE leitet sich vor allem von ihren zahlreichen Methoden ab,
deren Trennmechanismen auf unterschiedlichen physikalischen Grundsätzen beruhen
und dadurch die Gewinnung orthogonaler und komplementärer Informationen mög-
lich wird. Die bedeutendsten Methoden sind die Kapillarzonenelektrophorese (CZE),
die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC), die Kapillargelelektropho-
rese (CGE), die Kapillarelektrochromatographie (CEC), die Kapillar-Isoelektrische Fo-
kussierung (CIEF) und die Kapillarisotachophorese (CITP). Für diese Arbeit spielen
lediglich die Kapillarzonenelektrophorese und die Kapillargelektrophorese eine Rolle,
so dass nur für diese beiden Methoden eine nähere Ausführung folgt:
3.4.4.1 Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Die CZE wird ausschließlich mit Trennpuffer gefüllten Kapillaren durchgeführt und
gilt als das am häufigsten angewandte Verfahren. Die Trennung beruht ausschließlich
auf Mobilitätsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Ladung und Reibungskoeffizi-
enten [87].
3.4.4.2 Kapillargelelektrophorese (CGE)
Die CGE wird hauptsächlich zur Analyse von Makromolekülen wie DNA/RNA und
Biokolloiden angewandt, welche häufig über ähnliche oder gar gleiche Oberfläche-zu-
Ladungsverhältnisse verfügen. Die Trennung dieser effektiv gleich geladenen Analy-
ten erfolgt in mit Polymerlösung oder Gel (Trennmatrix) gefüllten Kapillaren aufgrund
ihrer unterschiedlichen Molekül- bzw. Partikelgröße. Die Gelmatrix besteht hauptsäch-
lich aus Acrylamid, Agarose und Cellulose. Ihr eingesetzter Konzentrationsbereich
liegt zwischen 0.05 bis 15 %. Im Idealfall ist der EOF bei dieser Technik vollständig
unterdrückt und hat keinen Einfluss auf die Mobilität.
3.4.5 Eigenschaften von “fused silica” Oberflächen
Bilden sich ausreichend große ζ-Potenziale auf der Quarzoberfläche der Kapillare aus,
besitzt die Kapillarwand Eigenschaften eines Kationenaustauschers mit etwa einer

3.4 Kapillarelektrophorese 51
Bindungsstelle für Kationen pro nm 2 [83]. Die daraus resultierenden elektrostatischen
Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Analyten und den negativen Silanol-
gruppen der Kapillarwand können die Mobilität und damit die Trennleistung und die
Reproduzierbarkeit negativ beeinflussen [127]. Die Wechselwirkungen können vor al-
lem bei positiv geladenen Proteinen und Zellbestandteilen sehr stark ausgeprägt sein.
Für gut reproduzierbare Ergebnisse sollten diese Adsorptionserscheinungen möglichst
unterdrückt oder gänzlich unterbunden werden.
Die Größe des ζ-Potenzials bestimmt auch die Geschwindigkeit des EOF. Zwar trägt
der EOF nicht zur Trennung der Analyten bei, doch kann eine Erhöhung des EOF z. B.
zu einer schnelleren Trennung führen. Andererseits kann bei der Trennung von Ana-
lyten mit ähnlichen elektrophoretischen Mobilitäten auch die Reduktion des EOF hilf-
reich sein, um den elektrophoretischen Beitrag zu erhöhen und den Analyten mehr
“Zeit” zur Trennung untereinander und zur Abtrennung vom EOF einzuräumen [15].
Sowohl die Kontrolle der unerwünschten Interaktionen zwischen Analyt und Kapil-
larwand und als auch die Kontrolle des EOF basieren auf der Verminderung des Ober-
flächenpotenzials auf der Kapillarinnenseite und damit der Reduktion der Reichweite
der Coulomb-Kräfte zwischen Kapillarwand und Analyt [255]. Dazu können zwei un-
terschiedliche Techniken angewandt werden:
1. Die direkte Beeinflussung der ionischen Interaktionen durch:
oder
• Erhöhung der Ionenstärke im Trennpuffer durch Zugabe von Konkurrenz-
ionen in Form von Salzen oder
• Protonierung der Silanol-Gruppen durch extrem saure pH-Bedingungen
2. Kapillarwandmodifikationen durch
• kovalente oder
• dynamische Beschichtung
Im Rahmen dieser Arbeit wird mit Kapillarwandmodifikationen gearbeitet, weshalb
nachfolgend die Technik der Beschichtung insbesondere der dynamischen Beschich-
tung näher beschrieben wird.
3.4.6 Wandbeschichtung (”Coating”)
3.4.6.1 Permanente Beschichtung
Bei der permanenten Wandbeschichtung werden die Silanol-Gruppen der Kapillarin-
nenwand kovalent an Modifikatoren gebunden, wodurch der EOF und die Probe-

52 3. Theoretische Grundlagen
Wand-Wechselwirkung effektiv unterdrückt werden. Die zur Beschichtung am häufig-
sten eingesetzten Materialien sind Polyacrylamid [67], Kohlenhydrate [46] und Poly-
ethylenglykole [218]. Die Stabilität der Beschichtung hängt stark von der Vorbehand-
lung ab. Durch ausgiebige Konditionierung wird dazu die Kapillare zunächst gerei-
nigt. Das bedeutendste Beschichtungsverfahren ist die Organosilanylisation [67, 127].
Hier werden über ein reaktives, bifunktionales Silan die Polymere an die Kapillar-
wand gebunden. Während die Silan-Gruppe mit der Silanol-Gruppe reagiert, bindet
die zweite funktionelle Gruppe die Monomere der späteren Beschichtung. Auf der Ka-
pillaroberfläche kommt es im Anschluss zur Polymerisation und Verankerung der Po-
lymerschicht.
3.4.6.2 Dynamische Beschichtung
Auch durch dynamische Beschichtungsmethoden, bei denen dem Trennpuffer Additi-
va zugesetzt werden, die sich durch Coulomb-Kräfte und/oder Wasserstoffbrücken-
bindungen beim Einspülen der Kapillare an die Glasoberfläche binden, lassen sich
die Silanol-Gruppen abschirmen. Aufgrund der schwachen Wechselwirkungskräfte
ermöglicht der Einsatz geeigneter Spülschritte zwischen den Trennungen das vollstän-
dige Ablösen der Beschichtung und seine neue Rekonstruktion im nächste Schritt. Als
Additiva können sowohl niedermolekulare Substanzen wie Mono-, Di-, Oligoamine,
Sulfonsäureamine und Tenside als auch Polymere wie Alkylcellulose, Polyvinylalko-
hol, Polyethylenglykol, Dextran und Polyacrylamid eingesetzt werden [220, 273, 274].
Wichtig für die richtige Auswahl hochmolekularer Modifikatoren ist ein ausgewoge-
nes Verhältnis zwischen hydrophilen und lipophilen funktionellen Gruppen. Ist der
Anteil hydrophiler Gruppen zu hoch, kann die Beschichtung partiell durch Wasser-
moleküle von der Quarzoberfläche verdrängt werden. Hingegen besteht bei zu hydro-
phoben Additiva die Gefahr von Adsorptionen zwischen Proteinen oder Biokolloiden
und den Polymeren durch van-der-Waal-Kräfte. Im Extremfall können die hydropho-
ben funktionellen Gruppen auch zu großen Oberflächenspannungen zwischen Puffer
und Beschichtung führen, wodurch die Beschichtung instabil wird [71]. Je nach Po-
lymer und dessen funktioneller Gruppen kann die Beschichtung geladen, ungeladen,
polar oder unpolar sein.

3.5 Magnetische Kernresonanz 53
3.5 Magnetische Kernresonanz
3.5.1 Messprinzip
Die Grundlage der magnetischen Kernresonanz (nuclear magnetic resonance, NMR)
bildet die Quantenmechanik des Kernspins � In, einer Eigenschaft von Nukleonen und
seine charakterisierende Kernspinquantenzahl In, die bei Protonen und Neutronen 1/2
beträgt. Atomkerne, deren Gesamtspin � I ungleich Null ist, besitzen ein magnetisches
Moment �µ, wobei im Feld-freien Raum 2I+1 energetisch äquivalente Spinzustände exi-
stieren. Als Konsequenz aus dem Wigner-Eckart-Theorem ist das magnetische Mo-
ment kollinear zum Spinvektor und durch folgende Gleichung definiert:
�µ = γ � I (3.14)
Das gyromagnetische Verhältnis γ ist für jeden Atomkern charakteristisch und beträgt
für 1 H 2.68·10 8 rad/Ts. Sein Zahlenwert bestimmt unter anderem die Empfindlichkeit
eines Atomkernes. In Gegenwart eines externen magnetischen Feldes � B0 wird die ener-
getische Entartung der Spinzustände durch den Zeeman-Effekt aufgehoben:
E = −�µ � B0
(3.15)
Da in einem NMR-Spektrometer durch Konvention das � B0-Feld entlang der z-Achse
ausgerichtet ist, reduziert sich die Gleichung auf:
Em = −γIzB0 = −m�γB0
(3.16)
wobei m die magnetische Quantenzahl ist, und gemäß der Anzahl der Spinzustände
2I+1 mögliche Werte annehmen kann. Die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Spin ein
Energieniveau besetzt, wird durch die Boltzmann-Verteilung bestimmt.
In Analogie zur optischen Spektroskopie können Übergänge zwischen den Zeeman-
Niveaus durch Einstrahlung eines senkrecht zu � B0 ausgerichteten, hochfrequenten,
elektromagnetischen Wechselfeldes (HF-Feld) stimuliert werden. Die Auswahlregel
für magnetische Dipolübergänge ist ∆m=±1, so dass die Photonenenergie die folgen-
de Resonanzbedingung erfüllen muss:
|∆E| = γB0� = ω0� (3.17)
Die Resonanzfrequenz ω0 = γB0 wird Larmorfrequenz genannt und entspricht be-
tragsmäßig der Präzessionsfrequenz des magnetischen Momentes um die statische � B0-
Achse (z-Achse). Sie ist charakteristisch für eine bestimmte Atomsorte. Doch können
sich auch Atomkerne einer Sorte in ihrer Larmorfrequenz unterscheiden, wenn sie Teil
eines Moleküls sind und damit unterschiedliche chemische Umgebungen wahrneh-
men. Aufgrund der teilweisen Abschirmung des äußeren Magnetfeldes durch die den

54 3. Theoretische Grundlagen
Kern umgebende Elektronenhülle, befindet sich der Kernspin in einem im Vergleich
zum B0-Feld kleineren effektiven Beff-Feld:
Beff = (1 − σ)B0
(3.18)
σ heißt Abschirmkonstante und ist unter anderem abhängig von der Elektronendich-
te, d. h. der Bindungsart und der Elektronegativität der Nachbaratome. Das Ausmaß
der Abschirmung eines Kerns und damit seine Resonanzfrequenz ist typisch für seine
Position im Molekül. Sie kann zur Identifikation des Moleküls herangezogen werden
und bildet die Grundlage der NMR-Spektroskopie. Die chemische Verschiebung δ, ei-
ne dimensionslose Größe, die in ppm (parts per million) angegeben wird, definiert die
Lage der Resonanzfrequenzen im Spektrum. Sie ist unabhängig von der verwendeten
Feldstärke B0 und bezieht sich als Relativ-Maßstab in der 1 H- und 13 C-Spektroskopie
auf die Resonanzfrequenz ωref von Tetramethylsilan (TMS):
δ[ppm] =
ω − ωref
ωref
· 10 6
(3.19)
Generell wird das Verhalten eines magnetischen Kernmomentes unter dem Einfluss
des äußeren Magnetfeldes � B0 durch die Bewegungsgleichung beschrieben:
d�µ
dt = γ(�µ × � B0) (3.20)
Sie folgt aus der klassischen Betrachtung des Drehimpulses, dessen zeitliche Änderung
gleich dem Drehmoment ist, das auf �µ wirkt und durch das Vektorprodukt �µ × � B0
gegeben ist.
Prinzipiell würde die exakte theoretische Betrachtung eines NMR-Experimentes die
Lösung der Bewegungsgleichung jedes Kernspins erfordern. Jedoch ermöglichen
Näherungen sowohl im klassischen als auch quantenmechanischen Bild eine anschau-
liche Darstellung.
3.5.2 Klassische Darstellung
Die Gesamtmagnetisierung � M und der Gesamtdrehimpuls � J einer makroskopischen
Probe ergibt sich aus den Vektorsummen der entsprechenden Beiträge der einzelnen
Kerne: � M = � �µi, � J = � � Ii. Im thermischen Gleichgewicht sind die transversalen
Komponenten von �µ und � I der einzelnen Kerne unkorreliert und summieren sich zu
null auf. Aus den kleinen Populationsunterschieden zwischen den Energieniveaus re-
sultiert daraus eine longitudinale Gesamtmagnetisierung � M0 = M0�ez. Unter der An-
nahme äquivalenter, nicht interagierender Spinspezies in einer homogenen, isotropen
Probe, gehorcht die Gesamtmagnetisierung der gleichen Bewegungsgleichung wie ein
einzelner Kernspin:
d � M
dt = γ( � M × � B0) (3.21)

3.5 Magnetische Kernresonanz 55
Unter den experimentellen Bedingungen sind diese Annahmen aber nicht gerechtfer-
tigt: Atomkerne interagieren miteinander und die Bewegungsgleichung wird unter an-
derem aufgrund von
• Relaxationsmechanismen und
• dynamischen Prozessen wie Diffusion und chemischem Austausch
wesentlich komplizierter. Weitere Einflussfaktoren stellen unter anderem Probeninho-
mogenitäten und -anisotropien dar. Diese werden im Rahmen dieser Arbeit jedoch
nicht berücksichtigt.
3.5.2.1 Relaxation
Prinzipiell wird ein Prozess, der einen beliebigen Zustand in einen Gleichgewichtszu-
stand zurückführt als Relaxation bezeichnet. In der NMR handelt es sich dabei um kei-
nen spontanen Prozess, sondern er erfordert die Stimulation durch fluktuierende Ma-
gnetfelder zur Induktion von Spinübergängen. Dies geschieht durch die folgenden vier
Hauptmechanismen [68]: Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Spin-Rotation, Quadrupol-
Relaxation und Relaxation durch chemische Verschiebungsanisotropie.
3.5.2.1.1 Bloch-Gleichungen
1946 wurden durch Einfügen zweier Relaxationsraten erster Ordnung ( 1 1 , ) in die
T1 T2
Bewegungsgleichung die Bloch-Gleichung [25] aufgestellt. Sie ist der einfachste theo-
retische Ausdruck zur Beschreibung der Relaxation.
dabei ist
d � M(t)
= γ(
dt
� M(t) × � B0) − R( � M(t) − � M0) (3.22)
⎛ ⎞
1 0 0 T2
⎜ 1 ⎟
R = ⎝ 0 0 ⎠ (3.23)
T2
1 0 0 T1
• T2=transversale Relaxationszeit
Sie ist die für den Zerfall der transversalen Magnetisierung charakteristische
Zeitkonstante. Die transversale Relaxation, auch Spin-Spin-Relaxation genannt,
beruht auf einem Energieaustausch zwischen benachbarten Atomkernen. Die Ge-
samtenergie und damit die Besetzungsverhältnisse der einzelnen Energieniveaus
ändert sich dabei nicht. Es handelt sich somit um einen reinen Entropieprozess
mit einem Verlust der Phasenkohärenz zwischen den einzelnen Spins.

56 3. Theoretische Grundlagen
• T1=longitudinale Relaxationszeit
Sie bezeichnet die Zeitkonstante, innerhalb der die longitudinale Magnetisierung
nach einer Störung in den Gleichgewichtszustand zurückkehrt. Diese Art der
Relaxation wird als Spin-Gitter-Relaxation bezeichnet und ist mit einer Ener-
gieänderung des Systems verbunden. Der Begriff Gitter stammt ursprünglich
aus der Festkörperphysik und bezeichnet auch in der Flüssigphasen-NMR die
gesamte Umgebung mit der Energie ausgetauscht werden kann.
Prinzipiell wird bei NMR-Experimenten die zeitliche Entwicklung der transversalen
Magnetisierung: M + (t) = Mx(t) + iMy(t) durch den Resonator im Probenkopf nach
Anregung der Probe durch das HF-Feld � B1 betrachtet. Durch die Einführung der kom-
plexen Magnetisierung M + erhalten die Bloch-Gleichungen die folgenden Ausdrücke:
∂M + (t)
∂t
�
= − iω0 + 1
�
M
T2
+ (t) (3.24)
∂Mz(t)
∂t
= − 1
(Mz(t) − M0) (3.25)
T1
Die allgemeinen Lösungen der Bloch-Gleichungen ergeben:
M + (t) = M + �
(0)exp(−iω0t)exp − t
�
T2
�
Mz(t) = Mz(0)exp − t
� � �
+ M0 1 − exp −
T1
t
��
T1
(3.26)
(3.27)
Nach Fouriertransformation der transversalen Magnetisierung bezüglich t erhält man
die Lorentzlinie, d. h. die Resonanzlinie im Spektrum in der Frequenz-Domäne:
M + (ω) = M + (0)
1
−i(ω0 − ω) − 1
T2
(3.28)
wobei ω0 die Position angibt und die Signalbreite durch 1 bestimmt wird. Die Signal-
T2
amplitude M + (0) zum Zeitpunkt t=0 ist abhängig von der Magnetisierung im Grund-
zustand M0 und vom Pulswinkel α = γτB1, wobei τ die HF-Pulsdauer ist.
Betrachtet man nur magnetisch äquivalente Atomkerne, so hat das aufgezeichnete
Zeitsignal, free induction decay (FID), die Form einer exponentiell gedämpften Si-
nusschwingung. T2 definiert dabei die Zeitspanne, während der der FID beobachtet
werden kann, T1 hingegen die minimale Zeit, die zum Erreichen des Gleichgewich-
tes benötigt wird. Die Signalstärke ist somit zur transversalen Magnetisierung pro-
portional und klingt mit der Zeitkonstanten T2 ab. In der Praxis dagegen liegt eine
Verteilung von Resonanzfrequenzen vor, wodurch Spins, die unmittelbar nach der An-
regung noch eine identische Phase aufweisen, dephasieren. Dadurch verkleinert sich
die vektorielle Summe der magnetischen Momente der einzelnen Spins und folglich
die Signalintensität. Die beobachtete Signalabnahme wird deshalb als empirische T ∗ 2 -
Relaxation bezeichnet. Sie enthält unter anderem Beiträge aus

3.5 Magnetische Kernresonanz 57
• der natürlichen transversalen Relaxation der Spin-Spin-Wechselwirkung,
• der transversalen Relaxation aufgrund von Magnetfeldinhomogenitäten und
Magnetfeldabschirmung und
• dem Signalabfall durch die dynamischen Prozesse wie Diffusion und chemi-
schem Austausch der Kernspins im Raum.
Mit den Erweiterungstermen von Torrey [264, 265] und McConnell [172] gelang es die
Diffusion (3.29) bzw. den chemischen Austausch (3.30) in die Bewegungsgleichung mit
einzubeziehen und theoretisch zu beschreiben:
d � M(t)
dt
d � M(t)
dt
= γ( � M(t) × � B0) − R( � M(t) − � M0) + ∇D∇ � M(t) (3.29)
= γ( � M(t) × � B0) − R( � M(t) − � M0) + K � M(t) (3.30)
D ist dabei der Diffusionstensor und K der Austauschtensor. D wird bei homo-
genen, isotropen Proben zu einer Zahl und kann vor den Nabla-Operator gezogen
werden. Gleichung (3.30) stellt lediglich eine formale Beschreibung der Entwicklung
der Magnetisierung unter Einbeziehung des chemischen Austauschs dar. Hier ist die
Einführung weiterer Dimensionen, die die austauschenden Kerne enthalten, notwen-
dig.
3.5.2.1.2 Spinecho
Die experimentelle Bestimmung der transversalen Relaxationszeit T2 erfolgt häufig
mittels Spinecho-Sequenz von Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG-Sequenz) [174].
Diese Sequenz nutzt die Reversibilität des Anteils des transversalen Magnetisierungs-
zerfalles, der durch Dephasierung der Spins bedingt ist (T’2). Wie in Abbildung 3.10
gezeigt, wird die Probe zunächst mit einem 90◦ x-Puls angeregt, und die verschiedenen
Spins beginnen aufgrund ihrer Frequenzverteilung zu dephasieren. Nach einer Zeit τ
erfolgt ein 180◦ y-Puls, wodurch die Spins nach einem weiteren Zeitintervall τ wieder
rephasieren. Dadurch steigt das Signal mit der Zeitkonstante T’2 an. Es entsteht somit
ein Spinecho mit dem Echomaximum zum Zeitpunkt 2τ nach Einstrahlung des Anre-
gungspulses. Die beiden Impulswinkel werden senkrecht aufeinander geschaltet und
verhindern dadurch, dass Pulsimperfektionen kumulieren. Die Refokussierung findet
bei jedem Echo ausschließlich in der +y-Hemisphäre statt, wodurch sich Pulsimperfek-
tionen nur als kleine Fehler bei ungeradzahligen Echos bemerkbar machen und sich bei
geradzahligen Echos auslöschen (CPMG-Bedingung).

58 3. Theoretische Grundlagen
Abbildung 3.10: Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Sequenz und erzeugtes Spinecho, modifiziert nach
[68].
Diese Sequenz ermöglicht es nicht die natürliche Spin-Spin-Relaxation, Diffusion und
chemischen Austausch unabhängig voneinander zu messen, so dass die experimen-
tell gemessene transversale Relaxation als apparentes bzw. gemessenes T2 bezeichnet
wird.
3.5.2.2 Chemischer Austausch
Als chemischen Austausch bezeichnet man den Austausch von Atomen oder gan-
zen Molekülen aus unterschiedlicher chemischer Umgebung. Austauschprozesse zwi-
schen zwei Spinspezies (magnetisch unterschiedliche Kerne einer Atomsorte) können
sowohl intramolekular durch Konformationsänderung als auch intermolekular durch
Brownsche Molekularbewegung zwischen solvatisierenden und freien Protonen oder
durch Säure-Base-Reaktionen stattfinden. Eine detaillierte Behandlung des chemi-
schen Austausches mit zahlreichen Beispielen ist in den Werken von Cavanagh [57],
Levitt [158] und Bain [18] zu finden. Betrachtet man ein 2-Spin-System, so wird der
Austausch von Kernen zwischen den beiden Kernzuständen A und B:
A
kh
⇌
kr
B (3.31)
durch die Reaktionsraten kh und kr beschrieben. Die Temperaturabhängigkeit der Re-
aktion ist über die Arrhenius-Gleichung enthalten:
�
k = C exp − ∆E
�
RT
(3.32)

3.5 Magnetische Kernresonanz 59
wobei C der prä-exponentielle Faktor, R die Gaskonstante, ∆E die Aktivierungsener-
gie und T die Temperatur in Kelvin sind. Die Austauschgeschwindigkeit verläuft nach
der Kinetik erster Ordnung:
vh = kh · [A] (3.33)
vr = kr · [B] (3.34)
Zwischen Hin- und Rückreaktion stellt sich ein Gleichgewicht ein. Die Gleichgewichts-
konstante berechnet sich aus dem Konzentrationsverhältnis der beiden Kernzustände
bzw. dem Verhältnis der Austauschraten:
K = [B]
[A]
= kh
kr
(3.35)
Die Gleichgewichtskonstante an sich ist auch temperaturabhängig. Im Fall von Säure-
Base-Reaktionen wird das Verhältnis der beiden Zustandskonzentrationen und da-
mit ihr Austausch über die Henderson-Hasselbalch-Gleichung durch den pH-Wert be-
stimmt:
pH = pks + log [Base]
[Säure]
(3.36)
Je nach dem Verhältnis zwischen k und ω unterscheidet man zwischen langsamem (k <
ω) und schnellem chemischem Austausch ( k > ω). Die Spektroskopie ermöglicht über
das Lorentzprofil der austauschenden Resonanzen eine genaue Analyse des chemi-
schen Austauschs. Durch Näherungen wurden zahlreiche Lösungen der McConnell-
Gleichung in Abhängigkeit der jeweiligen Resonanzfrequenzen sowohl für schnellen
Austausch (Swift-Connick [258] und Luz-Meiboom [163]) als auch für langsamen Aus-
tausch (Allerhand-Gutowsky [7] und Carver-Richards [56]) vorgestellt. In der Praxis
werden ihre Anwendungen bei einem N-Spin-System jedoch nahezu unmöglich. In
diesem Fall bietet die Bildgebung die Möglichkeit über experimentell ermittelte Para-
meter wie T1, T2, D oder MTC (Magnetisierungstransferkontrast) Änderungen im che-
mischen Austausch global mitzuverfolgen. Ein Formalismus zur Beschreibung eines
Austausches zwischen N-Spin-Zuständen ist in [266] enthalten.
3.5.3 Spektroskopie
In der Spektroskopie liefert nicht nur die chemische Verschiebung δ Information über
die Position des Protons im Molekül und damit zur Struktur, sondern auch die skala-
re J-Kopplung. Skalar bezeichnet hier die Tatsache, dass die Orientierung der Spins
zueinander für die Kopplung keine Rolle spielt. Sie wird durch die Spins der bin-
denden Elektronen in kovalenten Bindungen vermittelt und bewirkt eine Aufspaltung
der Resonanzsignale. Die Kopplung von Kernen ist die Voraussetzung für 2D-NMR-
Spektroskopie. Sie wird häufig zur Strukturaufklärung großer Moleküle wie Steroide,

60 3. Theoretische Grundlagen
Peptide und Oligosaccharide, deren 1 H-Spektren aufgrund zahlreicher Signalüberla-
gerungen nicht mehr analysierbar sind, angewandt. Das einfachste 2D-Experiment ist
das homonukleare (H,H)-korrelierte NMR-Experiment mit dem Namen COSY (COr-
relation SpectroscopY) [17]. Wie in Abbildung 3.11 gezeigt, beginnt die Pulssequenz
mit einem 90 ◦ y-Puls, welcher das Spinsystem anregt und die Präparationsphase dar-
stellt. In der darauffolgenden Zeit t1, der Evolutionsphase, wirkt die J-Kopplung, d. h.
bei zwei miteinander koppelnden Spins erhält man aus den Übergängen zwischen
den verschiedenen Spinzuständen vier Magnetisierungsvektoren, die aufgrund ihrer
unterschiedlichen Larmorfrequenzen auffächern. Der zweite 90 ◦ y-Puls stellt die so-
genannte Mischphase dar und ist mit einem Magnetisierungstransfer zwischen den
Zuständen koppelnder Spins verbunden, wodurch bestimmte Übergänge stimuliert
werden, deren Signalemission im Zeitintervall t2, der Detektionsphase, aufgezeichnet
wird. Die Fourier-Transformation des FIDs liefert ein Spektrum in der ersten spektro-
skopischen Dimension des Experimentes (F2). Durch Wiederholung des Experimentes
wird t1 inkrementiert und das Signal jeweils zum gleichen Zeitpunkt der Detektions-
phase aufgezeichnet. Seine Fourier-Transformation liefert dann die zweite spektrosko-
pische Dimension (F1). Betrachtet man zwei Spins A und B mit den Resonanzfrequen-
zen ωA und ωB, so befinden sich auf der Diagonalen zwei Signale an den Positionen
(ωA, ωA) und (ωB, ωB) und bei J-Kopplung zwischen den Spins zusätzlich zwei Kreuz-
signale an den Positionen (ωA, ωB) und (ωB, ωA).
Abbildung 3.11: (H,H)-korreliertes COSY-
Experiment, modifiziert nach [68].
3.5.4 Bildgebung
Die Anwendung der NMR für die Bildgebung, erfordert eine ortsaufgelöste Akquisiti-
on, d. h. dem NMR-Signal muss eine Ortsinformation aufgeprägt werden. Dazu schal-
tet man mit Gradientenspulen ortsabhängige Magnetfelder, die dem � B0-Feld überla-
gert sind. Solange ein Magnetfeldgradient ( � G) geschaltet ist, besitzen die Spins in einer
Probe eine ortsabhängige Larmorfrequenz:
ω(�r) = γ(B0 + �r � G) (3.37)

3.5 Magnetische Kernresonanz 61
mit:
⎛
�G
⎜
= ⎝
∂Bz
∂x
∂Bz
∂y
∂Bz
∂z
⎞
⎟
⎠ (3.38)
Je nach Zeitpunkt und Richtung der Gradientenschaltung unterscheidet man verschie-
dene Möglichkeiten der Ortskodierung:
3.5.4.1 Schichtselektionsgradient
In einem NMR-Experiment werden die Spins einer Probe durch einen HF-Puls der
Dauer ∆t angeregt. Der Puls besitzt dabei nach:
∆ω · ∆t ∼ = 1 (3.39)
eine Bandbreite von ∆ω. Liegt während der Pulseinstrahlung nun ein Gradient � Gz
senkrecht zur anzuregenden Schicht an, so erfahren nur die Spin einer Schicht der
Dicke ∆z eine Anregung. Die Dicke ∆z bestimmt sich zu:
∆z = ∆ω
2πγGz
(3.40)
Bei Pulswinkeln bis 90 ◦ berechnet sich das angeregte Schichtprofil in sehr guter Nähe-
rung als Fouriertransformierte des Pulsprofils in der Zeit-Domäne.
3.5.4.2 Lesegradient
Eine weitere Möglichkeit der Ortsaufprägung ergibt sich durch Anlegen eines Lese-
gradienten � Gx während der Akquisition. Dadurch entspricht jeder Frequenz, die im
FID enthalten ist, ein Ort x und das Spektrum weist mit:
f(x) = γ
2π Gxx (3.41)
eine kontinuierliche Frequenzverteilung auf.
3.5.4.3 Phasenkodiergradient
Die dritte Möglichkeit der Ortskodierung stellt die Phasenkodierung dar. Hierzu wird
ein Magnetfeldgradient vor der Akquisition für eine Zeit τ angelegt. Nach Abschalten
dieses Phasenkodiergradienten besitzt das NMR-Signal dadurch eine ortsabhängige
Phase mit:
Φ(�r, τ) = ω0τ +
� τ
0
γ � G(t)�rdt (3.42)

62 3. Theoretische Grundlagen
3.5.4.4 k-Raum
In Analogie zur Verwendung des Frequenzraumes als Fourier-Raum des Zeitsignals
in der NMR-Spektroskopie lässt sich das MR-Signal der Bildgebung durch die Wellen-
zahlenvektoren � k(t) beschreiben, die den k-Raum aufspannen und wie folgt definiert
sind:
� k(t) =
� t
0
γ
2π � G(t ′ )dt ′
(3.43)
Um eine vollständige Information über die räumliche Struktur zu erhalten, muss der
gesamte k-Raum abgetastet werden. Im zweidimensionalen Bildgebungsexperiment
erfolgt dies durch Schalten eines Phasenkodier- und Lesegradienten in zueinander orthogonalen
Raumrichtungen. Nach Substitution für die Leserichtung mit kx = γ
2πGxt und für die Phasenkodierrichtung mit ky = γ
2πGyt erhält man für das aufgenommene
Signal einer ausgedehnten Probe:
s( � �
k) ∝ ρ(x, y)exp(2πixkx)exp(2πiyky)dxdy (3.44)
Dabei ist ρ(x, y) die Spindichte in der xy-Ebene. Aus dem Signal im k-Raum erhält man
somit durch Fouriertransformation bezüglich kx und ky das Bild im Ortsraum. Das Si-
gnal, welches bei konstanter Phasenkodierzeit bei einer bestimmten Gradientenstärke
aufgenommen wird, entspricht genau einem Bildpunkt im k-Raum. Zur Aufnahme ei-
nes 2D-Bildes muss somit die Akquisition nach der Phasenkodierung mit unterschied-
lichen Gradientenstärken wiederholt werden. Die Gradientenstärke wird dabei von
-Gmax bis +Gmax mit äquidistanter Gradientenschrittweite ∆k variiert. Bei jeder Ak-
quisition erfolgt die Schaltung des Lesegradienten über die Zeitdauer t. In dieser Zeit
werden TD (time domain) Datenpunkte aufgenommen, d. h. eine k-Raum-Zeile wird
mit TD Datenpunkten abgetastet. Die Auflösung (∆x = FOV,Gesichtsfeld
) wird so-
Anzahl der Bildpunkte
wohl durch den Lesegradienten als auch durch den Phasengradienten bestimmt. In
Leserichtung wird sie durch die Bandbreite SW und TD bestimmt, in Phasenkodier-
richtung durch die Gradientenschrittweite ∆k. Für eine hohe Auflösung ist die Pha-
senkodierung der zeitlimitierende Faktor.

Kapitel 4
Ergebnisse und Diskussion
4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT
Überblick:
In diesem Kapitel wird die Etablierung eines zuverlässigen, emp-
findlichen, reproduzierbaren und einfach zu handhabenden In-
vitro-High-Throughput-Screening-Verfahrens für Zytotoxizitätsmes-
sungen an Trypanosoma brucei brucei beschrieben. Dieses standar-
disierte Verfahren diente zur Untersuchung unterschiedlicher Sub-
stanzklassen aus den verschiedenen Teilprojektgruppen des SFB 630
auf ihre antitrypanosomale Aktivität. Insgesamt wurden im Rahmen
dieses Projektes: 23 Chinolone, 62 Piperidine, 23 Naphthalimide, 164
Naphthylisochinolin-Alkaloide und strukturverwandte, synthetisier-
te Substanzen, 102 Cysteinprotease-Inhibitoren und 9 Siliziumver-
bindungen getestet, deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen an aus-
gewählten Beispielen diskutiert werden.
4.1.1 Auswahl des Testsystems
Die Erreger der humanen Afrikanischen Trypanosomiasis (HAT) Trypanosoma brucei
rhodesiense und Trypanosoma brucei gambiense weisen mit Sicherheitsstufe 2 und 3 ei-
ne hohe Pathogenität auf. Da einige genetische Untersuchungen die Verwandtschaft
der human- und tierpathogenen Trypanosomenstämme bestätigten [166, 249], wurde
Trypanosoma brucei brucei (T. b. b.), einer der tierpathogenen Erreger der Nagana-Seuche
beim Rind, als Teststamm für die Zytotoxizitätsmessungen eingesetzt. In dieser Arbeit
wurde mit dem Trypanosomenklon T.b.b. TC221 gearbeitet [123]. Diese Blutstromform
ist an Kulturbedingungen gut adaptiert und eignet sich daher für In-vitro-Arbeiten
[140]. Zum Aufbau eines High-Throughput-Screening-Verfahrens wurde auf die in
63

64 4. Ergebnisse und Diskussion
der Literatur beschriebenen Methoden zur Auswertung von Trypanosomenkulturen
zurückgegriffen. Die Bestimmung der Trypanosomenproliferation und -vitalität kann
radiometrisch durch Messung der Einbaurate radioaktiv markierter Nucleotide wie
z. B. [ 3 H]Hypoxanthin [47, 78] oder durch Auszählen der kultivierten Trypanosomen
mittels Coulter-Counter bzw. mikroskopisch [141] erfolgen (siehe auch Abschnitt 1.2.2
und Abschnitt 1.2.3). Der Nachteil all dieser Methoden ist jedoch ihr hoher Zeitauf-
wand. Die meisten Verfahren basieren daher auf dem Einsatz von Farbstoffen und ei-
ner optischen Auswertung. Häufig zur Auswertung von Trypanosomenkulturen ange-
wandte Indikatoren sind z. B. 2’,7’-Bis-(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein-penta-
acetoxy-methylester (BCECF-AM) und AlamarBlue [191, 217]. Erfahrungsberichte zei-
gen, dass mit der AlamarBlue-Methode ein optimales Verfahren zur Bestimmung der
Zellproliferation zur Verfügung steht [217]. Sie erfordert keine Extraktions-, Wasch-
und Zentrifugationsschritte, ist somit zeitsparend und voll automatisierbar [6]. Ala-
marBlue selbst ist wasserlöslich und nicht zytotoxisch [217]. Seine Anwendung auf
Arzneistoff-exponierte Zellkulturen zur Auswertung des antitrypanosomalen Poten-
zials entspricht in Bezug auf Zuverlässigkeit, Sensitivität, Reproduzierbarkeit, einfa-
cher Handhabung und Finanzierbarkeit den Anforderungen eines High-Throughput-
Screening-Verfahrens.
4.1.2 AlamarBlue
AlamarBlue gehört zur Gruppe der Reduktions-Oxidations(REDOX)-Indikatoren und
wirkt stoffwechselsensitiv. Es nutzt die Eigenschaft proliferierender Zellen das Verhält-
nis zwischen reduzierter und oxidierter Form der Coenzyme NADPH/NADP,
FADH/FAD, FMNH/FMN und NADH/NAD stetig zu vergrößern.
O
N +
O O
OH
Resazurin (ox.)
Indigoblau
Absorptionsmaximum: 600 nm
NADPH, FADH, FMNH,
NADH, Cytochrom
N
O O
Abbildung 4.1: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Assay.
OH
Resorulfin (red.)
Pink
Absorptionsmaximum: 570 nm
Im Grundzustand liegt AlamarBlue in der oxidierten Form, als Resazurin
(λmax=600 nm) vor. Bei einem pH von 7 und bei 25 ◦ C besitzt es ein REDOX-Potenzial

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 65
von +380 mV. Nach Aufnahme in die Zellen wird es wie in Abbildung 4.1 gezeigt durch
NADPH, FADH, FMNH, NADH und Cytochromen zum Resorulfin (λmax=570 nm) re-
duziert. Visuell ist diese Reaktion durch einen Farbumschlag von blau nach pink er-
kennbar. Die Quantifizierung der Farbreaktion kann sowohl fluorimetrisch als auch
spektralphotometrisch erfolgen. Die Überlappung der Absorptionsspektren der redu-
zierten und oxidierten AlamarBlue-Formen erfordert zur spektralphotometrischen Be-
stimmung des Ausmaßes der Zellproliferation die Messung bei zwei verschiedenen
Wellenlängen im Bereich der beiden Absorptionsmaxima.
4.1.3 AlamarBlue-Test
Der AlamarBlue-Test wird in 96-Mikrotiterplatten durchgeführt. Zur Validierung des
Verfahrens müssen die Zelldichte, Inkubationszeiten und die Mediumzusammenset-
zung für den jeweiligen Teststamm optimiert werden. In der Dissertation von Karin
Merschjohann [175] wurde das AlamarBlue-Verfahren bereits auf Trypanosoma brucei
brucei TC221 angewandt, so dass auf optimierte Parameter zurückgegriffen werden
konnte. Dazu wird zunächst eine Zellsuspension mit 10 4 vitalen Zellen pro Milliliter
in Baltz-Medium präpariert und mit dem potenziellen Wirkstoff für 24 h inkubiert.
Vor jedem Versuch sollte sichergestellt werden, dass sich die Parasiten zum Zeitpunkt
der Ernte in der exponentiellen Phase befinden. Anderenfalls kann ihre Vermehrungs-
geschwindigkeit von Versuch zu Versuch trotz initialer gleicher Parasitendichte stark
schwanken und unterschiedliche Ergebnisse für die Wirksamkeit einer Substanz lie-
fern. Es ist ferner darauf zu achten, dass das verwendete Lösungsmittel nicht höher als
in 1 %iger Konzentration in der Zellsuspension vorliegt um eine mögliche lösungsmit-
telbedingte Zytotoxizität auszuschließen. Den Arzneistoff-exponierten Inokula wer-
den schließlich 10 % AlamarBlue zugesetzt und und der gesamte Ansatz für weite-
re 24 h inkubiert. Kein Farbumschlag spricht für eine starke Inhibition der Zellen.
Eine Pinkfärbung ist dagegen ein Indiz für eine schwache Inhibition und eine star-
ke Zellproliferation. Die Auswertung erfolgte spektralphotometrisch mittels ELISA-
Reader. Zur Bestimmung der Differenzabsorption zwischen oxidierter und reduzierter
AlamarBlue-Struktur wurden die Messwellenlängen in Anlehnung an die Produktin-
formationen der Firma Trinova Biochem auf 550 nm und 630 nm festgelegt [3]. Nach
der photometrischen Auswertung werden Dosis-Wirkungs-Kurven erstellt. Hier wird
die gemessene Differenzabsorption in Bezug auf den Messwert einer Positivkontrol-
le (Zellsuspension mit 1 % Lösungsmittel und 10 % AlamarBlue) berechnet und ge-
gen die eingesetzten Testkonzentrationen aufgetragen. Aus den sigmoidalen Dosis-
Wirkungs-Kurven wird mittels linearer Interpolation der ED50-Wert [134] (Abschnitt
1.2.2) berechnet. Das verwendete Testverfahren, die Mediumzusammensetzung und
die Berechnung der ED50 sind im Experimentellen Teil ausführlich beschrieben.

66 4. Ergebnisse und Diskussion
4.1.3.1 Lösungsmittel
Die AlamarBlue-Methode sollte zur Testung vieler verschiedener Substanzklassen an-
gewandt werden. Dazu war es notwendig zunächst die einzusetzenden Lösungsmit-
tel DMSO, EtOH und 0.1 M NaOH auf ihre zytotoxische Wirkung zu untersuchen
und mögliche Reaktionen mit AlamarBlue, die zu spektralen Verschiebungen führen
können, auszuschließen. In Abbildung 4.2 sind die gemessenen Differenzabsorption-
en inokulierter Trypanosomenkulturen unter Zusatz verschiedener Lösungsmittelkon-
zentrationen in Bezug auf den Messwert einer Kontrollsuspension (Trypanosomen-
kultur ohne Lösungsmittelanteil) in einem Dosis-Wirkungs-Diagramm aufgetragen.
Während 0.1 M NaOH selbst bei 10 %igem Anteil keine Auswirkung auf die Zellpro-
liferation zeigt, führen EtOH und DMSO ab einer Konzentration von 2.5 % zu einer
nahezu vollständigen Hemmung des Zellwachstums. In Anwesenheit eines 1 %igen
Lösungsmittelanteils bleibt die Zellproliferation bei EtOH unbeeinflusst. Bei DMSO
dagegen werden nur 60 % des natürlichen Wachstums erreicht. Eine weitere Reduktion
des Lösungsmittelanteiles war jedoch aufgrund der teilweisen schlechten Löslichkeit
der Testsubstanzen nicht möglich, so dass auch unter Verwendung von DMSO, die
Zytotoxizitätsmessung mit 1 %igem Lösungsmittelanteil durchgeführt wurde. Rein
rechnerisch betrachtet, bringt dies keine Nachteile mit sich, denn die Zytotoxizität
wird stets in Bezug auf eine lösungsmittelenthaltende Positivkontrolle ermittelt. Ei-
ne Verstärkung der antitrypanosomalen Wirkung der Testsubstanzen ist jedoch nicht
auszuschließen. Hinweise auf Interaktionen zwischen AlamarBlue und verschiedenen
Lösungsmitteln und dadurch Verschiebungen seiner Absorptionsbanden ähnlich der
Solvatochromie konnten nicht gefunden werden.
Abbildung 4.2: Dosis-Wirkungs-
Diagramme verschiedener Lösungsmittel
für den Teststamm
Absorbance [% of control]
140
120
100
80
60
40
20
0
0.1 M NaOH
0 2 4 6 8 10
Trypanosoma brucei brucei. Concentration [%]
DMSO
EtOH

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 67
4.1.3.2 Referenzsubstanzen
Zur Überprüfung des AlamarBlue-Test-Verfahrens unter den gegebenen Laborbedin-
gungen wurde die Wirksamkeit der derzeitig zur Therapie der HAT eingesetzten Arz-
neistoffe Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na, Eflornithin-HCl, Nifurtimox und Me-
larsoprol auf T. brucei brucei bestimmt. Die Wirkung dieser Substanzen ist in der Lite-
ratur gut dokumentiert und eignet sich somit als Referenzwert.
Absorbance [% of positive-control ]
120
100
80
60
40
20
0
10
-5
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10 1 10 10
Concentration [ µ M]
2
Pentamidin diisethionat
Suramin-Na
Eflornithin-HCl
Nifurtimox
Melarsoprol
Abbildung 4.3: Dosis-Wirkungs-Kurven von Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na und Eflornithin-HCl
(gelöst in H2O), Nifurtimox und Melarsoprol (gelöst in DMSO). Berechnet wurden die Konzentrationen
auf die Salz-freie Arzneistoffform. Aufgetragen sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Testdurchläufen.
(Bei den Punkten, bei welchen keine Fehlerbalken zu erkennen sind, ist die Abweichung
sehr klein.)
Arzneistoff T. b. b. ED50 (gemessen) T. b. b. ED50 (Literaturwert)
[µM] [µM]
Pentamidin diisethionat 0.0029±0.0002 0.0002-0.002 [176]
Suramin-Na 0.31±0.05 0.007-21.3 [176]
Eflornithin-HCl 22.9±4.6 11.5 [175]
Melarsoprol 0.0026±0.0004 -
Nifurtimox 3.4±0.4 -
Tabelle 4.1: Gegenüberstellung der gemessenen und der in der Literatur dokumentierten antitrypanosomalen
Aktivität von Pentamidin-diisethionat, Suramin-Na, Eflornithin-HCl, Melarsoprol und Nifurtimox.
Die Werte beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die Mittelwerte und Standardabweichungen
wurden aus drei unabhängigen Testdurchläufen berechnet. Bei Melarsoprol und Nifurtimox
ließen sich Referenzwerte nicht eruieren.

68 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.3 zeigt die entsprechenden Dosis-Wirkungs-Kurven im Konzentrations-
bereich zwischen 100 µM und 10 pM. Aus diesen wurden die entsprechenden ED50-
Werte mittels linearer Interpolation berechnet und mit den in der Literatur dokumen-
tierten Ergebnissen verglichen (Tabelle 4.1). Die Literaturwerte müssen kritisch be-
trachtet werden, denn aufgrund der vielen Möglichkeiten Zytotoxizität zu bestimmen,
streuen sie über einen breiten Wirkbereich. Die eigens ermittelten Ergebnisse liegen
jedoch akzeptabel im dokumentierten Bereich und korrespondieren sehr gut mit den
Ergebnissen aus dem Arbeitskreis Steverding in Norfolk (Eflornithin: ED50=11.5 µM,
Pentamidin-diisethionat: ED50=0.0025 µM, Suramin: ED50=0.36 µM), womit die Rich-
tigkeit der Durchführung des Testverfahrens bestätigt ist. Die fünf zur Verfügung ste-
henden Arzneistoffe dienten während des gesamten Projektes als Referenzsubstanzen
und wurden von Zeit zu Zeit zur Kontrolle der Testung und der Protozoenkultur ein-
gesetzt. Dadurch konnten Fehler in der Routine und mögliche Mutationen und Ver-
unreinigungen der Zellkulturen schnell erkannt und die Richtigkeit des Verfahrens
gewährleistet werden. Da neben der Richtigkeit der Methode auch die Reproduzier-
barkeit gegeben war - die Streuung der berechneten ED50 lag unterhalb der für Bio-
tests üblichen 30 % [216] - waren die beiden wichtigsten Voraussetzungen zum Einsatz
des AlamarBlue-Tests zur Reihenuntersuchung der Zytotoxizität von Substanzen auf
Trypanosomen erfüllt.
4.1.3.3 Etabliertes Testsystem
18
17
6
7
5
8
O
10
9
O
4
N
H 1
Abbildung 4.4: Antidesmon
3 O
2
Routinemessungen zeigten jedoch bald Grenzen
des Testsystems. So wiesen einige Testsubstan-
zen ein ausreichendes REDOX-Potenzial auf (<
+380 mV), um Resazurin zum Resorulfin zu re-
duzieren. Entdeckt wurde diese Fähigkeit an den
Strukturabkömmlingen des Antidesmon. Anti-
desmon ist ein pflanzliches Alkaloid, welches
1996 erstmals isoliert wurde und aufgrund seiner
Struktur und seines Syntheseweges als erster Re-
präsentant einer neuen Klasse von Alkaloiden gilt [40, 44]. Durch spektroskopische
Untersuchungen und Derivatisierungen wurde die Struktur als 3-Methoxy-2-methyl-
5-n-octyl-1,5,6,7-tetrahydro-chinolin-4,8-dion aufgeklärt [40]. Interesse an dieser Struk-
turgruppe weckte vor allem seine hohe Aktivität gegenüber Trypanosoma cruzi, dem
Erreger der Chagas-Krankheit, seine schwache Wirksamkeit gegen Leishmania donova-
ni und sein bisher unbekannter Wirkmechanismus [117]. Eine Wirksamkeit gegenüber
einer Trypanosoma brucei-Spezies konnte bisher zwar nicht gezeigt werden, dennoch
wurden die in Abbildung 4.6 dargestellten Strukturabkömmlinge des Antidesmon auf
ihre Wirksamkeit gegenüber Trypanosoma brucei brucei getestet. Auf den ersten Blick

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 69
O
N +
O O
OH
6
7
5
8
10
9
O
4
N
H 1
OH
N
OH
Me
N
O O
Resazurin (ox.) Resorulfin (red.)
O
N Me
Me
O
OMe
O
N Me
H
OMe
3-Hydroxy-2-methyl-
1H-chinolin-4-on
3
2
OH
Me
6
7
5
8
10
9
OH
4
N 1
3
2
OH
Me
3,4-Dihydroxy-2-methylchinolin
+ +
Abbildung 4.5: REDOX-Reaktion im AlamarBlue-Test.
O
N Me
Me
O
OH
NH 2
O
O
O
N Me
H
OH
O
N
H
O
O
OH
OMe
OMe
N Me
O
O
N Me
Abbildung 4.6: Strukturverwandte Substanzen des Antidesmon ohne Wirksamkeit gegen Trypanosoma
brucei brucei (d. h. der berechnete ED50-Wert lag über 100 µM).
zeigte keine der Strukturen eine Aktivität. Selbst bei Konzentrationen von 100 µM
lag Resazurin nahezu vollständig zu Resorulfin reduziert vor. Die Unwirksamkeit die-
ser Substanzgruppe konnte allerdings erst durch visuelle, mikroskopische Kontrol-
le und das Auszählen beweglicher Trypanosomen bestätigt werden, denn es zeigte
sich, dass alle Strukturen mit einem 3-Hydroxy-2-methyl-chinolin-4-on-Gerüst in das
REDOX-System des AlamarBlue eingreifen. Wie in Abbildung 4.5 dargestellt, liegt das
3-Hydroxy-2-methyl-chinolin-4-on in Lösung im Gleichgewicht mit seinem entspre-
chenden 3,4-Dihydroxy-chinolin vor. Vermutlich kann dieses ähnlich dem Chinon-
O
N
O
O

70 4. Ergebnisse und Diskussion
Kulturmedium + 100 µM Testsubstanz � Negativkontrolle
Kulturmedium + 1% Lösungsmittel + Trypanosomen � Positivkontrolle
Kulturmedium + 1% Lösungsmittel � Nullabgleich
Kulturmedium
+ Trypanosomen
+ Testsubstanzen in Verdünnungen
Testung potenzieller Wirksubstanzen
im Konzentrationsbereich:
100 µM bis 10 pM
Abbildung 4.7: Schema des etablierten AlamarBlue-Test-Verfahrens.
Hydrochinon-REDOX-Paar, durch AlamarBlue zum 2-Methyl-chinolin-3,4-dion oxi-
diert werden. Eine Erweiterung des Test-Verfahrens um eine Negativkontrolle (Medi-
um + Testsubstanz + AlamarBlue), in der das REDOX-Potenzial gegenüber Resazurin
geprüft werden konnte, erwies sich somit als notwendig, um Substanzen, die in ih-
rer Wirkung fälschlicherweise als negativ eingestuft wurden, entdecken zu können.
Der etablierte AlamarBlue-Test wurde optimiert nach dem Schema aus Abbildung 4.7
durchgeführt. Zeigte eine Testsubstanz eine positive Pink-Färbung der Negativkon-
trolle, konnte die Zytotoxizität nicht mittels AlamarBlue-Verfahren bestimmt werden
und die kultivierten Zellsuspensionen wurden durch mikroskopisches Auszählen vi-
taler, d. h. mobiler Zellen ausgewertet.

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 71
4.1.4 Struktur-Wirkungs-Beziehungen benzannelierter Systeme
4.1.4.1 Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs)
Abbildung 4.8:
Naphthylisochinolin
6
7
5
8
4
1
3
N 2
Interessante Alkaloide für die Leitstruktursuche gegen tro-
pische Protozoen-Erkrankungen sind vor allem in der Grup-
pe der Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) zu finden. Ei-
nigen dieser Substanzen wie z. B. Dioncopeltin A und Dion-
cophyllin B und C konnte sowohl in vitro als auch in vi-
vo eine hohe Aktivität gegen Plasmodium falciparum [99]
nachgewiesen werden, andere hingegen zeigten gegen Er-
reger der Leishmaniose [33], Chagas-Krankheit und Afri-
kanischen Schlafkrankheit [29, 36, 40] eine vielversprechende Aktivität. Über mögli-
che Zielstrukturen und Wirkmechanismen liegen jedoch noch keine Erkenntnisse vor.
Das Grundgerüst bildet bei dieser Substanzgruppe das Isochinolin, an welches eine
Naphthalin-Einheit geknüpft ist. Bisher wurden 120 Naphthylisochinolin-Alkaloide
aus afrikanischen Lianen-Gewächsen isoliert. Ihr Vorkommen beschränkt sich auf die
Familie der Dioncophyllaceae, die in drei Gattungen auftritt Habropetalum, Dioncophyl-
lum und Triphyophyllum, und auf die eng verwandte Familie der Ancistrocladusaus mit
der monotypischen Gattung Ancistrocladus [30, 37]. Im Rahmen dieser Studie wurde
eine große Bibliothek verwandter Substanzen aus Natur und Synthese aufgebaut und
in vitro auf Trypanosoma brucei brucei getestet.
4.1.4.1.1 C,C-verknüpfte NIQs
Die Ergebnisse einiger C,C-verknüpfter NIQs sind in Abbildung 4.9 zusammenge-
stellt. Bei dieser Alkaloid-Gruppe ist das Naphthalin mit dem Isochinolin über ei-
ne C,C-Biaryl-Achse verbunden. Bei unseren Untersuchungen wurde zunächst vom
Dioncophyllin A (1), einem sehr gut verfügbaren Naphthylisochinolin-Alkaloid, wel-
ches sowohl aus der westafrikanischen Triphyophyllum-peltatum-Liane isoliert [38], als
auch synthetisch gewonnen wurde [34], ausgegangen. Es zeigte mit einem ED50-
Wert von 3.4±1.7 µM eine vergleichbare Aktivität zu Nifurtimox (ED50=3.4±0.4 µM).
Ähnliche Ergebnisse wurden mit den strukturverwandten Substanzen Dioncophyl-
lin B (2) [41] (ED50=2.6±0.4 µM), Dioncophyllin C (3) [39] (ED50=4.2±2.3 µM) und
5’-O-Demethyldioncophyllin A (5) [43] (ED50=3.8±1.3 µM) erreicht. Ausgehend von
5’-O-Demethyldioncophyllin A führt eine zusätzlich eingefügte Hydroxy-Gruppe an
den Methyl-Rest des Naphthalins im Dioncopeltin A (4) [42] zu einer Redukti-
on der Aktivität im Größenbereich einer Zehnerpotenz (ED50=22.2±4.8 µM). Eben-
falls zeigten Korupensamin A (6) (ED50=48.6±4.8 µM) und Korupensamin B (7) [32]
(ED50=45.8±5.1 µM) mit jeweils zusätzlicher Hydroxy-Gruppe an Position 6 des
Tetrahydroisochinolin-Gerüstes stark verminderte Aktivität, welche im dimeren Mi-

72 4. Ergebnisse und Diskussion
chellamin B (8) [45] (ED50> 65.9µM), das durch seine anti-HIV-Wirksamkeit bekannt
wurde, noch weiter abnahm. Interessant erwies sich dagegen das dimere Ancistrogrif-
fithin A (10) [45] (ED50=0.85± 0.05 µM). Es besitzt, verglichen mit Michellamin B, zwei
O-Methylierungen mehr und seine Wirkung kommt der des Suramin (ED50=0.31±0.05
µM) sehr nahe. Für sein monomeres Ancistrogriffin C (11) (ED50>65.9 µM) konnte kei-
ne Wirkung nachgewiesen werden. Die Wirkung des strukturverwandten Ancistro-
griffin A mit tertiärer Amino-Gruppe (9) (ED50=14.1±1.3 µM) lag dagegen noch im
Wirkbereich von Eflornithin (ED50=22.9±4.6 µM). Ancistroealain A (12) (ED50=4.5 ±0.8
µM), einem der aktivsten Naphthylisochinolin-Alkaloide gegen Leishmania donovani,
zeigte mit seinen zwei Methoxy-Gruppen an einem Dihydroisochinolin-Gerüst eine
vergleichbare Aktivität mit Dioncophyllin A (1) (ED50=3.4±1.7 µM). Mit vollständig
dehydriertem Isochinolin-Gerüst wurden die beiden Substanzen ent-Dioncophyllein
A (13) und Dioncophyllein D (14) näher untersucht. Dioncophyllein D besitzt im Ge-
gensatz zu den bisher diskutierten Substanzen keine stabile Konfiguration und liegt
in der P- und M-Konfiguration im Gleichgewicht vor. Beide Substanzen wiesen ge-
genüber Dioncophyllin A eine um etwa eine Zehnerpotenz verminderte Wirksamkeit
auf. Um die Beeinflussung der antitrypanosomalen Aktivität durch O-Methylierung
der Hydroxy-Gruppe am Isochinolin-Gerüst und dessen Hydrierungsgrad zu unter-
suchen, wurden die synthetisierten Naphthalin-freien Substanzen (15-17b) getestet.
Dabei zeigte Substanz (15) mit seiner 1R,3R-Konfiguration am Tetrahydroisochinolin-
Ring keine Wirkung. Ebenso erwies sich das korrespondierende Dihydroisochinolin
(16a) als unwirksam. Das O-methylierte Pendant (16b) zeigte dagegen mit einem ED50-
Wert von 56.1±15.3 µM eine schwache Aktivität. Die Verstärkung der antitrypano-
somalen Wirksamkeit durch O-Methylierung konnte auch bei den 3S-konfigurierten
Analoga beobachtet werden (Substanzen (17a) und (17b)), wobei die Aktivität von
Substanz (17b) die Wirksamkeit von Eflornithin (ED50=22.9±4.6 µM) erreichte.
Fazit:
Eine gute antitrypanosomale Wirksamkeit mit einem ED50-Wert zwischen 3 und 4 µM
zeigten C,C-verknüpfte Naphthylisochinolin-Alkaloide
• mit einer oder zwei phenolischen Hydroxy-Gruppen und
• unabhängig vom Hydrierungsgrad des Isochinolin-Gerüstes.
Eine Abschwächung der Aktivität zeigte sich vor allem bei einer zu hohen Anzahl
freier Hydroxy-Funktionen.

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 73
MeO
MeO
Me
OH
Me
NH
Me
Me
7
6'
OH
OH
OMe
Me
R
R NH
Dioncophyllin A (1) Dioncophyllin B (2) Dioncophyllin C (3)
ED50 = 3.4 ± 1.7 µM
ED50 = 2.6 ± 0.4 µM
ED50 = 4.2 ± 2.3 µM
Me
HO
MeO
HO
HO
P
1' 7
OH
R
R NH
Me
Me
MeO OH
MeO
P 8'
5
Me
Me
HO
M
R
R
NH
OH
M
1' 7
Me
R
R
OH
OH
ED 50 = 48.6 ± 4.8 µM ED 50 = 45.8 ± 5.1 µM
MeO
HO
Me
R
R NH
Me
Me
Me
P
Dioncopeltin A (4) 5'-O-Demethyldioncophyllin A (5)
ED50 = 22.2 ± 5.1 µM
ED50 = 3.8 ± 1.3 µM
Korupensamin A (6) Korupensamin B (7)
8'
5
o
5'
HN
R
R
Me
Me
7
1'
OH
Me OH
M
OMe
R
R NH
Me
5'''
8''
OH
HO
OH
ED 50 > 65.9 µM
OH OMe
o
P
Me
P
1'
5
OH
OH
8'
5
OH
Michellamin B (8)
Me
Me
R
R NH
Me
2 OAc
OMe
R
R NH
Me
Me
Me

74 4. Ergebnisse und Diskussion
MeO
HO
HO
Me
OMe
Ancistrogriffin A (9)
ED50 = 14.1 ± 1.3 µM
MeO
HO
MeO
P
8'
5
P
OMe
1' 7
OMe
Me
S
N
Me
Me
ED 50 = 4.5 ± 0.8 µM
MeO
MeO
Me
Me
S
S NMe
Me
Ancistroealain A (12)
Me
OH
ED 50 = 50.9 ± 18.7 µM
R
R NH
OMe Me
(15) ED50 > 65.9 µM
Dioncophyllein D (14)
Me
6
8'
M
7
7'
Me
S NH
R
Me
HO 7'''
8'' M
OMe
OH
6''
6'
o
OMe OH
MeO
M 8'
7
Me
R
HN
S
Me
Ancistrogriffithin A (10)
ED 50 = 0.85 ± 0.05 µM
Me
N
Me
fast
RO
RO
OMe
OH
MeO
MeO
OMe Me
Me
MeO
HO
Me
R
N
OMe Me
Me
MeO
ED 50 > 65.9 µM
OH
MeO
7
1'
MeO OH
Me
8' 7
6
7'
ED 50 = 33.3 ± 20.3 µM
Me
Me
S
N
Ancistrogriffin C (11)
OH
P
Me
N
Me
ED 50 [µM]
Me
S
S NH
Me
Me
ent-Dioncophyllein A (13)
P
16
a
b
R
H
Me
8' 7
6
M
>65.9
56.1 ± 15.3
ED 50 [µM]
>65.9
21.7 ± 9.2
Abbildung 4.9: Antitrypanosomale Aktivität (T. b. b.) C,C-verknüpfter Naphthylisochinolin-Alkaloide
und Untersuchungen zum Isochinolin-Grundgerüst.
17
6
a
b
R
H
Me
N
Me

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 75
4.1.4.1.2 N,C-verknüpfte NIQs
Mit der Entdeckung der N,C-verknüpften Naphthylisochinolin-Alkaloide konnte
das Spektrum möglicher Verknüpfungsarten erweitert werden [31, 287]. Abbildung
4.10 zeigt die Substanz Ancistrocladinium B [35] mit ihrer quartären, kationischen
Isochinolin-Struktur als Trifluoracetat-Salz. Sie wurde aus einer Ancistrocladus Spezies
isoliert und steht wie das Dioncophyllein D in ihrer P- und M-Konfiguration im Gleich-
gewicht. Ihre antitrypanosomale Wirkung wurde zu einem ED50-Wert von 0.35±0.02
µM bestimmt und liegt damit im Wirkbereich des Suramin (ED50=0.31±0.05 µM).
MeO
OMe
N +
Me
-
TFA
S
P
2 6
Me
OH
OMe
Ancistrocladinium B(18)
ED 50 = 0.35 ± 0.02 µM
Me
slow
MeO
S
N +
Me
M
OMe
2 6
Me
HO Me
MeO
-
TFA
Abbildung 4.10: Ancistrocladinium B, ein Naphthylisochinolin mit C,N-Verknüpfung zwischen Naphthalin
und Isochinolin und ihre antitrypanosomale Aktivität gegen Trypanosoma brucei brucei.
ED 50 –Werte:
OMe
OMe
MeO
OMe
Me
N +
Me
R
MeO Br Cl Me
(19) (20) (21) (22) (23) (24)
2.0 ± 0.5 µM 0.50 ± 0.06 µM 0.39 ± 0.03 µM 3.0 ± 0.1 µM 3.1 ± 0.1 µM 1.1 ± 0.2 µM
(25) (26)
(27) (28)
(29)
0.29 ± 0.01 µM 0.33 ± 0.00 µM 0.02 ± 0.00 µM 0.03 ± 0.00 µM 0.03 ± 0.00 µM
Abbildung 4.11: Quartäre Isochinolin-Salze mit Hetero-Biaryl-Achse und ihre antitrypanosomale Aktivität
gegen Trypanosoma brucei brucei.
-
ClO 4

76 4. Ergebnisse und Diskussion
Die im Vergleich zu den C,C-verknüpften Biarylen wie Dioncophyllin A (1), B (2) und
C (3) 10-fach höhere Aktivität des Ancistrocladinium B (18) lockte zunehmendes In-
teresse an dieser N,C-verknüpften Substanzklasse. Um mehr Einsicht in die moleku-
laren Voraussetzungen für eine gute antitrypanosomale Wirkung zu bekommen, wur-
den die quartären Isochinolin-Salze in Abbildung 4.11 als Perchlorate getestet. Es han-
delt sich dabei um vollständig aromatische, von Ancistrocladinium B (18) abgeleite-
te Isochinolin-Analoga mit über eine N,C-Hetero-Biaryl-Achse verknüpften, einfachen
Aromaten. Untersucht wurden methoxy-, chlor-, brom- und methylsubstituierte Phe-
nyle sowie Naphthalin und Anthracen. Unter den Phenylen (Substanzen (19) bis (24))
zeigten alle Substanzen eine Aktivität im Wirkbereich des Nifurtimox (ED50=3.4±0.4
µM). Als besonders wirksam erwies sich die Methoxy-Substitution in ortho und meta-
Stellung im Phenylisochinolin (ED50=0.50±0.06 µM und 0.39±0.03 µM). Möglicher-
weise begünstigt diese Konformation die Wechselwirkung mit der Zielstruktur, die
bis jetzt jedoch unbekannt ist. Eine kontinuierliche Steigerung der Wirksamkeit konn-
te durch Substitution des aromatischen Phenyl gegen Naphthalin und Anthracen er-
reicht werden (Substanzen (25) bis (29)). Die vielversprechendste Wirkung zeigte das
Anthracen-substituierte Isochinolin mit einem, im Vergleich zu den Phenyl-Analoga,
um zwei Zehnerpotenzen niedrigeren ED50-Wert. Ursache liegt vermutlich in der zu-
nehmenden Lipophilie der Substanzen, wodurch die Aufnahme in die Zellen und das
Erreichen der Zielstrukturen begünstigt wird.
Fazit:
• N,C-verknüpfte Naphthylisochinolin-Alkaloide weisen im Vergleich zu C,C-
verknüpften eine höhere antitrypanosomale Aktivität auf.
• In der Reihe arylverknüpfter quartärer Isochinoline steigt die Wirksamkeit mit
höher kondensierten Aromaten.

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 77
4.1.4.2 Fluorchinolone
F
R7
6
7
R5
5
X 8
Abbildung 4.12:
Fluorchinolon
O O
4
N 1
R1
3
2
R2
OH
Fluorchinolone sind eine Klasse synthetischer Antibiotika.
Mit ihrem Chinolin-Gerüst sind sie den Isochinolinen struk-
turell sehr ähnlich. Ihre bakterizide Wirkung beruht auf
der Hemmung der DNA-Gyrase und Topoisomerase-II (Ab-
schnitt 4.3.3). Die Topoisomerase-II ist aber auch in Trypa-
nosomen ein Schlüsselenzym für Zellwachstum und Zelltei-
lung und eine In-vitro-Aktivität von Fluorchinolonen gegen
Trypanosomen konnte bereits in einigen Arbeiten gezeigt
werden [144].
Die bakterizide Aktivität der Fluorchinolone wird vor allem durch die funktionellen
Gruppen der R1-, R5- und R7-Substituenten bestimmt. Dabei erwiesen sich Substan-
zen mit einer Cyclopropan-, oder Difluor-phenyl-Gruppe in Position N1 und einem
Piperazin-Ring in Position 7 als besonders wirksam. Von dieser Information ausge-
hend wurden zur Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bezüglich der an-
titrypanosomalen Wirkung, die in Tabelle 4.2 gelisteten Fluorchinolone [139] gegen
Trypanosoma brucei brucei getestet. Untersucht wurde dabei der Einfluss verschiede-
ner Substituenten am Phenyl- und am Piperazin-Ring. Gute Aktivitäten im Wirkbe-
reich von Nifurtimox (ED50=3.4±0.4 µM) zeigten sich bei N1-phenyl-substituierten 4-
chinolonen ohne Substitution am Phenyl-Ring (30) mit einem ED50-Wert von 9.71±1.84
µM und nach para-Methylierung (36) ( ED50=2.66±0.07 µM) desselben. Vergleicht man
die Auswirkung der Methyl-Gruppe an unterschiedlichen Positionen, so nimmt die
Wirkung von der para- über die meta- zur ortho-Position hin kontinuierlich ab. In
ortho-Position war mit einem ED50-Wert von 62.58±5.76 µM nahezu keine Aktivität
mehr nachweisbar. Bei Substitution der Methyl-Gruppe gegen eine freie phenolische
Hydroxy-Funktion (Substanzen (45) und (46)) konnte in keiner Position eine Wirksam-
keit beobachtet werden. Die Reduktion der Aktivität durch Erhöhung des Anteils phe-
nolischer Hydroxy-Gruppen wurde bereits bei der Testung der Naphthylisochinolin-
Alkaloide festgestellt und diskutiert. Nach O-Methylierung der phenolischen OH-
Funktion (Substanzen (31) bis (33)), zeichnete sich auch hier wieder eine verstärkte
Wirkung ab, die sich analog zu den Substanzen (32) bis (34) in para-Position mit einem
ED50-Wert von 8.22±0.89 µM am effektivsten zeigte. CF3 und F-Substitution (Substan-
zen (37) bis (42)) führte zu einer Abschwächung der Wirkung, die jedoch noch für alle
drei Positionen im Wirkbereich des Eflornithin (ED50=22.9±4.6 µM) lag. Bei Einfügung
einer Nitro-Funktion (Substanzen (43) und (44)) wurde dagegen nur eine schwache
Wirksamkeit gemessen, die unter CN-Substitution (Substanzen (47) bis (49)) gänzlich
verschwand.
Die Frage ob eine zusätzliche Alkylierung des Piperazin-Ringes und damit eine Erhöh-
ung der Lipophilie zu einer Steigerung der antitrypanosomalen Aktivität führt, wur-

78 4. Ergebnisse und Diskussion
de an N1-phenyl-substituierten-4-chinolonen mit Methoxy-Substitution am Phenyl-
Ring untersucht (Substanzen (50) bis (52)). Hier konnte gegenüber unsubstituierten
Piperazin-Analoga keine signifikante Verbesserung gefunden werden.
Fazit:
• In der Gruppe der N1-phenyl-7-piperazin-substituierten Fluorchinolone wei-
sen Substanzen mit para-Methoxy- oder para-Methyl-Funktion die höchste an-
titrypanosomale Aktivität auf.
• Analog der Naphthylisochinolin-Alkaloide wird auch bei dieser Substanzgruppe
die Wirksamkeit durch Hydroxy-Substitution abgeschwächt.

4.1 Auf der Suche nach ”hits” zur Therapie der HAT 79
R2
N
F
N
6
7
8
5
R1
O
4
N 1
2
O
3 OH
Substanz R1 R2 T. b. b. ED50
[µM]
(30) H H 9.71±1.84
(31) o-OCH3 H 66.34±17.62
(32) m-OCH3 H 22.38±3.20
(33) p-OCH3 H 8.22±0.89
(34) o-CH3 H 62.58±5.76
(35) m-CH3 H 10.21±3.76
(36) p-CH3 H 2.66±0.07
(37) o-CF3 H 43.81±12.5
(38) m-CF3 H 28.74±2.67
(39) p-CF3 H 18.03±3.22
(40) o-F H 44.78±1.56
(41) m-F H 21.66±7.44
(42) p-F H 25.94±2.33
(43) m-NO2 H 59.21±6.65
(44) p-NO2 H 64.48±9.02
(45) m-OH H >65.9
(46) p-OH H >65.9
(47) o-CN H >65.9
(48) m-CN H >65.9
(49) p-CN H >65.9
(50) m-OCH3 CH3 23.59±8.41
(51) p-OCH3 CH3 19.62±2.67
(52) p-OCH3 C3H7 10.96±0.91
Tabelle 4.2: Fluorchinolone und ihre antitrypanosomale Aktivität.

80 4. Ergebnisse und Diskussion
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse in-
takter Mikroorganismen
Überblick:
Im Folgenden wird eine kapillarelektrophoretische (CE) Methode zur
Charakterisierung und Trennung verschiedener Bakterienstämme
und deren Agglomerate und Ketten entwickelt. Das Hauptaugen-
merk liegt auf der Standardisierung und Optimierung der Bakte-
rienproben, der Pufferlösungen und der CE-Bedingungen zur Eta-
blierung einer robusten, reproduzierbaren und präzisen Analyse-
Technik, die sich zur Weiterentwicklung als Zytotoxizitätstest eignet.
4.2.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels Kapillarelektro-
phorese
Die Eigenschaft von Bakterien Agglomerate und Ketten zu bilden ist zum einen bak-
terienspezifisch und zum anderen abhängig von der äußeren Umgebung. Für eine be-
stimmte Bakterienspezies ergibt sich daraus je nach pH, Ionenstärke und Zusammen-
setzung verschiedener Ionen eine charakteristische Größenverteilung verschiedener
Biokolloide im Größenbereich weniger µm [224]. Zusammen mit der Ladung der
Zelloberfläche bestimmt diese Größenverteilung die unterschiedlichen elektropho-
retischen Mobilitäten (Abschnitt 3.2.2.2). Die Ladung einer Zelle, von deren Hülle
hauptsächlich Aminosäurereste, geladene Zucker und Zuckerlipide nach außen ragen,
ist auch bei gleicher Elektrolytumgebung bei Gram-positiven und -negativen Bakte-
rien unterschiedlich. Dies ist in der verschiedenartigen Zusammensetzung der Zell-
wand begründet (Abschnitt 3.2.1.1). Neben der äußeren Umgebung bestimmt auch die
Alterung einer Zelle die äußere Ladung. Die Verteilung der elektrophoretischen Mo-
bilitäten kann somit zur Erstellung charakteristischer und bakterienspezifischer Peak-
muster genutzt werden. Die Anzahl, Reihenfolge und die Form der Signale im Elektro-
pherogramm charakterisieren dabei den elektrophoretischen Fingerabdruck (”finger-
print”). So muss z. B. eine Peakverbreiterung kein Fehler der Methode sein, sondern
kann durch die Größe und Form der detektierten Kolloide verursacht werden [77].
4.2.2 Auswahl verschiedener Bakterienstämme
Zur Entwicklung einer CE-Methode zur Trennung und Charakterisierung verschiede-
ner Bakterien, die sich zur Etablierung eines Zytotoxizitätstests für die Bestimmung
antibakterieller Wirksamkeiten potenzieller Wirkstoffe eignet, wurden die folgenden
Rahmenbedingungen an die auszuwählenden Bakterien gestellt:

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 81
1. Apathogene Bakterienstämme: Die Arbeiten fanden in einem Labor der Sicher-
heitsstufe 1 statt.
2. Unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, um einen Vergleich
verschiedener Wirksubstanzen zu ermöglichen.
3. Unterschiedliche elektrophoretische Eigenschaften, um den elektrophoretischen
Fingerabdruck verschiedener Bakterienstämme vergleichen zu können und die
elektrophoretische Trennung verschiedener Bakterienstämme zu ermöglichen.
Die ausgewählten Bakterien sollten sich somit in ihrer
• Oberflächenladung, verursacht durch die unterschiedliche Zellwandzusam-
mensetzung Gram-positiver und -negativer Bakterienstämme
• Größe und Form (Kokken und Stäbchen) einschließlich der Begeißelung,
wodurch eine Eigendynamik erzeugt wird
• Tendenz der Ketten- und Clusterbildung
unterscheiden.
Die Auswahl der Bakterienstämme zur Methodenentwicklung fiel auf Micrococcus lu-
teus, Pseudomonas fluorescens und Streptococcus vestibularis. Tabelle 4.3 zeigt eine Zu-
sammenfassung der mikrobiologischen Eigenschaften. Die Unterscheidung zwischen
Aerobiern und Anaerobiern spielt zwar für die elektrophoretischen Eigenschaften kei-
ne Rolle, ist aber für die Standardisierung der Bakterienkulturen in Abschnitt 4.2.4
maßgeblich.
Bakterium Gram- Form Geißeln Aerobier/
Färbung Anaerobier
M. luteus positiv Kokken unbeweglich strenge
unregelmäßige Cluster Aerobier
P. fluorescens negativ Stäbchen eine oder mehrere strenge
gekrümmte Ketten Geißeln Aerobier
S. vestibularis positiv Kokken unbeweglich fakultativ
unregelmäßige Ketten anaerob
Tabelle 4.3: Charakterisierung der zur Methodenentwicklung ausgewählten Bakterienstämme.

82 4. Ergebnisse und Diskussion
(a) Micrococcus luteus (b) Pseudomonas fluorescens (c) Streptococcus vestibularis
Abbildung 4.13: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen der zur Methodenentwicklung ausgewählten
Bakterienstämme, in der frühen stationären Phase. Bildgröße: 86.5 µm x 64.6 µm.
Bei allen Bakterienarten handelt es sich um apathogene Bakterienstämme mit natürli-
chem Vorkommen.
Die Gattung Micrococcus gehört wie die Gattung Staphylococcus zur Familie der Mi-
crococcaceae, besitzt im Gegensatz dazu aber keine humanpathogene Bedeutung. Sie
spielt als strenger Aerobier eine bedeutende Rolle in der menschlichen und tierischen
Haut- und Schleimhautflora und ist auch häufig in Staub und Wasser zu finden [204].
Wie in Abbildung 4.13a zu sehen, agglomerieren die unbeweglichen Gram-positiven
Kokken zu einer Vielfalt unregelmäßiger Cluster, die von einzelnen Zellen bis hin zu
Clustergrößen von 20 und mehr Zellen reichen.
Der Stamm P. fluorescens (Familie: Neisseriaceae) ist ein Bewohner von Pflanzen,
Feuchtstellen, Boden und Wasser. Neben seinem häufigen Vorkommen im Kranken-
hausmilieu, kann er auch als Entzündungserreger bei abwehrgeschwächten Patienten
gefunden werden [204]. Auch er ist strenger Aerobier und liegt neben gekrümmten
Ketten hauptsächlich in einzelnen Zellen vor, die sich durch eine oder mehrere Gei-
ßeln fortbewegen (Abbildung 4.13b). Seine Gram-Färbung ist negativ.
Bei der Bakterienspezies S. vestibularis (Familie: Streptococcaceae) handelt es sich um
unbewegliche Gram-positive Diplokokken, die auch kurze Ketten bilden können (Ab-
bildung 4.13c) und zur normalen menschlichen Mundschleimhautflora gehören [231].
4.2.3 Problematik
Die CE-Technik wurde ursprünglich für geladene Moleküle entwickelt. Die Anwen-
dung auf große, komplexe In-vivo-Systeme ist nicht unproblematisch. Herkömmliche
Vorgehensweisen bei der Methodenentwicklung können aufgrund der speziellen Ei-
genschaften mikrobieller Organismen nicht angewandt werden. Zum Erreichen re-
produzierbarer elektrophoretischer Fingerabdrücke mit hoher Auflösung (Abschnitt
3.4.1.4) müssen verschiedene Punkte bedacht werden [15]:
• Zellalter und Wachstumsphase der Bakterienstämme beeinflussen das Ober-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 83
flächenpotenzial, damit die Tendenz der Cluster- und Kettenbildung und wie-
derum das elektrophoretische Peakmuster [77].
• amphotere Oberflächenstruktur.
• Mikroorganismen sind sehr empfindlich gegenüber äußeren Einflüssen wie pH,
Ionenstärke und Sauerstoffgehalt, und lysieren unter ungünstigen Bedingungen
oder ändern ihre elekrophoretischen Eigenschaften. Die Auswahl des Puffers ist
damit erheblich eingeschränkt [205].
• Viele Mikroorganismen sondern unter anderem unter oxidativem Stress eine
Vielzahl von Substanzen ab. Diese können zu unbeabsichtigten Peaks führen,
und Zelllyse und Veränderungen in der Mobilität und Migrationszeit hervorru-
fen.
• Mikroorganismen neigen aufgrund ihrer geladenen Oberfläche mit den negativ
geladenen Silanolgruppen der Kapillarwand in Wechselwirkung zu treten und
an diese zu adsorbieren. Auch kann es zu Interaktionen zwischen den mikrobi-
ellen Partikeln kommen.
• Bezüglich der Partikelanzahl pro Volumen sind Bakteriensuspensionen im All-
gemeinen verdünnter als Lösungen chemisch definierter Moleküle, wodurch In-
jektionsprobleme verursacht werden können.
Aus diesen Gründen müssen neben der Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen
auch die Standardisierung und Optimierung der Bakterienkulturen und deren Pro-
benpräparation vorgenommen werden.
4.2.4 Standardisierung der Bakterienkulturen
4.2.4.1 Kultivierung
Die Kultivierung aller drei Bakterienspezies erfolgte in Brain-Heart-Infusion(BHI)-
Bouillon, einem Vollmedium für anspruchsvolle Keime, um möglichst schnelles
Wachstum zu begünstigen. Eine Temperatur von 30 ◦ C erwies sich als guter Kom-
promiss, um die Kultivierung aller drei Bakterienspezies in einem Brutschrank zu
ermöglichen. Dem unterschiedlichen Sauerstoffbedarf bei Aerobiern und Anaerobiern
(Abschnitt 3.2.1.2) wurde durch Verwendung unterschiedlicher Kultivierungsgefäße
Rechnung getragen. M. luteus wurde in 25 cm 3 Kulturflaschen mit luftdurchlässigem
Schraubverschluss bzw. bei einem größeren Zellansatz, in Erlenmeyerkolben auf ei-
nem Schüttler bei 150 rpm/min, P. fluorescens und S. vestibularis in 15 ml Kulturröhr-
chen mit Schraubverschluss bzw. in Erlenmeyerkolben ohne Schüttler kultiviert.

84 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.14: Wachstumskurven
von M. luteus, P.
fluorescens und S. vestibularis in
BHI-Bouillon bei 30 ◦ C durch
Auftragung der OD600-Werte
OD 600
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Micrococcus luteus
Pseudomonas fluorescens
Streptococcus vestibularis
0.0
0 5 10 15 20 25
gegen die Zeit. Zeit [h]
4.2.4.2 Wachstumskurven
In Abbildung 4.14 wurde die optische Dichte (OD) bei 600 nm für alle drei Bakterienar-
ten gegen die Zeit aufgetragen. Wie in Abschnitt 3.2.2.5 beschrieben zeigt der zeitliche
OD-Verlauf die verschiedenen Wachstumsphasen. Für die kapillarelektrophoretische
Analyse war vor allem der Zeitraum der stationären Phase relevant, in der die Zellen
zwar ihren Stoffwechsel einstellen, aber dennoch vital sind. In dieser Phase sollte die
chemische Umgebung der Zellen im Kulturmedium, ihre Oberflächenladung und ihre
Tendenz zur Ketten- und Clusterbildung bis zum Beginn der Absterbephase konstant
bleiben. S. vestibularis zeigte das schnellste Zellwachstum. Die stationäre Phase wurde
bereits nach 8 h erreicht, bei P. fluorescens und M. luteus dagegen erst nach 18 h bzw.
nach 24 h.
4.2.4.3 Kalibrierung
Die Bestimmung der Zellkonzentration durch Messung der optischen Dichte erfor-
dert zunächst die Korrelation zwischen Signal und Konzentration unter Erfassung der
Gesamtzellzahl. Da weder die mikroskopische Auszählung in einer Zählkammer noch
die elektronische Auszählung mittels Coulter-Counter möglich waren, musste die Zell-
zahl durch Auszählen der koloniebildenden Einheiten (colony forming units, CFU) er-
folgen, wodurch genaugenommen nur vermehrungsfähige Zellen berücksichtigt wur-
den. Näherungsweise kann man jedoch bei einer Kultur in der exponentiellen und
frühen stationären Phase von 100 % lebensfähigen Zellen ausgehen. Die genaue Ver-
suchsdurchführung ist im Experimentellen Teil in Abschnitt 5.1.7.2.4 beschrieben. OD
und Zellzahl korrelieren nach Abschnitt 3.2.2.4 nach einer Funktion 1. Ordnung. Für
eine Korrelationsfunktion f(x) = ax + b ergaben sich für M. luteus, S. vestibularis und

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 85
CFU/nl
500
400
300
200
100
Micrococcus luteus
Pseudomonas fluorescens
Streptococcus vestibularis
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
OD 600
P. fluorescens die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße R 2 :
M. luteus : f(x) = 353.45 · x + 11.82, R 2 = 0.92
P. fluorescens : f(x) = 337.86 · x − 27.30, R 2 = 0.97
S. vestibularis : f(x) = 311.61 · x − 3.67, R 2 = 0.97
Abbildung 4.15: Korrelation
zwischen OD600-Werten und
Zellzahl.
Die schlechteste Korrelation zeigte M. luteus. Die Ursache hierfür liegt vermutlich in
seiner vielfältigen Clusterbildung, denn die dem Verfahren der CFU-Auszählung zu-
grundeliegende Erwartung, dass aus jeder vermehrungsfähigen Zelle eine makrosko-
pisch sichtbare Kolonie entsteht, trifft in diesem Fall nicht mehr zu und führt zu syste-
matischen Fehlern. Dennoch stellten diese Kalibriergeraden gute Anhaltspunkte dar
und dienten zur Berechnung der Zellzahl bei allen weiteren Experimenten.
4.2.5 Trenntechnik
Die spätere Weiterentwicklung der Methode zur Bestimmung von Zytotoxizität stellte
auch Anforderungen an die kapillarelektrophoretische Trenntechnik. In der Literatur
sind derzeit zwei Techniken für eine Mikroben-Analyse beschrieben: Kapillarzonen-
elektrophorese (CZE) und Kapillarisoelektrische Fokussierung (CIEF) (Abschnitt 3.4).
Während in der CZE die Trennung verschiedener Analyten auf Unterschieden in den
elektrophoretischen Mobilitäten basiert, werden die Bakterien in der CIEF aufgrund
ihrer amphoteren Oberfläche und somit nach dem isoelektrischen Punkt getrennt. Auf-
grund der zur Toxizitätsbestimmung notwendigen Zellmarkierung mittels SYTO9 und
Propidiumiodid zur Ermittlung des lebend/tot-Verhältnisses der Bakterienpopulati-
on, war eine Auswirkung auf den isoelektrischen Punkt nicht auszuschließen, so dass
die CZE der CIEF als Trenntechnik vorgezogen wurde. Ferner sollten die verwendeten
Kapillaren beschichtet sein, um:

86 4. Ergebnisse und Diskussion
1. Den EOF zu eliminieren [126]: Ohne Modifikator ist der EOF sehr groß. Aufgrund
der geringen elektrophoretischen Unterschiede verschiedener Bakterien und ih-
rer Ketten und Agglomerate ist deren Trennung ohne Modifikator nur mit sehr
langen Kapillaren erreichbar (250 cm) [77, 86]. Anderenfalls werden alle Bakteri-
enspezies mit dem EOF eluiert [212].
2. Wandadsorptionen vorzubeugen [126].
Aufgrund der hohen Kosten für kovalent beschichtete Kapillaren, der mangelhaften
Reaktionskontrolle bei der Eigenherstellung und der schnellen Abnutzung sollte die
Methode der dynamischen Beschichtung angewandt werden (Abschnitt 3.4.6). Der
Vorteil liegt darin, dass es durch geeignete Spülmethoden gelingt, die Kapillare nach
jeder Trennung vollständig zu regenerieren und unmittelbar vor der nächsten Tren-
nung erneut zu beschichten (siehe Experimenteller Teil).
Desweiteren unterstützen die zugesetzten Polymere im Trennpuffer die Trennung ver-
schiedener Bakterienspezies, Agglomerate und Ketten aufgrund:
• Eines Siebeffektes bedingt durch die Erhöhung der Viskosität [15].
• Zusätzlicher Probenstabilität der Biokolloide in der Pufferlösung: Bei Partikel-
Partikel-Interaktionen führen die polymeren Ketten zur sterischen Abstoßung
(Abschnitt 3.2.2.3) [11, 259].
4.2.6 Entwicklung eines Trennpuffers
4.2.6.1 Überblick über literaturbekannte Puffersysteme
Aus den experimentellen Erfahrungen (Tabelle 4.4) der letzten 20 Jahre, in denen ver-
sucht wurde, die Analyse und Charakterisierung intakter Mikroorganismen mittels
Kapillarelektrophorese zu standardisieren und zu verbessern, ergeben sich auf der
Grundlage der dynamischen Beschichtung zur mikrobiellen Trennung im wesentli-
chen zwei grundlegend verschiedene Puffersysteme, mit denen eine Auflösung bis zu
850.000 theoretischer Böden/m (M. luteus [15]) erreicht wurde (Abschnitt 3.4.1.4):
1. Puffersystem nach Armstrong [15]: Der Trennpuffer besteht aus 0.56 mM Tris-
Borat, 0.013 mM Na2EDTA und 0.0125% gelöstem Poly(ethylen)oxid (PEO, Mr=
600.000, polymere Matrix zur Beschichtung) bei einem pH von 8.4. Die Io-
nenstärke des Puffers lag unter Berücksichtigung von Tris + , EDTA 3− und Na + bei
0.35 mM. Bei PEO handelt es sich um ein Polykondensationsprodukt der allge-
meinen Formel HO-(CH2-CH2-O-)nH. Es wird durch Mikroorganismen nicht an-
gegriffen und ist nicht empfindlich gegenüber Elektrolyten. Die Ethersauerstoff-
brücken, ebenso wie die endständigen Hydroxylgruppen, ermöglichen die Aus-
bildung von Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolwechselwirkungen. Die

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 87
heterogene Polymerlösung wurde in einer Konzentration von 0.5 % durch Ultra-
schallbehandlung für 4 h bei 55 ◦ C hergestellt. Die dynamische Viskosität betrug
danach 4.36 cP. Eine erfolgreiche kapillarelektrophoretische Analyse wurde an
den in Tabelle 4.4 gelisteten Bakterienspezies durchgeführt.
2. Puffersystem nach Shintani [243]: Der Trennpuffer enthält 0.1 M Tris, 0.1 M
Borsäure, 2 mM Na2EDTA, 0.2 % NaCl und 0.01 % Natrium-Alginat (polymere
Matrix zur Beschichtung) bei einem pH von 8.4 und zeigt damit eine Ionenstärke
von 122 mM. Die polymere Lösung wurde durch Rühren bei Raumtemperatur
über Nacht vollständig gelöst. Die Alginsäure besteht aus einer Kette von 1,4-
β-glykosidisch verknüpfter Mannuronsäure. Die Methode wurde an Salmonella
enteritidis und Salmonella typhimurium durchgeführt.
Scharfe Peaks und hohe Auflösung können somit entweder mit extrem verdünnten
oder extrem konzentrierten Tris-Borat-Puffern erreicht werden.
4.2.6.2 Eignung verschiedener Puffersysteme
In Abbildung 4.17 sind die Elektropherogramme von M. luteus, P. fluorescens und S.
vestibularis unter Verwendung der Puffersysteme nach Armstrong und Shintani ge-
genübergestellt. Da die stationäre Phase einer Bakterienkultur über mehrere Stunden
bis hin zu Tagen andauert, wurden die Proben bei allen drei Bakterienspezies nach
einer Inkubationszeit von 24 h entnommen. Die Proben wurden in Anlehnung an Re-
ferenz [53] in Wasser gewaschen und durch sanftes Pipettieren in Trennpuffer in ei-
ner Konzentration von 0.5 OD600 suspendiert (siehe Experimenteller Teil). Bei beiden
Methoden wurden die gleichen CE-Bedingungen verwendet: Quarzkapillare mit ei-
ner Gesamtlänge von 31.5 cm und einer Detektionslänge von 21 cm; dies war auf-
grund der Gerätemaße die kürzest mögliche Länge; konstant angelegte Spannung von
10 kV; Temperatur 23 ◦ C; anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes
von 0.5 psi für 10 s; Detektion bei 214 nm. Zur Detektion erwiesen sich aufgrund
der Korrelation der Mie-Streuung mit λ −3 kleine Wellenlängen (Abschnitt 3.2.2.4) als
besonders günstig (Abbildung 4.16). Während bei Micrococcus (Elektropherogramm
A, Abbildung 4.17b) im ersten Versuch mit beiden Puffersystemen scharfe Peaks er-
halten wurden, scheiterte die Anwendung des Puffersystems nach Shintani bei Strep-
tococcus (Elektropherogramm B, Abbildung 4.17b) und Pseudomonas (Elektrophero-
gramm C, Abbildung 4.17b). In beiden Fällen waren breite und teilweise aufgefächerte
Peakstrukturen zu erkennen. Bei Pseudomonas konnte mikroskopisch Zelllyse nach-
gewiesen werden, vermutlich bedingt durch die hohe Ionenstärke. Die Auflösung der
Elektropherogramme der Micrococcus-Spezies lag bei beiden Puffersystemen bei ca.
200.000 theoretischen Böden/m. Aufgrund der Kompatibilität aller drei relevanten
Bakterienspezies - auch der Streptokokken, die mit diesem System derzeit noch nicht

88 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.16: Pseudomonas-
Probe bei drei verschiedenen
Wellenlängen gemessen: 214 nm
(a) 400 nm (b) und 580 nm (c).
Für CE-Bedingungen und Probenpräparation
siehe Abbildung
4.17.
analysiert worden waren - mit dem Puffersystem nach Armstrong, wurde dieses als
Basis der Methodenentwicklung verwendet.

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 89
(a) Puffersystem nach Shintani
(b) Puffersystem nach Armstrong
Abbildung 4.17: Eignung verschiedener Puffersysteme zur kapillarelektrophoretischen Analyse von M.
luteus (A), P. fluorescens (B) und S. vestibularis (C) unter gleicher Probenpräparation: Bakterienernte nach
24 h; in Wasser gewaschen; durch Pipettieren in Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 suspendiert
und unter gleichen CE-Bedingungen: Quarzkapillare mit einer Gesamtlänge von 31.5 cm, einer
Detektionslänge von 21 cm; konstant angelegte Spannung von 10 KV; Temperatur 23 ◦ C; anodische
Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi für 10 s; Detektion bei 214 nm. Für CE-
Pufferzusammensetzung siehe Abschnitt 4.2.6.1

Tabelle 4.4: Überblick über literaturbekannte Puffersysteme [151].
Mikroorganismen Quarzkapillare Trennpuffer Ref.
Lactobacillus casei beschichtet mit 100 mmol/L Tris-Acetat,
Methylcellulose pH 7.5 [125]
Streptococcus pyrogenes, Streptococcus unbeschichtet TBE-Puffer, pH 9.5 [86]
agalactiae, Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis
Pseudomonas spezies, Pseudomonas putida, unbeschichtet TBE-Puffer, pH 9.6 [205]
Alcaligenes eutrophu, Rhodococcus erythropolis,
Methanobrevilbacter smithii
A1264, CD1, PL2W31 (Wasserbakterien) unbeschichtet 10 mmol/L MOPS-Puffer [107]
pH 7.02
Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, unbeschichtet Phosphat-Puffer, pH 7.0 [263]
Pseudomonas denitrificans, Acetobacter
pasteurianus, Acetobacter aceti,
Bifidibacterium longum, Serratia marcescens,
Sacharomyces cerevisiae
Pseudomonas fluorescens, Enterobacter unbeschichtet TBE-Puffer, pH 8.4 [15]
aerogenes, Micrococcus luteus, 0.0125% PEO als Modifikator [240]
Saccharomyces cerevisiae, Alcaligenes faecalis, [178]
Micrococcus lysodeikticus
90 4. Ergebnisse und Diskussion

Salmonella enterititis, unbeschichtet TBE-Puffer, [243]
Salmonella typhimurium 0.2% NaCl und 0.01% Na-Alginat
als Modifikator
Escherichia coli, Staphylococcus unbeschichtet TBE-Puffer, pH 9.0 [13]
saprophyticus 0.025% PEO als Modifikator
Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium unbeschichtet TBE-Puffer, pH 8.4 [12, 14]
infantis, Saccharomyces cerevisiae 0.0125% PEO als Modifikator [106]
Cellulomonas cartae, Agrobacterium unbeschichtet 20 mmol/L Borat-Puffer [286]
tumefaciens pH 9.3
[288]
Arthrobacter oxydans beschichtet mit 10 mmol/L Tris-HCl [269]
Polyvinylalkohol pH 7.1
Escherichia coli, Proteus beschichtet mit Tris-Puffer [53]
vulgaris, Bacillus cereus, Acrylamid pH 8.0
Pseudomonas fluorescens
Escherichia coli beschichtet mit 10 mmol/L TBE-Puffer [149]
Poly-N-hydroxy
-ethylacrylamid
4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 91

92 4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.6.3 Optimierung der Trennmethode
Trotz aller Bemühungen zeigten die Elektropherogramme der Mikroben unter Verwen-
dung der Methode nach Armstrong teilweise eine schlechte Auflösung und fehlende
Reproduzierbarkeit, die aber für den Einsatz der CE zur Zytotoxizitätsbestimmung
unerläßlich ist. Aus diesem Grund wurden nachfolgend
• die Pufferkonzentration
• die polymere Matrix
• und die Probenpräparation
variiert und für den Teststamm M. luteus optimiert.
4.2.6.3.1 Pufferkonzentration
Eine mögliche Ursache für die schlechte Auflösung und die fehlende Reproduzier-
barkeit war die extrem geringe Ionenstärke im Trennpuffer. Die daraus resultierende,
sehr geringe Stromstärke lag bei einer Spannung von 10 KV unter 1 µA, wodurch sich
natürliche Schwankungen in der Temperatur, Spannung oder Wasserreinheit leicht be-
merkbar machten. Gegen eine Erhöhung der Pufferkonzentration spricht jedoch die
dadurch sinkende Mobilität des EOFs (Abschnitt 3.4).
In wässriger Lösung sind Mikroben meist negativ geladen. Bei anodischer Injektion
und konventioneller Polung (Abschnitt 3.4) würden die Biokolloide alleine aufgrund
ihrer elektrophoretischen Mobilität überhaupt nicht durch die Kapillare wandern. Ist
der EOF jedoch groß genug, zieht er die Probenzonen am Detektor vorbei. Der EOF
liefert bei Mikroben den wesentlichen Beitrag zur Analysenzeit, denn aufgrund der
großen Masse m der Mikroorganismen ist ihre Beschleunigung a aufgrund des elektri-
schen Feldes E (Fel = q · E = m · a) sehr klein und damit auch ihre Gleichgewichtsge-
schwindigkeit vel.
Zur Festlegung eines sinnvollen Konzentrationsbereiches des Trennpuffers wurde zu-
nächst der Einfluss verschiedener Pufferkonzentrationen auf den EOF analysiert. Dazu
wurde eine Stammlösung mit 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2EDTA (siehe Expe-
rimenteller Teil) zu verschiedenen Konzentrationen verdünnt und jeder Verdünnung
0.0125 % PEO 600.000 als Modifikator zugesetzt. In Abbildung 4.18 ist der EOF, mar-
kiert durch Benzylalkohol, in Abhängigkeit von der Pufferkonzentration und Ionen-
stärke dargestellt. Die verwendeten Pufferlösungen (A-I) sind in Tabelle 4.5 gelistet.
Die Elektrolyte wurden im Konzentrationsbereich von 0.11 mM Tris-Borat und 0.003
mM Na2EDTA bis 3.90 mM Tris-Borat und 0.088 mM Na2EDTA eingesetzt. Während
sich der EOF bei einer Ionenstärke zwischen 0.069 mM und 0.49 mM kaum änderte und
bei ca. 3 Minuten lag, fiel er ab einer Ionenstärke >0.69 mM stark ab und benötigte bei
einer Ionenstärke von 2.43 mM bereits nahezu 10 Minuten. Der interessante Konzentra-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 93
Pufferbezeichnung Ionenstärke Tris-Borat Na2EDTA
[mM] [mM] [mM]
A 0.069 0.11 0.0025
B 0.349 0.56 0.0125
C 0.486 0.78 0.0175
D 0.693 1.11 0.0250
E 1.041 1.67 0.0375
F 1.390 2.22 0.0500
G 1.733 2.78 0.0625
H 2.083 3.34 0.0750
I 2.426 3.89 0.0875
Abbildung 4.18: Auswirkung
verschiedener TBE-Puffer-Konzentrationen
(A-I) auf den EOF.
Als EOF-Marker wurde eine
0.00005% Benzylalkohol enthaltende
Pufferlösung verwendet.
Für CE-Bedingungen siehe Abbildung
4.17.
Tabelle 4.5: Definition der in Abbildung 4.18 verwendeten TBE-Trennpuffer
tionsbereich lag somit bei einer Ionenstärke zwischen 0.069 mM und 0.486 mM, d. h.
zwischen Puffer A und C. Nachfolgend wurde der Einfluss der drei verschiedenen Puf-
ferkonzentrationen (A, B und C) auf die Trennung von M. luteus getestet (Abbildung
4.19). Die Pufferlösung mit der höchsten Verdünnung (Puffer A) führte zu einer einzi-
gen breiten Bande, die vermutlich durch das Platzen von Zellen aufgrund zu geringer
Ionenstärke des verwendeten Trennpuffers bedingt ist. Bei Erhöhung der Pufferkon-
zentration zeigten die Elektropherogramme einige sehr schmale Signale mit zunächst
schlechter Auflösung (Puffer B), welche durch Einsatz der dritten Pufferlösung (Puf-
fer C) mit 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2EDTA verbessert werden konnte.
Diese Pufferlösung erwies sich als optimal für eine Trennung unterschiedlich großer
Agglomerate, zumal eine hohe Ionenstärke wie z. B. bei Puffer I zu einer erheblichen
Verlängerung der Migrationszeit führte und kein Signal unter 40 Minuten beobachtet

94 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.19: Auswirkung
verschiedener TBE-Puffer-Konzentrationen
auf die Trennung
unterschiedlich großer Aggregate
von M. luteus. Der
Trennpuffer enthielt 0.0125 %
PEO mit (A) 0.11 mM Tris-Borat
und 0.003 mM Na2EDTA,
(B) 0.56 mM Tris-Borat und
0.013 mM Na2EDTA, (C)
0.78 mM Tris-Borat und
0.018 mM Na2EDTA, bei einem
pH-Wert von 8.7. Für
CE-Bedingungen und Probenpräparation
siehe Abbildung
4.17.
Abbildung 4.20: Auswirkung
der hohen Ionenenstärke des
TBE-Puffers I auf die Migrationszeit
von M. luteus. Der
Trennpuffer enthielt 0.0125 %
PEO mit 3.89 mM Tris-Borat und
0.0875 mM Na2EDTA bei einem
pH-Wert von 8.7. Für CE- und
Probenbedingungen siehe Abbildung
4.17.
werden konnte (Abbildung 4.20).
⇒ Die Zusammensetzung des Trennpuffers wurde auf 0.78 mM Tris-Borat und
0.018 mM Na2EDTA optimiert. Die Lösung enthielt 0.0125 % PEO und ergab einen
pH von 8.7
4.2.6.3.2 PEO Konzentration und Viskosität
Zur dynamischen Beschichtung wird nach Armstrong 0.0125 % PEO 600.000 als po-
lymere Matrix verwendet. Dazu verdünnt man eine 0.5 %ige PEO-Stammlösung, die
zum effizienteren Lösen einer vierstündigen Ultraschallbehandlung ausgesetzt wird.
In der Routine-Herstellung zeigten sich jedoch Probleme in der Reproduzierbarkeit
der Viskosität der polymeren Lösung. In Abbildung 4.21 sind die Elektropherogram-
me a und b zweier identisch präparierter M. luteus-Proben unter Verwendung der bei-
den PEO-Lösungen 1 und 2, hergestellt nach der gleichen Vorgehensweise, dargestellt.
Das Elektropherogramm a zeigt zwar mit ca. 400.000 theoretischen Böden/m eine gu-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 95
Abbildung 4.21: Polymerherstellung
als Ursache für
fehlende Reproduzierbarkeit
am Beispiel von M. luteus-
Elektropherogrammen. PEO
600.000 wurde in beiden Fällen
durch vierstündige Ultraschallbehandlung
zu einer Konzentration
von 0.5 % vollständig
gelöst. Der Trennpuffer enthielt
0.0125 % PEO mit 0.78 mM Tris-
Borat und 0.018 mM Na2EDTA,
bei einem pH-Wert von 8.7. Für
CE-Bedingungen und Probenpräparation
siehe Abbildung
4.17.
te Trennleistung aber keine Selektivität. Dagegen erfüllt Elektropherogramm b beide
Bedingungen.
Rheologische Untersuchungen mittels Rotationsviskosimeter zeigten im Scherbereich
von 1 bis 1000 1/s Unterschiede zwischen den beiden PEO-Stammlösungen. Beide
Lösungen wiesen zwar Newtonsches Verhalten auf, unterschieden sich aber in ihrer
berechneten Viskosität (PEO-Lösung 1 zu 3.5 mPas, Lösung 2 zu 4.8 mPas). Vermut-
lich ist eine zu geringe Viskosität der PEO-Lösung 1 verantwortlich für die schlechte
Auflösung in Elektropherogramm a. Die Hauptfehlerquelle während der Herstellung
der Polymerlösung liegt in der langen Ultraschallbehandlung. Über diese Zeit kann
sich das Bad sehr stark aufheizen und bei fehlender Kühlvorrichtung, wie es bei uns
der Fall war, zum Aufbrechen der langen PEO-Ketten führen. Da die hocheffizien-
te Trennung der Armstrong-Methode, nicht nur über die Viskosität bestimmt wird,
sondern auch über die Chemie des PEOs an sich [11], sollte das Polymer selbst nicht
substituiert werden. So wurde in einigen Publikationen zur Aufklärung der Methode
der Trennung, PEO aufgrund seiner Hydrophilie ein additiver fokussierender Effekt
der Probenzonen zugesprochen, welcher bei Substitution von PEO mit Glycerol trotz
gleicher Viskosität ausblieb [11, 106].
Um höhere Reproduzierbarkeit des Trennsystems zu erreichen, wurde zunächst nie-
dermolekulares PEO als Additivum zum Trennpuffer eingesetzt. Interessant war vor
allem der niedermolekulare Bereich von 400 bis 4000, da hier PEOs flüssig und mit
Wasser mischbar sind. In Abbildung 4.22 sind die Elektropherogramme a bis d un-
ter Zusatz von PEO 400 und 4000 in unterschiedlichen Konzentrationen dargestellt.
Während mit PEO 400 in einer Konzentration von 0.05 % (Elektropherogramm a) kei-
ne Abtrennung der M. luteus-Cluster vom EOF erzielt wurde, verbesserte sich die
Auflösung zunehmend bei Erhöhung der Konzentration auf 0.5 % und 5 % (Elek-

96 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.22: Elektropherogramme
von M. luteus.
Verschiedene Konzentrationen
unterschiedlich langkettiger
PEOs wurden als Modifikatoren
zum dynamischen Beschichten
der Kapillare eingesetzt: 0.05 %
PEO 400 (a), 0.5 % PEO 400
(b), 5 % PEO 400 (c) und 1 %
PEO 4000 (d). Für Trennpuffer,
CE-Bedingungen und Probenpräparation
siehe Abbildung
4.21.
tropherogramm b und c). Keine signifikante Verbesserung brachte der Einsatz von
PEO 4000 bei einer Konzentration von 1 % (Elektropherogramm d). Bei einer weite-
ren Erhöhung der Konzentration auf 10 % konnte dagegen in einer Zeitspanne von
60 Minuten kein Signal detektiert werden. Das beste Ergebnis wurde mit PEO 400 bei
einer Konzentration von 5 % erreicht. Doch stellte sich, vermutlich durch die kurzen
PEO-Ketten eine schlechte Reproduzierbarkeit bei der dynamischen Beschichtung der
Kapillare heraus, so dass dieser Lösungsansatz scheiterte. Es wurde somit nach einem
besser zu kontrollierenden Lösungsverfahren für PEO 600.000 gesucht. Als geeignet
erwies sich das Lösen in einem auf 30 ◦ C temperierten Schrank für mindestens 12 h.
Rheologische Untersuchungen zeigten für die 0.5 %ige polymere Stammlösung eine
reproduzierbare Viskosität von 5.0±0.2 mPas.
⇒ Zur Herstellung der polymeren Matrix wurde PEO 600.000 in einer Konzentration
von 0.5 % bei 30 ◦ C für mindestens 12 h gelöst. Die Lösung zeigte eine reproduzierbare
Viskosität von 5.0±0.2 mPas.
4.2.6.3.3 Probenpräparation
Für eine erfolgreiche CE-Analyse von Mikroorganismen ist neben der CE-Methode vor
allem die Probenpräparation relevant, denn Ladung, Größe und Form der Mikroben
ändern sich mit den experimentellen Bedingungen [224]. Generell sind zwei präpara-
tive Schritte zur Herstellung der Bakterienproben notwendig:
1. Waschen der Bakterienzellen zur Entfernung von Kulturmedium.
2. Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer.
In Abbildung 4.23 ist der Stromverlauf während der CE- Analyse der beiden Micrococ-
cus-Proben a und b gezeigt. Probe a wurde mit physiologischer Kochsalzlösung gewa-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 97
Abbildung 4.23: Vergleich der
Stromverläufe während der
Micrococcus-Analyse nach
Waschung der Bakterienzellen
(a) mit physiologischer
Kochsalzlösung (0.9%) und
(b) mit Millipore-Wasser zur
Entfernung des Kulturmediums.
Beide Bakterienproben wurden
nach einer Inkubationszeit von
24 h präpariert und nach der
Waschung in einer Konzentration
von 0.5 OD600 in Trennpuffer
resuspendiert. Für Trennpuffer
und CE-Bedingungen, siehe
Abbildung 4.21
schen, Probe b dagegen mit Millipore-Wasser. Anschließend wurden beide Proben in
Trennpuffer in einer Konzentration von 0.5 OD600 resuspendiert. Der Stromverlauf von
Probe a steigt unmittelbar nach der Injektion an und fällt nach einer Minute wieder ab.
Dagegen bleibt der Strom bei Probe b nahezu konstant. Für den initialen Stromanstieg
in Probe a sind vermutlich an die Zellmembran adsorbierte Na + - und Cl − -Ionen ver-
antwortlich, wodurch die Leitfähigkeit erhöht wird und damit der Strom ansteigt. Un-
ter diesen Bedingungen konnte jedoch kein Signal detektiert werden. Der bei beiden
Proben beobachtete kontinuierliche Stromabfall kann unter Umständen an der Ände-
rung der Elektrolytzusammensetzung unter dem Einfluss des elektrischen Feldes lie-
gen, welche durch die geringe Ionenstärke besonders begünstigt wird oder an Ab-
lagerungen an der Kapillarwand. Neben diesen elektrostatischen und -dynamischen
Einflussfaktoren führen auch Änderungen in der mechanischen Beanspruchung der
Probe zu unterschiedlichen Elektropherogrammen. Abbildung 4.24 zeigt drei charak-
teristische Elektropherogramme a-c des Teststammes M. luteus mit unterschiedlichen
Resuspendierungsverfahren. Sanfte Resuspendierungsverfahren wie Rühren oder Pi-
pettieren führten häufig zu fehlender Refokussierung der Zellsignale (Elektrophero-
gramm a). Vermutlich treten bei ungenügender Resuspendierung Lufteinschlüsse in
der Probensuspension auf, die das Peakmuster stören. Ähnliche Ergebnisse wurden
in Dai et al. [73] für den Teststamm Escherichia coli unter Verwendung eines 150 mM
Tris-Borat-Puffers beschrieben.
Elektropherogramm b zeigt nach einer einminütigen Ultraschallbehandlung bei 120 W
und 35 kHz hauptsächlich Einzelzellen, während in Elektropherogramm c nach ein-
minütigem Vortexen die Micrococcus-Cluster in schmalen Peaks voneinander getrennt
sind. Untersuchungen zur Stärke und Zeit des Vortexens zeigten keine signifikanten
Änderungen. Letztendlich konnte eine scharfe Trennung verschiedener Aggregate nur

98 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.24: Messung einer
M. luteus-Probe (a) ohne
einminütigem Vortexen (b) mit
einminütiger Ultraschallbehandlung
(c) mit einminütigem Vortexen
vor der Injektion. Die Bakterienproben
wurden nach einer
Inkubationszeit von 24 h
präpariert, in H2O gewaschen
und in einer Konzentration von
0.5 OD600 in Trennpuffer resuspendiert.
Für Trennpuffer und
CE-Bedingungen, siehe Abbildung
4.21.
durch einminütiges Vortexen erreicht werden. Eine Ultraschallbehandlung führte da-
gegen in unserem Experiment zur Dispersion der Aggregate. Unter Verwendung eines
5 mM Phosphat-Puffers beobachteten Buszewski et al. [53] bereits durch Schütteln der
Bakterienprobe eine Zunahme an Einzelzellen. Die Auswirkung verschiedener Vorbe-
handlungen auf die Zellpopulation scheint somit extrem von den die Bakterienzellen
umgebenden Elektrolyten abhängig zu sein.
⇒ Optimierte Probenpräparation: Reinigung der Bakterienzellen von Medium in
Millipore-Wasser; Resuspendieren der Zellen in Trennpuffer durch einminütiges Vor-
texen.
4.2.6.3.4 Probenkonzentration
Routinemessungen zeigten, dass die CE-Methode hohe Zellkonzentrationen erfordert.
In Abbildung 4.25a sind die elektrophoretischen Fingerabdrücke von M. luteus in Ab-
hängigkeit der Konzentration dargestellt. Im Falle geringer Bakterienkonzentrationen,
d. h. im OD600-Bereich zwischen 0.2 und 0.3 (Zellkonzentration: 9 x 10 7 - 14 x 10 7 Zel-
len/ml, Elektropherogramme A und B in Abbildung 4.25a), ist nur ein Signal mit
Migrationszeiten über 15 Minuten detektierbar. Mit zunehmender Zellkonzentration
werden die Peaks schmaler und zahlreicher, einhergehend mit kürzeren Migrations-
zeiten (Elektropherogramm C). Die Elektropherogramme D und E spiegeln bei einer
Zellkonzentration ≥ 0.5 OD600 (≥2.3 x 10 8 Zellen/ml) die vielfältigen Cluster in der
Bakterienpopulation wider, wobei bei einer Konzentration von 0.6 OD600 bereits durch
Überladung der Kapillare Peakverbreiterungen auftreten.
Ähnliche Resultate wurden durch Variation der Injektionszeiten bei 0.5 psi und einer
Zellkonzentration von 0.5 OD600 erreicht. In Abbildung 4.25b sind die entsprechenden
Elektropherogramme nach einer Injektionszeit von 1, 4, 7, 10 und 13 Sekunden dar-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 99
(a) Variation der Probenkonzentration. Injiziert wurde für 10 s bei 0.5 psi.
(b) Eine Bakterienprobe mit einer Konzentration von 0.5 OD600 wurde bei einem
Druck von 0.5 psi unterschiedliche Zeiten injiziert.
Abbildung 4.25: Abhängigkeit der Elektropherogramme der Micrococcus-Spezies von der injizierten
Zellmenge. Die Bakterien wurden für 24 h inkubiert, in Wasser gewaschen, in Trennpuffer mittels einminütigem
Vortexen suspendiert. Für Trennpuffer und CE-Bedingungen, siehe Abbildung 4.21.

100 4. Ergebnisse und Diskussion
gestellt. Bei einer Injektion von 1 s und 4 s zeigte sich ähnlich wie unter Verwendung
geringer Bakterienkonzentrationen ein Signal mit langer Migrationszeit. Zur Detektion
der verschiedenen Cluster in der Micrococcus-Population erwies sich eine Injektions-
zeit von mindestens 7 Sekunden als notwendig. Auch hier zeigten sich bei einer Injek-
tionszeit von 13 s bereits Peakverbreiterungen. Die Konzentrationsabhängigkeit der
Elektropherogramme wird vermutlich durch Wechselwirkungen zwischen Zelle und
PEO-Beschichtung und einer dadurch hervorgerufenen unkontrollierten Adsorption
verursacht. Diese Hypothese konnte durch Untersuchungen zur Linearität bestätigt
werden (Abschnitt 4.2.11.1)
⇒ Die Probenkonzentration wurde auf einen OD600-Wert von 0.5 standardisiert.
4.2.6.4 Mechanistische Betrachtung
2002 untersuchten Armstrong et al. [11] den Mechanismus ihrer CE-Methode, durch
welche die erste hochaufgelöste Trennung von Mikroben möglich wurde. Unklar war
die Rolle der hydrophilen polymeren Additiva, wie PEO, deren Effekt auf die Migra-
tionszeit und Auflösung durch Viskositätserhöhung und Reduktion des EOF allein,
nicht erklärt werden konnte. Für die Fokussierung der Probenzonen unter PEO-Zusatz
wurden die folgenden drei Hauptfaktoren als maßgeblich definiert:
• Gelöstes polymeres Additivum im Trennpuffer
• Elektrisches Feld
• Elektroosmotischer Fluss in Gegenrichtung zur elektrophoretischen Mobilität
Es konnte mittels CCD-Kamera gezeigt werden, dass vor allem der letzte Punkt, der zu
einer Art “sample stacking” führt, während der Wanderung der Mikroben in der Ka-
pillare eine Verengung des anfänglich 2 cm großen Injektionsplugs in eine Bande von
0.1 cm bewirkt (Abbildung 4.26). Es stellte sich jedoch heraus, dass der fokussierende
Effekt während der gesamten Bewegung durch die Kapillare fortbesteht. Für Aggrega-
tion und Fokussierung von Kolloiden in Lösung unter dem Einfluss eines elektrischen
Feldes bestehen derzeit die folgenden drei Mechanismen:
• Feld-induzierte Aggregation, welche durch die Partikelpolarisation bestimmt
wird. Die Bakterien richten sich dadurch wie ein induzierter elektrischer Dipol
aus und interagieren miteinander.
• Das “hairy-particle-model”: Durch die rauhe Partikeloberfläche kann die Mobi-
lität kleiner Ionen beeinflusst werden, wodurch die Leitfähigkeit im Probenplug

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 101
verringert ist, und sich zwei entgegengesetzte Ladungen am Anfang und am En-
de der Probenzone ausbilden können [96, 196, 215].
• Formabhängige Mobilität: Nichtsphärische Partikel und Aggregate haben in Ab-
hängigkeit ihrer Orientierung unterschiedliche Mobilitäten. Dieser Mechanismus
macht sich zum Beispiel bei stäbchenförmigen Bakterien bemerkbar, deren Ori-
entierung im Feld nach der Injektion zunächst zufällig ist. Durch ihre unter-
schiedliche Ausrichtung besitzt die Probe eine Geschwindigkeitsverteilung, wo-
durch es zu Zusammenstößen verschiedener Partikel kommt.
Abbildung 4.26: Unerlässliche
Bedingung für Fokussierung
mikrobieller Probenzonen:
Elektroosmotischer Fluss in
Gegenrichtung zur elektrophoretischen
Mobilität.
Eine mögliche Begünstigung der Fokussierung durch PEO ließe sich z.B. durch die Be-
einflussung der Polarisation durch Adsorption erklären [11]. Betrachtet man jedoch
das konzentrationsabhängige Peakmuster in Abbildung 4.25, gelang eine Fokussie-
rung der Bakterien erst ab einer bestimmten Zellzahl im Injektionsplug. Nach dem
Hagen-Poiseuilleschen Gesetz (4.1) genähert, errechnete sich mit den standardisierten
CE-Bedingungen (dynamische Viskosität des Puffers: 5 mPas, Kapillarradius: 50 µm,
Länge der Kapillare: 100 µm, Injektionsdruck: 0.5 psi, Injektionszeit: 10 s und Zellkon-
zentration: 2.3 x 10 8 Zellen/ml) das Injektionsvolumen zu 16.9 µl und die injizierte
Zellzahl zu 3892.
V
t
π · r4
= ∆p (4.1)
8 · η · L
V : Injektionsvolumen
t : Injektionszeit
r : Kapillarradius
η : dyn. Viskosität der Probe (angenähert durch Pufferviskosität)
L : Kapillarlänge
Daraus ergibt sich die Option, dass neben elektrostatischen und -dynamischen Aspek-
ten auch mechanische Gründe für eine Fokussierung mikrobieller Banden in Frage
kommen können. Diese könnten im Kräftegleichgewicht zwischen antreibender Kraft
der durch den EOF bewegten Zellmasse und der Bremskraft, bedingt durch Adsorpti-
onskräfte zwischen Zellen und PEO und der Viskosität im Trennpuffer, liegen.

102 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.27: Wiederholte Messungen der gleichen M. luteus-Probe unter Verwendung des gleichen
Pufferansatzes. Bei jeder Trennung wurde ein neues Puffergefäß der gleichen Puffercharge verwendet.
Für Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25
4.2.7 Reproduzierbarkeit
Zur Eignung und Weiterentwicklung der CE-Methode zur Bestimmung der Aktivität
antibiotischer Substanzen ist vor allem die Reproduzierbarkeit der elektrophoretischen
Fingerabdrücke in qualitativer und quantitativer Hinsicht maßgeblich. Wiederholmes-
sungen der gleichen Bakterienprobe von M. luteus zur Untersuchung der Präzision
bezüglich der Quantifizierung und der Migrationszeiten fielen jedoch selbst unter
Verwendung der in den letzten Abschnitten optimierten CE- und Probenbedingun-
gen enttäuschend aus. Die Trennungen wurden zwar mit dem gleichen Pufferansatz
durchgeführt, doch wurden für jede Trennung neue Puffervials verwendet, so dass die
fehlende Reproduzierbarkeit nicht durch die Änderungen in der Elektrolytzusammen-
setztung aufgrund der hohen anliegenden Spannung begründet werden konnte. Das
von Trennung zu Trennung sich sowohl in Signalanzahl, Migrationszeit als auch in
Signalintensität ändernde Peakmuster ist in Abbildung 4.27A dargestellt. Abbildung
4.27B zeigt einen neben den variierenden Elektropherogrammen beobachteten konti-
nuierlichen Stromanstieg, welcher möglicherweise die Ursache für die schlechte Re-
produzierbarkeit ist, und durch die Zunahme der Ionenstärke hervorgerufen wird.
Diese kann sowohl durch Zelllyse in der Probensuspension als auch durch Instabilität
der Pufferlösung bedingt sein. Eine weitere mögliche Ursache für die fehlende Repro-
duzierbarkeit der Elektropherogramme liegt im Alterungsprozess der Zellen selbst.
Durch Änderungen der Oberflächenladung und vermehrter Clusterbildung ändert
sich das Größe-zu-Ladungsverhältnis und damit die elektrophoretische Mobilität. Um
den Beitrag von Pufferlösung und Zellalterung zu bestimmen, wurden die folgenden

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 103
Experimente durchgeführt:
4.2.7.1 Pufferinstabilität
Wiederholte CE-Messungen wurden an reiner Pufferlösung in Abwesenheit suspen-
dierter Zellen vorgenommen. Dazu wurde für jede Trennung Puffer aus einem neuen
Vial aber von der gleichen Puffercharge verwendet. Von Messung zu Messung stieg
auch hier der Strom kontinuierlich, wodurch es einen ersten Hinweis für die Un-
beständigkeit des Puffers über mehrere Stunden gab. Ein Vergleich der pH-Werte und
Leitfähigkeiten von Pufferlösungen unter inerter Argon-Atmosphäre und Pufferlösun-
gen, bei welchen durch Rühren Begasung mit Luft-Atmosphäre stattfand, ist in Abbild-
ung 4.28 dargestellt.
pH
9.2
9.0
8.8
8.6
8.4
8.2
8.0
7.8
7.6
unter Sauerstoffzufuhr
inerte Atmosphaere
0 1 2 3 4 5 6 7
time [h]
(a) pH-Verlauf über die Zeit.
S/cm]
µ
conductivity [
50
45
40
35
30
25
20
15
unter Sauerstoffzufuhr
inerte Atmosphaere
10
0 1 2 3 4 5 6 7
time [h]
(b) Verlauf der Konduktivität über die Zeit.
Abbildung 4.28: Zeitlicher Verlauf der Instabilität des Trennpuffers
Während die Pufferlösung unter inerter Atmosphäre nur eine sehr langsame Verände-
rungen der Leitfähigkeit und des pH-Wertes zeigt, führt Begasung und damit ein ver-
stärkter CO2-Gasaustausch zu einem raschen Anstieg der Ionenstärke und einem ra-
schen pH-Abfall. Vermutlich erhöht gelöstes CO2 im Puffer (CO2 + H2O ⇒ HCO − 3 +
H + ) die Protonenkonzentration und führt damit, bedingt durch den schwach molaren
Trennpuffer, zum Überschreiten der Pufferkapazität und zu einem pH-Wert-Abfall.
⇒ Es empfiehlt sich deshalb die Pufferlösung unmittelbar vor jeder Trennung neu her-
zustellen.
4.2.7.2 Probeninstabilität
Unter Verwendung eines unmittelbar vor jeder Trennung neu hergestellten Puffers
wurden CE-Messungen der gleichen Micrococcus-Probe viermal hintereinander wie-
derholt (Elektropherogramme 1-4 in Abbildung 4.29). Bei gleichbleibendem Strom

104 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.29: Wiederholte
Messungen der gleichen M.
luteus-Probe. Bei jeder Trennung
wurde eine neu hergestellte
Pufferlösung verwendet. Für
Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen,
siehe Abbildung
4.25.
zeigten sich auch hier von Experiment zu Experiment Unterschiede im elektrophoreti-
schen Fingerabdruck. Als Hauptursache werden Änderungen der Oberflächenladung
vermutet, zumal eine visuelle mikroskopische Analyse keine signifikanten Änderun-
gen in der Clusterverteilung erkennen ließ.
⇒ Es erwies sich als notwendig, neben neu hergestellten Pufferlösungen auch neu
hergestellte Probensuspensionen für jede Trennung zu verwenden.
4.2.7.3 Elektrophoretische Heterogenität
In Abbildung 4.30 sind die Elektropherogramme einer Micrococcus-Probe an fünf auf-
einanderfolgenden Tagen unter den jetzt standardisierten Bedingungen dargestellt.
Repräsentativ für alle Messungen wurde der EOF mit Benzylalkohol im Elektrophe-
rogramm des fünften Tages markiert. Die Elektropherogramme zeigen scharfe, gut ge-
trennte Signale, die sich jedoch im Muster erneut von Trennung zu Trennung unter-
scheiden. Trennpuffer und Zellalterung konnten als Ursache ausgeschlossen werden.
Mögliche Ursachen sind:
• Die elektrophoretische Heterogenität der Bakterienprobe an sich. Aufgrund der
Bildung von Aggregaten unterschiedlicher Größe und Form besitzt eine einzelne
Probe eine Verteilung elektrophoretischer Mobilitäten, die sich z. B. auch durch
geringfügige Unterschiede in der Kultivierung verändern kann.
• Partikel-Kapillarwand-Interaktionen, Partikel-Partikel-Interaktionen und Parti-
kelinstabilität in der Pufferlösung.
Wiederholmessungen am gleichen Tag sollten mehr Einblick geben.

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 105
4.2.7.4 Biologische und statistische Einflüsse
Abbildung 4.30: Elektropherogramme
von M. luteus an
fünf verschiedenen Tagen unter
den standardisierten Probenund
Pufferbedingungen. Am
fünften Tag wurde zur EOF-
Markierung eine 0.00005 %
Benzylalkohol enthaltende
Pufferlösung verwendet. Für
Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen,
siehe Abbildung
4.25.
Abbildung 4.31 zeigt die Elektropherogramme von M. luteus aus Wiederholmessun-
gen der gleichen Zellkultur nach unterschiedlichen Inkubationszeiten (a-d). Bei den
Wiederholmessungen innerhalb eines Tages, die eine Inkubationsspanne von 6 h ab-
deckten, konnte eine relativ gute Reproduzierbarkeit erreicht werden. Auffällig war
jedoch:
1. Das Fehlen einzelner Signale in den drei aufeinanderfolgenden Elektrophero-
grammen des gleichen Tages.
2. Der generelle Trend zu größerer Peakanzahl im Laufe der vier aufeinanderfol-
genden Tage.
Der erste Punkt ist besonders gut in Abbildung 4.31c zu erkennen. Das, abgesehen von
einem im zweiten Elektropherogramm fehlenden Peak, ansonsten gleiche Peakmuster
ist ein Hinweis auf statistische Imperfektionen, wenn man bedenkt, dass durch die
Probeninjektion eine Stichprobe von Aggregaten unterschiedlicher Größe und Form
gezogen wird, die von den Zellen mit einer unterschiedlichen Wahrscheinlichkeit ge-
bildet werden. Der zweite Punkt führt zu biologischen Einflussfaktoren. Obgleich, wie
in Abbildung 4.14 dargestellt, die stationäre Phase nach einer Inkubationszeit von 24 h
beginnt, und damit die Bakterienkultur über mehrere Stunden/Tage stabil sein soll-
te, ändert sich die Zusammensetzung der Bakterienpopulation weiterhin durch zu-
nehmende Agglomeratbildung. Berücksichtigt man die natürlichen Schwankungen im
Zellwachstum, so ist ein reproduzierbares Peakmuster von Tag zu Tag nahezu aus-
geschlossen. Hinweise auf Partikel-Kapillarwand und Partikel-Partikel-Interaktionen
konnten in diesem Experiment nicht gefunden werden.

106 4. Ergebnisse und Diskussion
(a) Inkubationszeit 6-12 h (b) Inkubationszeit 24-36 h
(c) Inkubationszeit 48-60 h (d) Inkubationszeit 72-84 h
Abbildung 4.31: Analyse von M. luteus-Proben nach unterschiedlichen Inkubationszeiten. Zur EOF-
Markierung wurde eine 0.00005 % Benzylalkohol enthaltende Pufferlösung verwendet. Für Trennpuffer,
CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.25.
⇒ Statistische und biologische Imperfektionen sind die Hauptursache der fehlenden
Reproduzierbarkeit des elektrophoretischen Fingerabdrucks von M. luteus.
4.2.8 Übertragung der Methode auf: P. fluorescens und S. vestibularis
Im letzten Abschnitt konnte gezeigt werden, dass die Ursache für die schlecht repro-
duzierbaren Elektropherogramme des Micrococcus-Stammes in der Natur dieser Bak-
terienspezies selbst zu finden ist. Im nächsten Schritt wurde deshalb, in der Hoffnung
auf bessere Ergebnisse, die entwickelte CE-Methode auf die beiden Bakterienspezies P.
fluorescens und S. vestibularis übertragen. Für P. fluorescens (Abbildung 4.32) lagen zwar
die detektierten Peaks im Elektropherogramm mit hoher Auflösung vor, doch spiegelte
das Peakmuster keineswegs eine gesunde Bakterienpopulation der stationären Phase
wider. Wie in Abschnitt 4.2.2 bereits beschrieben, liegt die Pseudomonas-Spezies in
Kultur überwiegend in Einzelzellen vor, welche aufgrund ihrer geringen Größe die
kürzeste Migrationszeit haben sollten. Dieser dominante erste Peak fehlte jedoch im

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 107
Abbildung 4.32: Analyse einer
P. fluorescens-Probe nach
einer Inkubationszeit von 24 h.
Nach Waschung erfolgte die
Resuspendierung in Trennpuffer
mittels einminütigem Vortexen
in einer Konzentration von 0.5
OD600. Für Trennpuffer und CE-
Bedingungen, siehe Abbildung
4.21.
Abbildung 4.33: Analyse einer P.
fluorescens-Probe nach einer Inkubationszeit
von 8 h, 19 h und
30 h, aus der gleichen Zellkultur.
Nach Bakterienernte erfolgte
Waschung und Resuspendierung
in Trennpuffer unter sanftem
Pipettieren zu einer Konzentration
von 0.5 OD600. Für Trennpuffer
und CE-Bedingungen, siehe
Abbildung 4.21.
Elektropherogramm. Eine mikroskopische Analyse der Bakterienprobe gab Aufschluss
über die Ursache. Es zeigten sich teilweise lysierte Bakterienzellen und abgerissene
Ketten. Offensichtlich musste eine sanftere Vorgehensweise in der Probenpräparation
gefunden werden. Durch Einsatz von Pasteurpipetten gelang eine sanfte Resuspen-
dierung der von Nährmedium gereinigten Zellkultur in Trennpuffer und führte zu
einem charakteristischen Peakmuster mit guter Reproduzierbarkeit (Abbildung 4.33).
Ähnlich der M. luteus-Studie wurde auch bei P. fluorescens der Einfluss verschiedener
Inkubationszeiten auf den elektrophoretischen Fingerabdruck untersucht. Wie in Ab-
bildung 4.14 zu sehen, ist die stationäre Phase nach 18 h erreicht. Um unterschiedliche
Wachstumsstadien analysieren zu können, wurde nach einer Inkubationszeit von 8 h,
19 h und 30 h jeweils eine Bakterienprobe vermessen. Dadurch war ein Zustandsbe-
reich von der exponentiellen Phase bis weit in die stationäre Phase hinein abgedeckt.
Die jeweiligen Elektropherogramme in Abbildung 4.33 zeigten in diesem Zeitfenster
qualitativ keine signifikanten Änderungen.
Auch bei S. vestibularis gelang die Anwendung der entwickelten CE-Methode nur un-

108 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.34: Analyse einer S.
vestibularis-Probe nach einer Inkubationszeit
von 4 h bis 24 h,
aus der gleichen Zellkultur. Zur
EOF-Markierung eine 0.00005 %
Benzylalkohol enthaltende Pufferlösung
verwendet. Für Trennpuffer,
CE- und Probenbedingungen,
siehe Abbildung 4.33.
ter sanften Resuspendierungsbedingungen. In Abbildung 4.34 sind die Elektrophero-
gramme zu unterschiedlichen Inkubationszeiten abgebildet. Während bei der Pseudo-
monas-Spezies die Wachstumsphasen CE-analytisch nicht mitverfolgt werden konn-
ten, erwiesen sich die Elektropherogramme der Streptokokken-Spezies wachstums-
phasenspezifisch. Die Elektropherogramme von Bakterienproben aus der exponenti-
ellen Phase, d. h. zu 4 h, 6 h und 8 h zeigen einen Peak nach einer Migrationszeit
von ca. 10 Minuten. Eine mikroskopische Betrachtung in dieser Phase bestätigte die-
ses analytische Ergebnis - die Zellpopulation bestand nahezu ausschließlich aus Di-
plokokken. Die Elektropherogramme änderten sich jedoch drastisch mit dem Beginn
der stationären Phase. Drei Signale in Folge, sogenannte Tripletts, charakterisieren die
Elektropherogramme der Bakterienproben nach einer Inkubationszeit von 10 h, 15 h
20 h und 25 h und sind wie eine mikroskopische Analyse zeigte, auf Kettenbildung
zurückzuführen.
4.2.9 Anwendungsbreite
Trennpuffer, CE-Bedingungen und Probenpräparation der optimierten CE-Methode
sollten für eine große Anzahl von Mikroorganismen anwendbar sein, um später den
entwickelten Zytotoxizitätstest möglichst leicht auf verschiedene Erregerspezies über-
tragen zu können.
4.2.9.1 N. cinerea
Aus diesem Grund wurde die Bakterienspezies Neisseria cinerea, mittels optimierter
CE-Methode analysiert. Sie ist bisher kapillarelektrophoretisch nicht untersucht wor-
den und wird auch in anderen analytischen Verfahren selten angewandt. Unter ihrer
Gattung Neisseriaceae sind jedoch unter anderem Erreger der Meningitis zu finden,
womit N. cinerea ein interessanter apathogener Repräsentant wichtiger Krankheitserre-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 109
Abbildung 4.35: Analyse von N.
cinerea-Proben nach einer Inkubationszeit
von jeweils 24 h, gemessen
an drei aufeinanderfolgenden
Tagen. Für Trennpuffer,
CE und Probenbedingungen, siehe
Abbildung 4.25.
ger darstellt. Ähnlich der Micrococcus-Spezies bildet er unregelmäßige Cluster, lieferte
jedoch im Gegensatz zu M. luteus auch an drei aufeinanderfolgenden Tagen, abgese-
hen von Verschiebungen in den Migrationszeiten, qualitativ reproduzierbare Ergeb-
nisse (Abbildung 4.35).
4.2.9.2 Trypanosoma brucei brucei
Mit dem Aufkommen bioanalytischer Anwendungen in der CE wurden auch kapillar-
elektrophoretische Untersuchungen an Erythrozyten [226, 289] und Trennungen von
Organellen aus lysierten Zellen [66, 130, 285] durchgeführt. Auch bei Trypanosomen
(Abschnitt 1.1.2), die mit einem Durchmesser von 10 µm noch im Größenbereich
von Erythrozyten lagen, gaben ihre negative Oberflächenstruktur und ihre gelunge-
ne Field-Flow-Fraktionierung [103] Hinweise auf eine mögliche kapillarelektrophore-
tische Anwendung. In einem ersten Versuch wurden mit der für Bakterien optimierten
CE-Methode die Trypanosomen-Spezies T. brucei brucei analysiert. Nach dem Reini-
gungsprozess wurden die Trypanosomen durch sanftes Pipettieren in Puffer suspen-
diert und auf einen OD600-Wert von 0.5 eingestellt. Eine mikroskopische Überprüfung
der Zellsuspensionen zeigte, dass bereits die Zellpräparation zum Lysieren der Trypa-
nosomen geführt hat - möglicherweise aufgrund dem im Puffer fehlenden, aber le-
bensnotwendigen Nährstoff Glukose oder ungünstiger Osmolarität. Dennoch wurde
die CE-Analyse von zwei unabhängigen Zellsuspensionen durchgeführt. Die Elektro-
pherogramme in Abbildung 4.36 zeigen zwar nicht das Peak-Muster intakter Trypano-
somen, doch konnten die verschiedenen Zellbestandteile mit guter Auflösung vonein-
ander getrennt werden. Ebenfalls wurde eine relativ gute Reproduzierbarkeit erreicht,
obgleich in den jeweiligen Elektropherogrammen nicht alle Komponenten detektier-
bar waren. Ähnlich der M. luteus-Analyse könnten auch hier statistische Imperfektio-
nen (Abschnitt 4.2.7.4) die Ursache sein. Eine gleichzeitige mikroskopische Detektion

110 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.36: Kapillarelektrophoretische
Trennung
trypanosomaler Zellbestandteile
aus zwei unterschiedlichen
Proben, gemessen am gleichen
Tag. Für Trennpuffer, CE- und
Probenbedingungen, siehe
Abbildung 4.33.
könnte zeigen, ob es sich bei den detektierten Signalen tatsächlich um Zellorganellen
handelt, wodurch die Aufklärung von Angriffspunkten neuer Wirkstoffe über Fluo-
reszenzmarkierung kapillarelektrophoretisch möglich würde.
4.2.10 Trennung verschiedener Bakterienstämme
Parallelisierung ist das Schlagwort für High-Throughput-Screening-Verfahren. Zu sei-
ner Realisierung bzw. zumindest zur Steigerung des Durchsatzes der bisherigen CE-
Methode sollten die drei Bakterienspezies M. luteus, P. fluorescens und S. vestibularis
in einem Elektropherogramm von einander getrennt werden. Dadurch sollte es später
möglich sein, die Toxizität von Testsubstanzen auf alle drei Erreger simultan zu unter-
suchen. In Abbildung 4.24 wurde bereits gezeigt, dass verschieden große Zellagglome-
rate mittels Ultraschallbehandlung in Einzelzellen separiert werden können, wodurch
die Voraussetzung für die elektrophoretische Parallelisierung verschiedener Bakteri-
enspezies gegeben ist. Mittels optimierter CE-Methode und 1-minütiger Ultraschall-
behandlung gelang die Separation der drei Bakterienarten (siehe Abbildung 4.37). Die
injizierte Probe enthielt die einzelnen Komponenten in gleichem Anteil und wurde auf
eine Gesamtzellzahl von 0.5 OD600 eingestellt. Wie das Elektropherogramm zeigt, sind
in der Zellsuspension jedoch trotz Ultraschallbehandlung zu einem geringen Anteil
Zellagglomerate und -ketten vorhanden, die auch mit Hilfe anderer Dispergierverfah-
ren, wie z. B. unter Zusatz geringer Mengen von Tween 80, nicht vereinzelt werden
konnten. Dennoch gelang mittels der einzelnen Referenzbakterien bzw. Referenzmi-
schungen die Identifizierung der einzelnen Peaks im Elektropherogramm. Aufgrund
der geringen elektrophoretischen Unterschiede zwischen P. fluorescens und S. vestibu-
laris und der möglichen Schwankungen in der Migrationszeit, wird eine endgültige
Zuordnung dieser Stämme erst durch simultane Mikroskopie des Detektionsfensters
möglich (dieses Equipment stand uns nicht zur Verfügung).

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 111
4.2.11 Validierung der Methode
Abbildung 4.37: Kapillarelektrophoretische
Trennung der drei
Bakterienspezies: M. luteus, P.
fluorescens und S. vestibularis. Die
Proben wurden nach einer Gesamtinkubationszeit
von 24 h
präpariert und vor der Injektion
1 Minute im Ultraschallbad
behandelt. Die Probenkonzentration
im Gemisch betrug
0.5 OD600. Für Trennpuffer und
CE-Bedingungen, siehe Abbildung
4.21.
Rein visuell zeigte sich die beste Reproduzierbarkeit der CE-Analyse intakter Mikroor-
ganismen bei den beiden Bakterienstämmen P. fluorescens und S. vestibularis. Aus die-
sem Grund sollte mit diesen die CE-Methode zum Zytotoxizitätstest weiterentwickelt
werden. Um die Frage nach der Eignung der Methode zur weiteren Entwicklung zu
beantworten, musste die Methode validiert werden - denn Validierung ist der Nach-
weis der Eignung für einen bestimmten Gebrauch ” fitness for use” [152]. Zur Validie-
rung der fundamentalen Parameter wie Richtigkeit, Präzision, Linearität, Selektivität,
Spezifizität, Sensitivität und Robustheit wurde den Richtlinien der “International Con-
ference of Harmonization, ICH” und “Food and Drug Administration, FDA” [58–60]
gefolgt. Einige dieser Parameter wurden bereits während der Methodenentwicklung
berücksichtigt: So wurde die Methode darauf ausgerichtet, eine gute Wiederholpräzi-
sion, einen Anwendungsbereich auf mindestens drei Bakterienspezies, und ein rela-
tiv hohes Maß an Robustheit zu besitzen. Auf diesem Wege wurden Grenzen in der
Stabilität des Trennpuffers und der mikrobiellen Analyte festgestellt und optimiert.
Mit der optimierten CE-Methode war zwar die Sensitivität aufgrund der Konzentra-
tionsabhängigkeit der Elektropherogramme beschränkt, die Selektivität und Spezifi-
zität dagegen, wie die Trennung verschiedener Bakterienspezies und deren Agglome-
rate zeigte, gegeben. Um neben diesen bisher qualitativen Betrachtungen, die Metho-
de quantitativ zu charakterisieren, wurden die Wiederholpräzision und Linearität am
Beispiel P. fluorescens genauer untersucht. Auf Richtigkeit der Methode konnte erst im
eigentlichen Zytotoxizitätstest durch Vergleich des errechneten antimikrobiellen Po-
tenzials verschiedener Referenzsubstanzen mit dem aus konventionellen Methoden
geprüft werden.

112 4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.11.1 Linearität
Die richtige Kalibrierung und damit die Bestimmung der Korrelation zwischen Signal
und Analytkonzentration ist die Grundvoraussetzung für quantitativ-analytisches Ar-
beiten, welches spätestens bei der Quantifizierung der Elektropherogramme zur Be-
stimmung der Zytotoxizität zur Anwendung kommen sollte. In der Kalibrierarbeit
wurden sechs Elektropherogramme von Pseudomonas-Suspensionen in einem Kon-
zentrationbereich zwischen 0.1 und 0.6 OD600 aufgenommen (Abbildung 4.38a). Jedes
Elektropherogramm entsprach nach Integration der einzelnen Signale über die gesam-
te Zeitskala des Elektropherogrammes, einem Messpunkt, welcher der empirischen,
aus der OD-Messung (Abschnitt 4.2.4.3) ermittelten Probenmenge zugeordnet wurde.
Die Integrale wurden als korrigierte Peakflächen berechnet, d. h. sie enthalten bereits
einen Korrekturfaktor zum Ausgleich der Peakverbreiterung bedingt durch längere
Migrationszeiten. Der gemessene Konzentrationsbereich ergab sich aus den Bedingun-
gen für die Erstellung mikrobieller Elektropherogramme (Abschnitt 4.2.6.3.4). Die In-
stabilität der Proben erforderte die Herstellung jeder Zellonzentration aus einer neuen
Bakterienkultur in einer Inkubationsphase von 24 h bis 36 h. Es wurden somit kei-
ne in der pharmazeutischen Analytik üblichen Stammlösungen verwendet. Die Aus-
wertung der Korrelation zwischen Signal und Konzentration erfolgte visuell und über
die Bestimmung des Bestimmtheitsmaßes (R 2 ). Betrachtet man in Abbildung 4.38b die
Auftragung der erhaltenen Wertepaare, wird ein aus der Messtechnik resultierender
systematischer Fehler deutlich. Die Konzentration der Bakteriensuspension kann nur
indirekt über die optische Dichte bestimmt werden und enthält auf diese Weise an sich
eine Korrelationsfunktion. Die Korrelation zwischen Zellzahl und optischer Dichte
wurde in Abschnitt 4.2.4.3 über den gesamten Messbereich bestimmt. Wie in Abschnitt
3.3.1 bereits besprochen gilt eine Linearität zwischen optischer Dichte und Zellzahl je-
doch genaugenommen erst ab einem OD-Wert von 0.2 bis 0.3. Lässt man aus diesem
Grund das erste Wertepaar (0.113,8916) außer Acht und fittet die restlichen Wertepaa-
re an eine Korrelationsfunktion 1. Ordnung: y(x) = ax + b, so erhält man die folgende
Geradengleichung:
y(x) = 665374x − 132538 (4.2)
mit einem Bestimmtheitsmaß von R 2 = 0.993. Der negative Y-Achsenabschnitt ergibt
physikalisch zunächst keinen Sinn. Er unterstützt jedoch die bei der Konzentrations-
abhängigkeit der Elektropherogramme (Abschnitt 4.2.6.3.4) aufgestellte Hypothese,
dass unkontrollierte Adsorption des Analyten, d. h. der Mikroorganismen an der PEO-
beschichtung, während der kapillarelektrophoretischen Trennung stattfindet. Dieses
Phänomen ist nicht nur von der Temperatur, dem Lösungsmittel und der Beschaffen-
heit der betreffenden Oberflächen abhängig, sondern auch von der Konzentration des
Analyten [153]. Vermutlich ist gerade diese Konzentrationsabhängigkeit der Adsorpti-

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 113
(a) Elektropherogramme von P. fluorescens bei unterschiedlichen Bakterienkonzentrationen
und einheitlicher Injektion von 10 s bei 0.5 psi.
Für Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen, siehe Abbildung 4.21.
Integral
×
300
250
200
150
100
50
0
3
10
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
OD600
(b) Auftragung der korrigierten Gesamtflächen der einzelnen Elektropherogramme
von P. fluorescens gegen die eingesetzten Bakterienkonzentrationen.
Für die Korrelationsfunktion 1. Ordnung wurde im
Konzentrationsbereich 0.2-0.6 OD600 die Geradengleichung f(x) =
665374x − 132538 mit einem Bestimmtheitsmaß von R 2 = 0.993 erhalten.
Abbildung 4.38: Prüfung auf Linearität der Pseudomonas-Spezies.
on an die “hungrigen Oberflächen” dafür verantwortlich, dass mit einem R 2 -Wert von
0.993 dennoch eine gute Linearität zwischen Messsignal und Zellmenge vorliegt. Aus
der Kalibrierfunktion können aber noch weitere Informationen gewonnen werden. Die
Steigung erscheint mit einem Wert von 66537 zunächst sehr groß, wodurch eine hohe
Empfindlichkeit suggeriert wird. Wie sich die Empfindlichkeit auf die Präzision aus-
wirkt wird nachfolgend diskutiert.

114 4. Ergebnisse und Diskussion
4.2.11.2 Präzision
Bei der Methodenentwicklung am Stamm M. luteus zeigte sich, dass die Durchführung
von Wiederholmessungen mikrobieller Proben aus einem Inkubationszeitfenster von
ca. 12 h am gleichen Tag die beste Reproduzierbarkeit lieferte (Abschnitt 4.2.7.4). Zur
Bestimmung der Präzision, dem quantitativen Maß für die Robustheit einer Methode,
welche als Standardabweichung s berechnet wird [153], wurden deshalb in Abbildung
4.39 sechs Pseudomonas-Proben nach einer Inkubationszeit von 24 h bis 36 h in kurzen
Zeitabständen unter gleichen CE-Bedingungen analysiert. Die Probenkonzentrationen
zeigten jeweils einen OD600-Wert von 0.5. Die Integration der Elektropherogramme er-
gab eine korrigierte Gesamtfläche von: 330290.46 ± 41010.17 normiert auf einen OD600-
Wert von 1. Dies entspricht einer Standardabweichung von 12.42% und liegt damit
im Bereich biometrischer Größen [216]. Eine große Fehlerquelle in der CE-Methode
stellt die Injektion dar, die aufgrund der geringen Anzahl der Partikel pro Volumen
zu statistischen Imperfektionen führt, die sich neben den in Abschnitt 4.2.7.4 beschrie-
benen qualitativen Änderungen des Peakmusters auch in quantitativen Schwankun-
gen äußern kann. Bezüglich der Schwankungen in den Migrationszeiten wurde für
den Einzelzellen-repräsentierenden-ersten-Peak eine Migrationszeit von 7.04 ± 0.23
Minuten gemessen. Dies entspricht einer Standardabweichung von 3.29 %, womit die
Schwankung durchaus noch im Rahmen der üblichen Arzneistoff-Analytik lag [153].
Abbildung 4.39: Analyse von P.
fluorescens-Proben nach einer Inkubationszeit
zwischen 24 h bis
30 h, am gleichen Tag gemessen.
Für Trennpuffer, CE- und Probenbedingungen,
siehe Abbildung
4.33.

4.2 Kapillarelektrophoretische Methode zur Analyse intakter Mikroorganismen 115
4.2.12 Fazit: CE-Analyse von Mikroorganismen
• Die CE-Methode bewies sich in guter Präzision, Selektivität, Spezifizität, Linea-
rität und in einem weiten Anwendungsbereich. (Trennpuffer: 0.78 mM Tris-
Borat, 0.018 mM Na2EDTA und 0.0125% PEO bei einem pH von 8.7; polyme-
re Matrix: PEO 600.000 wurde in einer Konzentration von 0.5 % bei 30 ◦ C für
mindestens 12 h gelöst und anschließend mit Puffer auf 0.0125 % verdünnt; CE-
Bedingungen: Quarzkapillare mit einer Gesamtlänge von 31.5 cm und einer De-
tektionslänge von 21 cm, konstant angelegte Spannung von 10 kV, Temperatur 23
◦ C, anodische Probeninjektion durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi für 10 s,
Detektion bei 214 nm; Bakterienproben und Puffer: Neue Herstellung vor jeder
Messung; eine Zellkonzentration von 0.5 OD600)
• Die Probenpräparation muss dem Mikroorganismus entsprechend individuell
optimiert werden.
• Die Grenze der Reproduzierbarkeit der kapillarelektrophoretischen Analyse in-
takter Mikroorganismen ergibt sich aufgrund der statistischen Verteilung der
Grundgesamtheit einer Bakterienpopulation.

116 4. Ergebnisse und Diskussion
4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch
Fluoreszenzmarkierung
Überblick:
In diesem Abschnitt werden zwei neue Methoden zur Bestim-
mung der bakteriziden Wirksamkeit auf der Grundlage der Fluo-
reszenzspektroskopie entwickelt. Die Auswertung erfolgt sowohl
am Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (fluorescence micropla-
te reader, FMR) als auch mittels der in Abschnitt 4.2 beschrie-
benen kapillarelektrophoretischen Methode unter Verwendung ei-
nes Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektors (LIF-CE). Die Nutzung
der Membranunversehrtheit bei lebenden gegenüber toten Zel-
len ermöglicht nach Zellmarkierung mit den beiden Nucleinsäure-
bindenden Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid (”LI-
VE/DEAD BacLight viability kit”) schnell zwischen lebenden und to-
ten Zellen zu unterscheiden.
4.3.1 Zustand einer Bakterienpopulation
Zur Klassifizierung der antimikrobiellen Wirkung getesteter Substanzen in bakterizid
und statisch ist eine Analyse verschiedener Zellmerkmale notwendig. Konventionell
dient die Replikationsfähigkeit als Kriterium für die Prüfung auf Lebensfähigkeit. De-
ren Bestimmung in einer Zellkultur erfolgt meist durch Ausplattieren einer definierten
Menge Zellsuspension und anschließendem Zählen koloniebildender Einheiten [254].
Diese Methode hat jedoch durch Verklumpung der Zellen oder gegenseitiger Be-
einflussung bei der Koloniebildung [168] einige Fehlerquellen und ist nicht zu-
letzt sehr zeitintensiv (24 h bis 5 Tage) [254]. Auf der Suche nach neuen Lösungs-
ansätzen wurden in den letzten Jahren vor allem auf dem Gebiet der Fluores-
zenzspektroskopie verschiedene rasche Methoden zur Bestimmung der Lebensfähig-
keit entwickelt. Sie basieren zum einen auf der Membranunversehrtheit, die darauf
beruht, dass bestimmte Marker die Zellmembran nicht penetrieren können. Dazu
gehören Methylenblau, Kongo-Rot [227] und DNA-Marker wie SYTOX Green [157],
Propidiumiodid [135] und Ethidiumbromid [184]. Zum anderen wird die Aktivität
von Stoffwechselvorgängen gemessen wie z. B. Zellatmung (Tetrazoliumfarbstoffe
[8, 223]), Enzymaktivität (Fluoresceindiacetat [229, 247]), Membranpotenzial (Rhoda-
mine 123, DiOC6(3)(3,3-Dihexyloxacarbocyaniniodid) und DiBAC4 (Bis-(1,3-Dibutyl-
barbitursäure)-Trimethinoxonol) [138, 169]) oder pH-Gradient (Fluorescein und 5-
(und6-)-carboxyfluorescein [98]).

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 117
4.3.2 Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid
Die fluoreszenzspektroskopische Analyse einer Zellpopulation auf der Basis der SY-
TO9- und Propidiumiodid-Markierung (Abbildung 4.40) hat den Vorteil, dass sowohl
lebende als auch tote Bakterienzellen bei verschiedenen Wellenlängen simultan er-
fasst werden und aus der relativen Fluoreszenzintensität die Konstitution einer Bak-
terienpopulation quantitativ beschrieben werden kann. Dies hat zur Folge, dass sich
bei Kopplung der fluorimetrischen Detektion mit analytischen Trenntechniken wie
z. B. der Kapillarelektrophorese die Verwendung eines internen Standards erübrigt.
Die Lebend-Tot-Markierung mit den beiden Nucleinsäure-bindenden Farbstoffen be-
ruht auf ihren unterschiedlichen spektralen Eigenschaften und ihrer unterschiedlichen
Fähigkeit in Bakterienzellen einzudringen [4]. Während SYTO9 membranpermeabel
ist und alle Zellen einer Bakterienpopulation grün färbt, wird Propidiumiodid mit sei-
ner charakteristischen roten Fluoreszenz von gesunden Zellen durch seine Membran-
impermeabilität ausgeschlossen. Einige Bakterienstämme verfügen desweiteren über
Efflux-Pumpen, womit Propidiumiodid aktiv aus lebenden Zellen transportiert wer-
den kann [254]. In toten Zellen führt sowohl die Verdrängung von SYTO9 durch Pro-
pidiumiodid aufgrund stärkerer DNA-Bindung als auch die Fluoreszenzauslöschung
der SYTO9 Emission durch “fluorescence resonance energy transfer”(FRET, Abschnitt
3.3.3) zum Ersetzen der grünen gegen die rote Fluoreszenz [254]. Der letztere Mecha-
nismus ist aufgrund der spektralen Überlappung der beiden Marker möglich.
Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid verläuft sehr schnell und erfor-
dert lediglich eine Inkubationszeit von 15 Minuten [12,14]. Dann zeigen lebende Zellen
eine grüne und tote Zellen eine rote Fluoreszenz.
Die Routineanwendung der SYTO9-Propidiumiodid-Markierung ist jedoch nicht un-
problematisch. Zwar ist unbestritten, dass Bakterienzellen, die sich mittels Propidi-
umiodid anfärben lassen weder lebensfähig noch kultivierbar sind, doch wurde bei
gleichzeitiger Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid auch von Fällen be-
richtet, bei denen sowohl für lebende als auch für tote Zellen die gleiche rote oder
grüne Fluoreszenzintensität detektiert wurde [254]. Solche konfusen, zweideutigen Si-
tuationen können durch die extrem großen Unterschiede in der Emissionsintensität
von SYTO9 und Propidiumiodid verursacht werden. Während SYTO9 an DNA gebun-
den eine starke Fluoreszenz aufweist [228], zeigen Propidiumiodid-markierte Proben
nur eine sehr geringe Fluoreszenzintensität bedingt durch den sehr kleinen Extinkti-
onskoeffizienten des Propidiumiodids [28]. Zum anderen muss aber auch berücksich-
tigt werden, dass das Emissionsspektrum von SYTO9 mit dem Anregungsspektrum
von Propidiumiodid überlagert. Diese Tatsache ist die Grundlage dafür, dass eine ge-
genseitige Fluoreszenzauslöschung und damit die simultane Lebend-Tot-Bestimmung
überhaupt möglich ist - führt aber bei einem Missverhältnis der Markerkonzentratio-
nen unter Umständen zu uneindeutigen Fluoreszenzerscheinungen. In jedem Fall er-

118 4. Ergebnisse und Diskussion
C
H 3
(CH 2 ) 3
N
CH
O N + CH 3
I
N
H 2
N +
(CH 2 ) 3
NH 2
C 2 H 5
N +
C 2 H 5
SYTO9: Propidiumiodid:
Anregungsmaximum: 480 nm Anregungsmaximum: 490 nm
Emissionsmaximum: 500 nm Emissionsmaximum: 635 nm
Abbildung 4.40: Chemische Strukturen und spektrale Eigenschaften der beiden Komponenten SYTO9
und Propidiumiodid des “LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits” L-7012. Im Kit liegt SYTO9 in
3.34 mM und Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, jeweils gelöst in DMSO, vor [4].
fordert eine routinemäßige Anwendung zunächst eine solide Validierung der Fluores-
zenzmarkierung.
4.3.3 Auswahl des Testsystems
Zum Aufbau neuer Testverfahren zur Bestimmung bakterizider Wirksamkeit eini-
ger Antiinfektiva mittels SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung wurden die bei-
den Teststämme P. fluorescens und S. vestibularis ausgewählt. Sie wurden im vorher-
gehenden Kapitel bereits kapillarelektrophoretisch analysiert, wodurch die Entwick-
lung zweier orthogonaler Methoden mittels FMR und LIF-CE möglich sein sollte. Die
Etablierung und Validierung neuer Methoden erfordert aber auch den Einsatz in der
Literatur gut dokumentierter Referenzsubstanzen. Die dafür geeigneten Antibiotika
sollten:
• Bakterizid wirksam sein,
• Über eine gute Wasserlöslichkeit verfügen, um zunächst eine Lösungsmittel be-
dingte Zytotoxizität ausschließen zu können und
• Unterschiedliche Angriffspunkte und Wirkmechanismen besitzen, die sich even-
CH 3
2 I

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 119
tuell unterschiedlich auf die Membranunversehrtheit auswirken können.
HO
O
HO
H
HN
-
OOC
O
N
H
H
N
H
H
O
O
H
OH
OH
OH
Cl
H
N
H
O
Vancomycin
Cl
H O H H
N
N
O H O
O
NH 2
H OH
4-Chinolon-3-carbonsäure Ciprofloxacin
Abbildung 4.41: Strukturen der Arzneistoffe, die als Referenzsubstanzen zur Entwicklung und Etablierung
der neuen Testverfahren zur Bestimmung der bakteriziden Wirksamkeit verwendet wurden.
Die Auswahl fiel auf Ciprofloxacin gegen P. fluorescens und Vancomycin-HCl gegen
S. vestibularis. Die Arzneistoffe sind in Abbildung 4.41 dargestellt. Bei Ciprofloxacin
handelt es sich um ein Derivat der 4-Chinolon-3-carbonsäure. Es gehört zur Grup-
pe der Gyrase(TopoisomeraseII)-Hemmstoffe. Die Gyrase stellt in Bakterien ein wich-
tiges Schlüsselenzym für die lebenswichtige DNS- und RNS-Transkription dar und
ist verantwortlich für die Öffnung und den Verschluss der Chromosomenfäden des
DNS-Knäuels. Ihre Hemmung verhindert vor allem das Schließen der geöffneten DNS-
Stränge und unterbindet somit Zellwachstum und Zellteilung und führt zum Zelltod.
Vancomycin gehört zur Gruppe der Glykopeptide und wird aus der Fermentationslös-
ung von Streptomyces orientalis gewonnen. Es hemmt den Einbau von Disaccharid-
Einheiten in die Proteoglycan-Kette der Zellwand und wirkt bakterizid gegenüber
Gram-positiven Bakterien. Beide Substanzen verfügen über eine sehr gute Wasserlös-
lichkeit, welche die Herstellung von Stammlösungen in einer Konzentration von
10 mM zuließ (siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.1).
N
H
F
N
H
N
H
O
H
+
O
N
CH 3
NH 2
CH 3
CH 3
O
OH

120 4. Ergebnisse und Diskussion
4.3.4 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR)
4.3.4.1 Validierung der Fluoreszenzmarkierung
In der Fluoreszenzspektroskopie wird die gesamte Lumineszenz einer Probe gemes-
sen. Sie muss folglich proportional zur vorhandenen Zellzahl sein, d. h. alle Bakteri-
enzellen müssen mit Farbstoff gesättigt sein. Aufgrund der gegenseitigen Beeinflus-
sung der beiden Fluoreszenzmarker SYTO9 und Propidiumiodid durch Verdrängung
und Fluoreszenzlöschung bildet die Sättigung der Probe mit SYTO9 die Grundlage der
fluorimetrischen Auswertung. Ferner muss für eine korrekte Fluoreszenzmarkierung
und Auswertung Propidiumiodid in ausreichendem Überschuss vorhanden sein, so
dass die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration erst durch die ” Herstellung” ei-
ner Korrelation 1. Ordnung (vide infra) zwischen dem grün/roten Fluoreszenzverhält-
nis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen angepasst werden kann [4, 254]. Die
Bestimmung der erforderlichen Konzentrationen erfolgte zunächst am FMR bei einer
Anregungswellenlänge von 488 nm und Emissionswellenlängen von 520 nm (SYTO9)
und 655 nm (Propidiumiodid). Diese entsprachen zwar nicht den Anregungs- und
Emissionsmaxima, doch bestand dadurch Einklang mit den Techniken der Fluores-
zenzmikroskopie, die zu Visualisierungszwecken eingesetzt wurde, und der LIF-CE.
4.3.4.1.1 Sättigungskonzentration
Die Sättigungskonzentration von SYTO9 wurde für eine Bakterienpopulation in der
frühen stationären Phase bestimmt. In diesem Stadium, kurz nach Abschließen des
Zellwachstums besteht eine Bakterienkultur aus fast 100 % lebenden Zellen. Die ver-
wendeten Bakterienzellen waren in 200 µl Wasser suspendiert, um eine mögliche
Bindung von SYTO9 an Mediumbestandteile auszuschließen. In Vorversuchen wur-
den unterschiedliche Zellkonzentrationen zur Zellmarkierung eingesetzt. Eine Fluo-
reszenzmarkierung von 1.5 x 10 7 Zellen/ml (1:10 Verdünnung einer 0.5 OD600-Stamm-
lösung, siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) führte zu einer Fluoreszenzin-
tensität im Bereich 100 bis 200 RFU (relative fluorescence unit) und erwies sich so-
mit als geeignet für alle nachfolgenden Experimente. Abbildung 4.42 zeigt die Fluo-
reszenzintensitäten von acht Pseudomonas-Proben, die zuvor mit unterschiedlichen
SYTO9-Konzentrationen in einem Konzentrationsbereich zwischen 15 nM und 10 µM
unter Lichtausschluss für 15 Minuten inkubiert wurden. Die Fluoreszenzintensität der
markierten Pseudomonas-Proben steigt als Funktion der SYTO9-Konzentration um
mehr als das Doppelte. Bei einer Konzentration von > 1.5 µM stagniert die Fluores-
zenzintensität und mündet in einem Plateau, das die Sättigung der Zellen mit SYTO9
markiert. Ein Vergleich zu den ungebundenen SYTO9-Intensitäten, die in rein wässri-
ger Umgebung gemessen wurden, verdeutlicht die starke Fluoreszenz des DNA-
gebundenen SYTO9. Für S. vestibularis ergab sich bei ähnlichem Fluoreszenzverhalten

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 121
green fluorescent intensity [RFU]
250
200
150
100
50
7
SYTO9 + 1.5x10 Zellen/ml
SYTO9 ohne Zellen
0
0 2 4 6 8 10
Concentration SYTO9 [ µ M]
eine identische Sättigungskonzentration.
Abbildung 4.42: Sättigungskurve
von P. fluorescens für den
Fluoreszenzmarker SYTO9.
Die verwendeten Bakteriensuspensionen
enthalten 1.5 x
10 7 Zellen/ml aus der frühen
stationären Phase in wässrigem
Milieu. Die Messungen erfolgten
am FMR bei einer Anregungswellenlänge
von 488 nm und
einer Emission von 520 nm.
Für alle weiteren Messungen wurde zur Sättigung von 1.5 x 10 7 Zellen/ml eine SYTO9-
Konzentration von 1.67 µM eingesetzt.
4.3.4.1.2 Korrelationsfunktion 1. Ordnung
Im zweiten Schritt wurde die erforderliche Propidiumiodid-Konzentration auf der Ba-
sis der optimierten SYTO9-Konzentration eingestellt. Dazu wurden zwei Zellsuspen-
sionen bestehend aus je 100 % lebenden und toten Zellen mit einem OD600-Wert von
0.5 präpariert, 1:10 verdünnt, so dass sich eine Gesamtzellzahl von 1.5 x 10 7 Zellen/ml
ergab, und in fünf unterschiedlichen lebend/tot-Verhältnissen gemischt: 100:0, 75:25,
50:50, 25:75, und 0:100. Die exakte Herstellung dieser Referenzsuspensionen und die
Abtötung der Bakterienzellen mit Isopropanol ist im Experimentellen Teil Abschnitt
5.1.7.2.5 beschrieben. Ist das zur Fluoreszenzmarkierung eingesetzte Verhältnis zwi-
schen SYTO9 und Propidiumiodid ” richtig”, dann beschreibt eine Korrelationsfunk-
tion 1. Ordnung die Beziehung zwischen dem Verhältnis grüner zu roter Fluores-
zenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen. Unterschiedliche Propidiumiodid-
Konzentrationen im Bereich 1 bis 100 µM wurden somit auf Linearität getestet. Ab-
bildung 4.43 zeigt am Beispiel der SYTO9-markierten Pseudomonas-Spezies die er-
haltenen ” Vitalitätskurven” in Abhängigkeit von der eingesetzten Propidiumiodid-
Konzentration.

122 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.43:
” Vitalitätskurven”
von P. fluorescens in
Abhängigkeit unterschiedlicher
Propidiumiodid-Konzentrationen.
Die Bakteriensuspensionen
enthalten 1.5 x 107 Zellen/ml in
unterschiedlichen lebend/tot-
Verhältnissen und wurden mit
SYTO9 in einer Konzentration
von 1.67 µM gesättigt. Gemessen
wurde am FMR bei einer Anregungswellenlänge
von 488 nm
und dualer Emission bei 520 nm
ratio of green/red fluorescence
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
Prop.= 1 µ M
Prop.= 10 µ M
Prop.= 100 µ M
1.0
0 20 40 60 80 100
und 655 nm. percentage of live cells
Abbildung 4.44: ” Vitalitätsgeraden”
von P. fluorescens und S. vestibularis
aus der Mittelung über
vier Wiederholexperimente. Die
Zellmarkierung von 1.5 x 10 7
Zellen/ml erfolgte mit 1.67 µM
SYTO9 und 10 µM Propidiumiodid.
Gemessen wurden am
FMR bei einer Anregungswellenlänge
von 488 nm und dualer
Emission bei 520 nm und
ratio of green/red fluorescence
7
6
5
4
3
2
P. fluorescens
S. vestibularis
0 20 40 60 80 100
655 nm. percentage of live cells
Für eine lineare Korrelation zwischen grün/rotem Fluoreszenzverhältnis und dem An-
teil lebender Bakterienzellen erwies sich für eine Bakteriensuspension von P. fluorescens
und S. vestibularis mit einer Zellkonzentration von 1.5 x 10 7 Zellen/ml die Markierung
mit 1.67 µM SYTO9 und 10 µM Propidiumiodid als geeignet. Die Markierung der Zel-
len erfolgte nach einer Inkubationszeit von 15 Minuten unter Lichtausschluss.
Die entsprechenden ” Vitalitätsgeraden” von P. fluorescens und S. vestibularis sind in
Abbildung 4.44 dargestellt. Gemittelt über vier unabhängige Experimente (d. h. an
verschiedenen Tagen durchgeführt) ergaben sich für die Korrelationsfunktion f(x) =
ax + b die folgenden Gleichungen und Bestimmtheitsmaße:
P. fluorescens : f(x) = 0.0152 · x + 1.3879, R 2 = 0.999
S. vestibularis : f(x) = 0.0511 · x + 2.0985, R 2 = 0.991
Die Streuungen der einzelnen Messwerte sind als Fehlerbalken eingezeichnet und er-
geben eine relative Standardabweichung von ≤ 8 % für P. fluorescens und ≤ 4 % für S.

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 123
vestibularis. Die beiden Ausgleichsgeraden enthalten sowohl
• die Vitalitätsbestimmung,
• die Korrektur der spektralen Überlappung von SYTO9 und Propidiumiodid
• als auch die Hintergrundfluoreszenz,
wobei die letzten beiden Faktoren zu den beobachteten positiven Y-Achsenabschnitten
führen. Die ” Vitalitätsgeraden” bilden die Basis für alle weiteren Vitalitätsbestimmun-
gen Arzneistoff-exponierter Bakterienproben und ihre präzise Bestimmung ist unent-
behrlich.
4.3.4.2 Testung
Antibiotika greifen direkt in den katabolen und anabolen Stoffwechsel der Bakterien-
zellen ein; das bedeutet, dass sich die zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit
verwendeten Bakterienkulturen in der exponentiellen Phase befinden müssen [182].
Die Bakterienkulturen zeichnen sich in dieser Phase durch starke Stoffwechselaktivität
und Zellvermehrung aus, so dass die Auswirkung der Antibiotika auf Zellwachstum
und -zustand leicht sichtbar wird. Die Antibiotika wurden in einem Konzentrations-
bereich zwischen 0.01 µM und 100 µM auf ihre toxische Wirkung getestet. Nach ei-
ner Inkubationszeit von 18 h bei 30 ◦ C wurden die Arzneistoff-exponierten Bakterien-
zellen geerntet, gewaschen, mit den optimierten Markerkonzentrationen Fluoreszenz-
markiert und zusammen mit einer Positiv(100 % lebende Zellen)- und einer Nega-
tiv(100 % tote Zellen)kontrolle am FMR mit einer Extinktion bei 488 nm und dualer
Emission bei 520 nm und 655 nm gemessen. Anhand des ermittelten grün/roten Fluo-
reszenzverältnisses wurde aus der Kalibrierfunktion der prozentuale Anteil lebender
Zellen der jeweiligen Bakterienproben errechnet und in Abhängigkeit der eingesetz-
ten Antibiotikakonzentrationen aufgetragen. Abbildung 4.45 zeigt die beiden Dosis-
Wirkungs-Kurven von Ciprofloxacin für P. fluorescens und Vancomycin für S. vestibula-
ris.
Insgesamt wurde die Bestimmung der Zytotoxizität dreimal durchgeführt. Die ent-
sprechenden ED50-Werte berechneten sich mittels linearer Interpolation [134] (Ab-
schnitt 5.3) für Ciprofloxacin zu 5.1±1.6 µM und für Vancomycin zu 2.4±0.7 µM. Dies
entspricht einer Standardabweichung von 31.4 % bei Ciprofloxacin und 29.2 % bei Van-
comycin, womit die Streuung im Rahmen der üblichen Abweichungen von 30 % bei
biologischen Testverfahren liegt [175]. Zur Überprüfung und Interpretation der Ergeb-
nisse wurde die Testung mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren wiederholt
und die entsprechenden MIC-Werte bestimmt (Abschnitt 5.1.8.3). Für Ciprofloxacin
ergab sich ein MIC-Wert von 3.0 µM und für Vancomycin ein Wert von 0.7 µM. Ähn-
liche Aktivitätskonzentrationen sind auch in der Literatur beschrieben, weshalb auf

124 4. Ergebnisse und Diskussion
percentage of live cells
120
100
80
60
Ciprofloxacin
VancomycinHCl
Abbildung 4.45: Dosis-Wirkungs-Kurven
von Ciprofloxacin
40
für P. fluorescens und Vancomycin
für S. vestibularis mittels
20
FMR. Für die Messbedingungen
siehe Abbildung 4.44
0 -3
10
-2
10
-1
10 1 10
10
Concentration [ µ M]
eine Wiederholung der Zytotoxizitätsbestimmung verzichtet wurde [102, 122]. Die To-
xizitätskonzentrationen von beiden Methoden liegen im gleichen Größenbereich, wo-
durch die Eignung der fluorimetrischen Auswertung mittels FMR zunächst bestätigt
ist.
4.3.5 LIF-CE zur Charakterisierung einer Bakterienpopulation
Zur Entwicklung eines zur FMR-Methode orthogonalen Zytotoxizitätstestes auf der
Grundlage der LIF-CE wurde auf die im vorangegangenen Kapitel beschriebene ka-
pillarelektrophoretische Methode zurückgegriffen. Sie verwendet eine UV-Detektion
bei 214 nm und setzt für die Erstellung charakteristischer Fingerabdrücke den Einsatz
einer hohen Zellkonzentration mit einem OD600-Wert von 0.5 (≈1.5 x 10 8 Zellen/ml)
voraus (Abbildung 4.38a). Die Ankopplung der Kapillarelektrophorese an den Argon-
Laser-induzierten-Fluoreszenz-Detektor (Anregungswellenlänge ist 488 nm) erfordert
jedoch das Arbeiten mit wesentlich geringeren Probenkonzentrationen, um das De-
tektionsmaximum von 1000 RFU nicht zu überschreiten (Abschnitt 3.4.1.3). Aufgrund
der starken Fluoreszenzintensität musste die Anzahl der Zellen im Vergleich zur UV-
Detektion um einen Faktor 100 reduziert werden, wodurch aufgrund von Wechsel-
wirkungen mit dem PEO der mobilen Wandbeschichtung die elektrophoretische Wan-
derung der Zellen so stark beeinflusst wurde, dass keine Zellen mehr am Detektor
ankamen. In einem ersten Schritt musste die etablierte UV-CE-Methode für kleinere
Probenkonzentrationen anwendbar gemacht werden, ohne dass die Charakterisierung
einer Bakterienkultur anhand des Peakmusters verloren ging. Eine Konzentrations-
abhängigkeit des elektrophoretischen Verhaltens von Bakterienzellen wurde kürzlich
auch am Beispiel E. coli beschrieben [262]. Durch Erhöhung der Ionenstärke unter Ver-
wendung eines 10 mM Boratpuffers und der Substitution von PEO gegen Natrium-
alginat oder anionischer Kohlenhydratpolymere konnten die Interaktionen zwischen
2

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 125
Bakterium und mobiler Beschichtung unterbunden und damit das Problem der Kon-
zentrationsabhängigkeit behoben werden. Die Voruntersuchungen zur Entwicklung
der UV-CE-Methode in Abschnitt 4.2.6.2 zeigten jedoch, dass vor allem der Teststamm
P. fluorescens sehr empfindlich auf hohe Ionenstärken reagiert, wodurch eine Kontrolle
der Bakterienadsorption an der Beschichtung auf elektrostatischem Wege in unserem
Fall nicht möglich war und in der Injektionstechnik nach einer Lösung des Problems
gesucht wurde.
4.3.5.1 Injektionstechnik
Offensichtlich kommt es bei der Injektion einer relativ großen Zelldichte zu Wech-
selwirkungen der Bakterienzellen untereinander, wodurch “sample stacking” erreicht
wird und die Verzögerung der elektrophoretischen Wanderung durch Wandadsorpti-
on verhindert wird (Abschnitt 4.2.6.4). Die Fokussierung der Signale stark verdünnter
Fluoreszenz-markierter Bakteriensuspensionen (10 5 -10 7 Zellen/ml) gelang schließlich
durch eine zweite Injektion einer unmarkierten Zellsuspension mit einer Konzentra-
tion von 0.5 OD600 (≈1.5 x 10 8 Zellen/ml). In Abbildung 4.46 ist der fokussierende
Effekt der Nachinjektion am Beispiel der Pseudomonas-Spezies dargestellt. Die Elek-
tropherogramme Fluoreszenz-markierter gesunder Bakteriensuspensionen mit einer
Konzentration von 1.5 x 10 6 Zellen/ml wurden unter dem Einfluss verschiedener un-
markierter Bakterienkonzentrationen der zweiten Injektion bei 520 nm aufgezeichnet.
Zur Fluoreszenzmarkierung wurden die im nächsten Abschnitt (Abschnitt 4.3.5.2) be-
schriebenen und validierten Markerkonzentrationen eingesetzt. Ähnlich wie in Abbil-
dung 4.38a zeigten sich charakteristische Peakmuster in Abhängigkeit der Zelldichte in
der zweiten Injektion. Während Elektropherogramme Fluoreszenz-markierter Bakteri-
ensuspensionen ohne nachfolgende Injektion keine Signale innerhalb 30 Minuten auf-
wiesen (Abbildung 4.46(A)), wurden die Peaks mit zunehmender Zellkonzentration
in der nachinjizierten Bakteriensuspension mehr und mehr fokussiert. Mit einer nach-
injizierten 0.1-OD600-Zellsuspension wurde ein breites Signal nach einer Migrations-
zeit von 30 Minuten (Abbildung 4.46(B)) erhalten, das mit einer 0.5-OD600-Suspension
zu einem scharfen Peakmuster mit einer Trennleistung von ca. 200.000 theoretischer
Böden/m führte und die Zusammensetzung der Bakterienpopulation, bestehend aus
Einzelzellen und Zellketten, beschrieb (Abbildung 4.46(C)).

126 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.46: ”Sample stacking” durch zweite Injektion einer unmarkierten hoch-konzentrierten
Bakteriensuspension (OD600=0.5, d.h. 1.5 x 10 8 Zellen/ml ). Elektropherogramme einer Fluoreszenzmarkierten
Pseudomonas-Suspension mit einer Konzentration von 1.5 x 10 6 Zellen/ml (A) ohne Zweitinjektion
unmarkierter Zellen, (B) mit Zweitinjektion einer unmarkierten Zellsuspension in einer Konzentration
von 0.1 OD600 und (C) mit Zweitinjektion einer unmarkierten Zellsuspension in einer Konzentration
von 0.5 OD600. Fluoreszenzmarkierung: für 200 µl Zellsuspension mit 1.5 x 10 6 Zellen/ml
wurde je 1 µl einer 0.033 mM SYTO9- und 20 mM Propidiumiodid-Lösung verwendet. Die markierte
und unmarkierte Probe wurde hintereinander bei einem Druck von 0.5 psi für 10 s injiziert. Trennpuffer:
0.0125 % PEO, 0.78 mM Tris-Borat und 0.018 mM Na2EDTA bei einem pH-Wert von 8.7. CE-
Bedingungen: Quarzglaskapillare mit einer Gesamtlänge von 31.5 cm, einer Detektionslänge von 21 cm;
Spannung konstant angelegt von 10 kV; Temperatur 23 ◦ C und LIF-Detektion: Anregung bei 488 nm
und Emission bei 520 nm.

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 127
4.3.5.2 Validierung der Fluoreszenzmarkierung
4.3.5.2.1 Korrelationsfunktion 1. Ordnung
Die Validierung der Markerkonzentration und des Verhältnisses beider Marker in der
LIF-CE-Methode geschah auf der Grundlage der Ergebnisse der FMR-Methode. Die
zur Sättigung einer Zellkonzentration von 1.5 x 10 7 Zellen/ml eingesetzte SYTO9-
Konzentration von 1.67 µM wurde 1:10 verdünnt und in der LIF-CE-Methode ange-
wandt, zumal die zur Fokussierung notwendige zweite Injektion unmarkierter Zel-
len die direkte Bestimmung der Markersättigung verhinderte. Dagegen konnte die
” richtige” Propidiumiodid-Konzentration durch Prüfung der Korrelation zwischen
grün/roter Fluoreszenz und dem prozentualen Anteil lebender Zellen auf Linearität
neu ermittelt werden.
Für eine lineare Korrelation zwischen dem Verhältnis grün/roter Fluoreszenz und dem
prozentualen Anteil lebender Zellen wurden 1.5 x 10 6 Zellen/ml mit 0.167 µM SYTO9
und 100 µM Propidiumiodid für 15 Minuten unter Lichtausschluss inkubiert.
Die entsprechenden Elektropherogramme wurden für P. fluorescens und S. vestibularis
unter Verwendung einer Nachinjektion unmarkierter Bakterien in einer Konzentra-
tion von 0.5 OD600 im Zwei-Kanal-Modus des Argon-Laser-induzierten-Fluoreszenz-
Detektors bei 520 nm und 655 nm aufgezeichnet und sind in Abbildung 4.48 und Ab-
bildung 4.49 dargestellt. Sie enthalten
• den Anteil lebender Zellen bei 520 nm,
• den Anteil toter Zellen bei 655 nm,
• die spektrale Überlappung von SYTO9 und Propidiumiodid und
• nahezu keine Hintergrundfluoreszenz.
Ihre Auswertung erfolgte durch Integration aller Signale über das gesamte aufgezeich-
nete Zeitfenster. Die Änderungen der elektrophoretischen Fingerabdrücke je nach Zu-
stand einer Bakterienpopulation werden im nächsten Abschnitt diskutiert. In Abbild-
ung 4.47 sind die zur Kalibrierung der Vitalität bestimmten ” Vitalitätsgeraden” von P.
fluorescens und S. vestibularis abgebildet. Für die Korrelationsfunktion f(x) = ax + b
ergaben sich folgende Geradengleichungen und Bestimmtheitsmaße:
P. fluorescens : f(x) = 4.71 · x + 0.43, R 2 = 0.981
S. vestibularis : f(x) = 22.38 · x + 0.56, R 2 = 0.996

128 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.47: ” Vitalitätsgeraden”
von P. fluorescens und S. vestibularis
aus der Mittelung über
vier Wiederholexperimente. Die
Zellmarkierung von 1.5 x 10 6
Zellen/ml erfolgte mit 0.167 µM
SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid.
Gemessen wurde an der
LIF-CE bei einer Anregungswellenlänge
von 488 nm und dualer
Emission bei 520 nm und
ratio of green/red fluorescence
25
20
15
10
5
P. fluorescens
S. vestibularis
0
0 20 40 60 80 100
655 nm. percentage of live cells
Wie bei der FMR-Methode wurde die Korrelation zwischen dem grün/roten Fluores-
zenzverhältnis und dem prozentualen Anteil lebender Zellen insgesamt viermal ge-
messen. Für die Streuung der einzelnen Messergebnisse ergab sich eine relative Stan-
dardabweichung von ≤ 18% für P. fluorescens und ≤ 12% für S. vestibularis. Vermutlich
verursacht die geringe Probenmenge die im Vergleich zur FMR-Methode (P. fluorescens
≤ 8% ,S. vestibularis ≤ 4%) höheren Standardabweichungen.
Die angemessenen R 2 -Werte sind jedoch ein Indiz dafür, dass die unmarkierten Zel-
len der zweiten Injektion lediglich als “stacking front” dienen und durch überschüssi-
ge Fluoreszenzmarker nicht wesentlich beeinflusst werden. Eine genaue Überprüfung
durch Waschen der markierten Zellen zur Entfernung überschüssiger Fluoreszenzmar-
ker war jedoch aufgrund der geringen Zellmenge selbst mittels Ultrazentrifugation
nicht möglich.
4.3.5.2.2 Unterschiede zwischen FMR und LIF-CE
Vergleicht man das optimale Markerverhältnis der FMR- und der LIF-CE-Methode
miteinander, so ist bei der LIF-CE-Methode bezogen auf die gleiche Zellzahl die 100-
fache Propidiumiodid-Konzentration notwendig. Ursache liegt vermutlich in der un-
terschiedlichen Art der Detektion. Beim FMR wird die gesamte Fluoreszenz aus einem
Gesamtvolumen von 200 µl in einer Vertiefung mit einem Durchmesser von 0.8 cm er-
fasst. Dadurch liefert die Hintergrundfluoreszenz den größten Beitrag zur detektierten
Lichtintensität, wenn man berücksichtigt, dass bei einem durchschnittlichen Zellradi-
us von 0.5 µm die Bakterienzellen eine Volumenfraktion von unter 10 −5 besetzen. Für
die Messungen von rein mit SYTO9 markierten Zellen fällt der extrazelluläre Beitrag
aufgrund der verstärkten Fluoreszenzintensität von SYTO9 bei DNA-Bindung weni-
ger stark ins Gewicht. Propidiumiodid jedoch zeigt bei DNA-Bindung im Vergleich
zur frei vorliegenden Form nur eine geringfügig höhere Intensität [28, 254], so dass
die detektierte Emission stark von der Hintergrundfluoreszenz abhängt, wodurch zum

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 129
Beispiel auch eine unvollständige Zellmarkierung kompensiert werden kann. Die Ka-
librierung der ermittelten grün/rot-Verhältnisse auf den prozentualen Anteil lebender
Zellen lässt zwar insgesamt Rückschlüsse auf die Konstitution einer Bakterienkultur
zu, gibt jedoch keine korrekte Markierung der Zellen wieder. Hierzu ist es notwendig,
die Zellen wie in der Kapillarelektrophorese als Einzelobjekte zu detektieren. Die er-
mittelten Markerkonzentrationen stehen in Einklang mit zahlreichen in der Literatur
beschriebenen Beispielen [4, 14].
4.3.5.3 Charakteristische “fingerprints”
In Abbildung 4.48 und Abbildung 4.49 sind die Elektropherogramme der Pseudomon-
as- und Streptococcus-Spezies bei unterschiedlichen lebend/tot-Verhältnissen und
dualer Detektion bei 520 nm und 655 nm dargestellt. Bei näherer Betrachtung kann
zwischen den Fingerabdrücken bei 520 nm und 655 nm und der Konstitution der
Bakterienpopulation eine Korrelation gefunden werden. Sie wird nachfolgend am Bei-
spiel der Pseudomonas-Spezies diskutiert, gilt aber in ähnlicher Weise auch für den
Streptococcus-Stamm. Überwiegt der Anteil gesunder Zellen in der Probe - repräsen-
tiert durch Bakterienproben bei einem lebend-Anteil von 60-100 % - sind die Peakmu-
ster bei 520 nm denen UVmetrisch vermessener Bakterienproben aus der stationären
Phase sehr ähnlich (Abbildung 4.33). Die Fingerabdrücke der LIF-CE zeigen lediglich
eine Verschiebung zu längeren Migrationszeiten. Die Ursache hierfür liegt vermutlich
im höheren Strom, hervorgerufen durch eine höhere Leitfähigkeit aufgrund der Mar-
kerkonzentration in der Probe. Ein großes Signal nach einer Migrationszeit von 12 Mi-
nuten repräsentiert Einzelzellen und dominiert das Elektropherogramm dieser Kon-
stitutionsklasse. Im Gegensatz dazu erscheint die Fluoreszenz der Signale der Ketten
bei längeren Migrationszeiten sehr schwach (Abbildung 4.48(A)). Die entsprechenden
Signale bei 655 nm (Abbildung 4.48(B)), welche durch tote Zellen und der spektralen
Überlappung zwischen SYTO9 und Propidiumiodid hervorgerufen werden, zeigen ei-
ne sehr geringe Intensität.
Mit steigendem tot-Anteil - repräsentiert durch Bakterienproben mit einem lebend-
Anteil von 0-40 % - nimmt das Einzel-Zell-Signal bei 520 nm stark ab (Abbildung
4.48(A)). Gleichzeitig steigt die Intensität der Signale mit längerer Migrationszeit bei
655 nm (Abbildung 4.48(B)). Auf diese Weise korreliert der Zelltod mit der Ketten-
bildung, die durch Potenzialänderungen in der äußeren Zellmembran hervorgerufen
wird. Änderungen in der Konstitution einer Bakterienkultur können somit anhand
elektrophoretischer Peakmuster mitverfolgt werde. Die Abhängigkeit der Kettenbil-
dung von der Zellkonstitution konnte in Abbildung 4.50 mikroskopisch verifiziert
werden.

130 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.48: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid)
bei unterschiedlichen lebend/tot-Verhältnissen (100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 0 %). Die
Elektropherogramme wurden nach Anregung bei 488 nm im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenlänge
von (A) 520 nm (grün, lebende Zellen) und (B) 655 nm (rot, tote Zellen) aufgezeichnet.
Für CE-Bedingungen und Probenmarkierung siehe Abbildung 4.46 und Abbildung 4.47. Aufgrund der
spektralen Überlappung der beiden Fluoreszenzmarker zeigen auch 100 % lebende Zellen eine geringe
Intensität der für tote Zellen charakteristischen roten Fluoreszenz.

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 131
Abbildung 4.49: Elektropherogramme von S. vestibularis (fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid)
bei unterschiedlichen lebend/tot-Verhältnissen (100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, 0 %). Die
Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenlänge von (A) 520 nm
(lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Für CE-Bedingungen und Detektion siehe
Abbildung 4.48.

132 4. Ergebnisse und Diskussion
(a) (b)
Abbildung 4.50: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen SYTO9- und Propidiumiodid-markierter P.
fluorescens-Spezies in einer Zellsuspension mit 1.5 x 10 8 Zellen/ml. (a) Bakterienprobe aus der stationären
Phase mit ca. 100 % lebenden Zellen. (b) 100 % tote Zellen. Die Abtötung erfolgte mit Isopropanol
(siehe Abschnitt 5.1.7.2.5). Aufgenommen wurde die Emission nach einer Anregung bei 488 nm bei
520 und 655 nm. In Anlehnung an die fluorimetrischen Messungen wurden zur Zellmarkierung 16.7 µM
SYTO9 und 100 µM Propidiumiodid verwendet. Bildgröße: 86.5 µm x 64.6 µm.
Ähnliche Ergebnisse beschrieben auch De Carvalho et al. [74]. In ihrer Studie wurde
an den Teststämmen Mycobakterium sp. NRRL B-3805, Rhodococcus erythropolis DCL14
und Pseudomonas putida S12 die Bildung von Clustern in Abhängigkeit verschiedener
Lösungsmittel mikroskopisch untersucht. So bildete z. B. die Pseudomonas-Spezies un-
ter dem Einfluss von Toluen und Bis(2-ethylhexyl)phthalat zahlreichere und größere
Cluster als bei Zusatz von n-Dodecan. Die zusätzliche Fluoreszenzmarkierung mit SY-
TO9 und Propidiumiodid brachte Einblick in die zeitliche Änderung der Konstitution
der jeweiligen Bakterienproben und zeigte bei diesen beiden Lösungsmitteln im Ver-
gleich zu anderen einen wesentlich schnelleren Vitalitätsverlust. Die Ursachen für die
ausgeprägte Clusterbildung liegt vermutlich in der Änderung der Hydrophobizität
und Hydrophilizität der Zellmembran. Änderungen in der Hydrophobizität der Zell-
oberfläche und in der Zusammensetzung der Membranproteine und damit der Ober-
flächenladung wurden auch für mehrere Pseudomonas-Spezies nach Exposition mit Ce-
fotaxim, Amoxicillin/Clavulansäure und Amikacin von Kustos et al. [154] berichtet.
4.3.5.4 Testung
In der LIF-CE erfolgte die Untersuchung der antibiotischen Wirkung anhand der
Änderungen im elektrophoretischen Profil der Bakterien und gleichzeitiger Lebend-
Tot-Bestimmung. Dazu wurden Elektropherogramme der P. fluorescens- und S. vestibu-
laris-Spezies nach Exposition mit Ciprofloxacin bzw. Vancomycin im Konzentrations-
bereich zwischen 0.01 und 100 µM bei 520 nm und 655 nm simultan aufgezeichnet (Ab-
bildung 4.52 und Abbildung 4.53). Für jede Konzentration wurde nach Integration der

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 133
percentage of live cells
120 Ciprofloxacin
100
80
60
40
20
0
10
-3
-2
10
-1
VancomycinHCl
10 1 10
10
Concentration [ µ M]
2
Abbildung 4.51: Dosis-Wirkungs-Kurven
von Ciprofloxacin
für P. fluorescens und Vancomycin
für S. vestibularis mittels
LIF-CE. Für die Messbedingungen
siehe Abbildung 4.47
Elektropherogramme aus den grün/rot-Fluoreszenzintensitäten mittels der erstellten
Korrelationsgeraden das Verhältnis lebender zu toter Zellen berechnet. Die entspre-
chenden Dosis-Wirkungs-Kurven in Abbildung 4.51 sind denen aus der FMR-Methode
sehr ähnlich und zeigen einen typischen sigmoidalen Kurvenverlauf. Insgesamt wurde
die Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit dreimal durchgeführt. Mittels linea-
rer Interpolation [134] ergab sich für Ciprofloxacin gegen P. fluorescens ein ED50-Wert
von 1.9±1.0 (Standardabweichung: 52.6 %) und für Vancomycin gegen S. vestibularis
ein ED50-Wert von 0.2±0.07 (Standardabweichung: 35.0 % ). Damit stehen beide ED50-
Werte bei zwar etwas höheren Standardabweichungen in gutem Einklang mit den Er-
gebnissen aus der FMR-Methode und dem Mikrodilutionsverfahren. Betrachtet man
die entsprechenden Elektropherogramme in Abbildung 4.52 und Abbildung 4.53, er-
kennt man bei P. fluorescens und S. vestibularis deutlich die ansteigende Kettenbildung
ab einer antibiotischen Behandlung mit einer Konzentration von 1 µM. Die visuelle
Auswertung ergibt somit eine gute Abschätzung für die berechneten Toxizitäten.

134 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.52: Elektropherogramme der P. fluorescens-Spezies nach Inkubation mit unterschiedlichen
Ciprofloxacin-Konzentrationen. Für CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung
4.46. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenlänge von (A)
520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet.

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 135
Abbildung 4.53: Elektropherogramme der S. vestibularis-Spezies nach Inkubation mit unterschiedlichen
Vancomycin-Konzentrationen. Für CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung siehe Abbildung
4.46. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-Modus bei einer Emissionswellenlänge von (A)
520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet.

136 4. Ergebnisse und Diskussion
4.3.6 Möglichkeiten und Grenzen
4.3.6.1 Lösungsmittel-Effekt und Wirkmechanismus
Zur Überprüfung der Eignung der beiden neuen Screening-Verfahren wurden zwei
weitere, in Abbildung 4.54 abgebildete Antibiotika zur Testung ausgewählt:
• Ofloxacin gegen P. fluorescens:
Ofloxacin ist wie Ciprofloxacin ein 4-Chinolon-3-carbonsäure-Derivat und gehört
ebenfalls zur Gruppe der Gyrase-Hemmstoffe. Es ist im Gegensatz zu Ciprofloxa-
cin in Wasser schlecht löslich. Eine ausreichende Löslichkeit ist nur in Gegenwart
schwacher Säuren oder Laugen gegeben, womit der Einfluss von Lösungsmitteln
auf die Testung und Fluoreszenzemission geprüft werden konnte.
• Ampicillin-Na gegen S. vestibularis:
Dieses Penicillin-Derivat ist ein Hemmstoff der Zellwandsynthese. Es hemmt das
Enzym Transpeptidase, welches die Aminozuckerketten in der Zellwand ver-
knüpft. Die Folge kann ein Anschwellen und Platzen der Zellen sein. Das Test-
verfahren konnte somit bei einem weiteren antibiotischen Wirkmechanismus an-
gewandt werden. Ampicillin-Na ist sehr gut wasserlöslich.
Penicillin
COO
-
O
N
R
H H
S
CH 3
CH 3
*
H N 3 H
+
Ampicillin
O
O
N
H
N
H H
COO
-
S
CH 3
CH 3
C
H 3
N
F
N
Ofloxacin
O
O
N
*
CH 3
COOH
Abbildung 4.54: Strukturen der Arzneistoffe, die zur Überprüfung der Eignung der FMR- und LIF-CE-
Methode eingesetzt wurden.
Zur Bestimmung der antiinfektiven Wirksamkeit wurde Ofloxacin in 0.1 M NaOH und
Ampicillin-Na in H2O gelöst. Tabelle 4.6 fasst alle bisher ermittelten ED50 und MIC-
Werte aus der FMR-, LIF-CE-Methode und dem Mikrodilutionsverfahren und die ver-
wendeten Lösungsmittel zusammen. Die Bestimmung der ED50-Werte wurde zwei-
mal wiederholt. Die MIC-Werte wurden dagegen nur einmal gemessen und standen
auch für Ampicillin und Ofloxacin in Einklang zu berichteten Ergebnissen [102, 122].
Die antibiotische Wirkung von Ciprofloxacin auf P. fluorescens und Ampicillin und Van-
comycin auf S. vestibularis führte unter allen drei Testmethoden zu ähnlichen Ergebnis-
sen: Während die ED50-Werte des Ciprofloxacins den MIC-Wert sehr gut wiedergaben,
zeigten beide ED50-Werte des Ampicillin und bei Vancomycin der ED50-Wert mittels

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 137
FMR-Methode eine Abweichung von einer 10er Potenz, was jedoch immer noch im
Rahmen der üblichen Streuungen bei In-vitro-Testverfahren [175] liegt. Dagegen wur-
den bei Ofloxacin gegen P. fluorescens mit dem “BacLight viability kit” sowohl mit der
FMR- als auch der LIF-CE-Methode irreführende hohe ED50-Konzentrationen erhalten.
Ofloxacin Ciprofloxacin Ampicillin-Na Vancomycin-HCl
in 0.1 M NaOH in H2O in H2O in H2O
ED50 (FMR) >100 5.1±1.6 5.8±1.6 2.4±0.7
ED50 (LIF-CE) >100 1.9±1.0 9.5±1.5 0.2±0.07
MIC 3.0 3.0 0.7 0.7
Tabelle 4.6: Ergebnisse der antibiotischen Wirksamkeit von Ofloxacin, Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und
Vancomycin-HCl. Bestimmt wurden die Ergebnisse mittels FMR, LIF-CE und Mikrodilutionsverfahren.
Die Zahlenwerte sind in µM angegeben und beziehen sich auf die Salz-freie Arzneistoffform. Die
Messungen mittels FMR und LIF-CE wurden zweimal wiederholt, während die MIC-Werte einmal bestimmt
wurden. Ofloxacin und Ciprofloxacin wurden gegen P. fluorescens getestet. Ampicillin-Na und
Vancomycin-HCl gegen S. vestibularis.
Mehr Aufschluss über das Versagen der fluorimetrischen Methoden am Beispiel Oflo-
xacin brachten die entsprechenden elektrophoretischen Fingerabdrücke bei 520 und
655 nm. In Abbildung 4.55 sind die Elektropherogramme von P. fluorescens nach Expo-
sition mit unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen zusammen mit einer Positiv-
kontrolle abgebildet. Für niedrige Ofloxacin-Konzentrationen im Bereich 0.01 bis 0.1
µM, weisen die Elektropherogramme das charakteristische Lebend-Muster auf, d. h.
ein großes Signal bei einer Migrationszeit von ca. 10 Minuten dominiert die Elektro-
pherogramme bei 520 nm (Abbildung 4.55(A)) während die Peakmuster bei 655 nm ei-
ne verminderte Fluoreszenzintensität aufweisen (Abbildung 4.55(B)). Mit ansteigender
Ofloxacin-Konzentration nimmt die Fluoreszenzintensität der Signale der Ketten bei
655 nm mehr und mehr zu (Abbildung 4.55(B)), gleichzeitig nimmt die Fluoreszenz-
emission des Einzel-Zell-Signals bei 520 nm immer mehr ab (Abbildung 4.55(A)) und
das charakteristische Tot-Muster erscheint bei einer 10 µM Lösung. Bei einer Ofloxacin-
Konzentration von 100 µM verschwindet dieses Muster jedoch und nimmt eine vitale
Populationscharakteristik an. Die Vermutung liegt nahe, dass dieser Effekt lösungs-
mittelbedingt ist. Wahrscheinlich kumuliert bei dieser Konzentration der zytotoxische
Effekt des Antibiotikums mit dem der 1 %igen 0.1 M NaOH-Lösung (durch den Einsatz
10 mM Antibiotika-Stammlösungen befindet sich bei der Testung nur 1 % des Lösungs-
mittels in der Bakterienkultur, siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.7.2.5) und ver-
ursacht das Lysieren der Bakterienzellen, wodurch ein falsches grün/rot-Verhältnis
beobachtet wird. Ähnliche Resultate ergaben sich auch bei Einsatz von DMSO als
Lösungsmittel. Die Hypothese der zytotoxischen Kumulation konnte durch die erneu-

138 4. Ergebnisse und Diskussion
te Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit des Ciprofloxacins unter der Verwen-
dung von 0.1 M NaOH und DMSO als Lösungsmittel bestätigt werden.
Abbildung 4.55: Elektropherogramme von P. fluorescens (Fluoreszenz-markiert mit SYTO9 und Propidiumiodid)
bei unterschiedlichen Ofloxacin-Konzentrationen. Ofloxacin ist in der Stammlösung in 0.1 M
NaOH gelöst. Durch Verdünnung mit Medium befinden sich in den Zellinokula ledig1ich 1 % 0.1 M
NaOH. Die Elektropherogramme wurden im Zwei-Kanal-System bei einer Emissionswellenlänge von
(A) 520 nm (lebende Zellen) und (B) 655 nm (tote Zellen) aufgezeichnet. Für CE-Bedingungen und Fluoreszenzmarkierung
siehe Abbildung 4.46.

4.3 Charakterisierung einer Bakterienpopulation durch Fluoreszenzmarkierung 139
4.3.6.2 Potenzial-Praktikabilität-Ausblick
Die Fluoreszenzmarkierung Arzneistoff-exponierter Bakterienkulturen mit den beiden
Fluoreszenzmarkern SYTO9 und Propidiumiodid ermöglicht eine schnelle, differen-
zierte Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit. Die beiden fluorimetrischen Me-
thoden mittels FMR und LIF-CE können im Gegensatz zum konventionell, im HTS an-
gewandten Mikrodilutionsverfahren nach DIN 58940-8 schnell zwischen zytotoxischer
und zytostatischer Wirkung unterscheiden. Dennoch sind die fluorimetrischen Metho-
den eher zur Ergänzung als zur Substitution des Mikrodilutionsverfahrens geeignet.
Zwar erfüllt die LIF-CE-Methode die Voraussetzung der Miniaturisierung, doch er-
weisen sich Parallelisierung und Automatisierung, die Schlüsselworte für Verfahren
mit hohem Durchsatz aufgrund einiger Waschschritte als schwierig. Das Potenzial der
LIF-CE-Methode besteht darin, dass aus dem elektrophoretischen Profil einer Bakteri-
enprobe aufgrund verschiedener Aggregate unterschiedlicher Größe Rückschlüsse auf
die Bakterienkonstitution unter Exposition eines Antibiotikums gezogen werden kann.
Dies verhindert jedoch die simultane Analyse verschiedener Bakterien-Spezies. Den-
noch eignet sich vor allem die LIF-CE-Methode aufgrund ihrer hohen Aussagekraft
auch bezüglich der Erkennung von Lösungsmittelinkompatibilitäten als ergänzende
Methode zum Mikrodilutionsverfahren im HTS und erlaubt eine differenzierte Akti-
vitätsbestimmung innerhalb von 30 Minuten.
4.3.7 Fazit: Fluorimetrische “In-vitro-whole-cell-bioassays”
• Die beiden neuen fluorimetrischen Zytotoxizitäts-Assays mittels FMR und LIF-
CE stellen eine gute Ergänzung zum konventionellen Mikrodilutionsverfahren
dar und verhindern das zeitaufwändige Zählen koloniebildender Einheiten.
• Die Korrelation der grün/rot-Fluoreszenzverhältnisse mit dem prozentualen An-
teil lebender Zellen erlaubt eine schnelle Erstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven
und die Berechnung von ED50-Werten.
• Die neue LIF-CE-Methode gelang unter Verwendung einer “stacking front”
durch Nachinjektion unmarkierter Zellen und lässt aus dem elektrophoretischen
Profil einer Bakterienkultur Rückschlüsse auf die Zytotoxizität einer Testsub-
stanz zu, wodurch ein neuer Ansatzpunkt für Testverfahren offensteht.
• Inkompatibilitäten zwischen Bakterien, Lösungsmittel und Arzneistoff limitie-
ren den Anwendungsbereich der beiden Methoden, können aber mittels LIF-CE
erkannt werden.

140 4. Ergebnisse und Diskussion
4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachs-
tum
Überblick:
Im Folgenden wird auf der Basis der magnetischen Kernresonanz-
tomographie (magnetic resonance tomography, MRT) ein High-
Throughput-Screening-Verfahren für potenzielle Wirkstoffe gegen
Bakterien entwickelt. Die transversale Relaxation T2 dient dabei als
charakteristischer Parameter für die Beschreibung des Zellwachs-
tums, das durch wirksame Substanzen inhibiert wird. Änderungen
dieses Parameters werden sowohl durch den Energie- und Ami-
nosäurestoffwechsel der Erreger, als auch durch den Effekt von Wirk-
stoffen hervorgerufen und basieren auf Änderungen im chemischen
Austausch. Durch Kombination von MR-Spektroskopie (magnetic re-
sonance spectroscopy, MRS) und -Bildgebung (magnetic resonance
imaging, MRI) werden die T2-Variationen quantifiziert und interpre-
tiert, wodurch eine Quantifizierung der antibiotischen Wirksamkeit
möglich wird.
4.4.1 Beschreibung einer Bakterienkultur mittels NMR
Während der Proliferation von Mikroorganismen ändern sich sowohl die stoffliche
Zusammensetzung als auch die chemischen und physikalischen Parameter der Zell-
kultur. Mit der NMR-Spektroskopie steht ein gut etabliertes Verfahren zur Analy-
se der Mediumzusammensetzung zur Verfügung. Durch Nährstoffverzehr und Stoff-
wechselproduktion ändert sich dieses mit fortschreitendem Wachstum. Anhand hoch
aufgelöster NMR-Spektren können metabolische Profile, sogenannter Fingerabdrücke
(”fingerprints”) erstellt werden, wodurch eine chemotaxonomische Identifizierung
und Charakterisierung von Bakterien möglich wird [120, 121]. Die Änderungen der
chemischen und physikalischen Parameter wie Viskosität, pH-Wert und Ionenstärke
haben einen großen Einfluss auf den chemischen Austausch und spiegeln sich vor al-
lem in Änderungen der NMR-Parameter wie Diffusion, Magnetisierungstransfer und
Relaxationszeiten wider. Der Zusammenhang zwischen pH-Wert und Zellproliferati-
on bildet unter Verwendung von pH-Indikatoren auch die Basis kolorimetrischer Zy-
totoxizitäts-Assays (Abschnitt 1.2.2), womit NMR-Parameter interessante Alternativen
darstellen.

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 141
4.4.2 Chemischer Austausch
Betrachtet man im Kulturmedium, welches in der Regel aus einer Protein-Wasser-
Mischung besteht, das Wassersignal, so kann es sich dabei um Protonen aus gebun-
denem Wasser, freiem Wasser oder um protonierte basische oder saure funktionel-
le Gruppen des Proteins wie -NH, -NH2, -OH, -SH und COOH handeln [108]. In
jedem Zustand unterscheiden sie sich bezüglich ihrer translatorischen Mobilitäten,
ihrer Larmorfrequenzen und ihrer unterschiedlichen lokalen Relaxationsraten. Die
theoretische Betrachtung der Fluktuation zwischen unterschiedlichen Zuständen wird
üblicherweise als chemischer Austausch bezeichnet und basiert auf den erweiterten
Bloch-Gleichungen von McConnell [172] (Abschnitt 3.5.2.2). Spektroskopisch kann der
schnelle chemische Austausch als Linienverbreiterung des austauschenden Protons be-
obachtet werden [18]. Eine Temperatur- und pH-Abhängigkeit der Linienbreite auf-
+ NH3 N
H
N
O
Abbildung 4.56:
Cytosin
grund des chemischen Austausches wurde z. B. für das Aminoproton
der Nucleinsäure Cytosin beschrieben [171]. Bei einem komplexen N-
Spin-System, wie es bei Bakterienkulturen vorliegt, wird eine quanti-
tative Auswertung spektroskopisch jedoch sehr schwierig. Die Bildge-
bung ermöglicht dagegen Änderungen des chemischen Austausches
während der Zellproliferation global mitzuverfolgen. Der Diffusions-
koeffizient, welcher mit einer pulsed-field-gradient-spin-echo-Sequenz
(PGSE) gemessen werden kann, ist zwar ein möglicher Parameter, er-
fordert jedoch für die Charakterisierung von Bakterienkulturen extrem
starke Gradienten [209], die bei den meisten Gradientensystemen nicht verfügbar sind.
In der Diplomarbeit von M. Oechsner [192] konnte am Teststamm E. coli gezeigt wer-
den, dass sich in der Bildgebung der Parameter T2 zur Beschreibung des Zellwachs-
tums von Bakterienkulturen am besten eignet. Er kann mittels Carr-Purcell-Meiboom-
Gill(CPMG)-Sequenz [174] gemessen werden und zeigt im Vergleich zur longitudi-
nalen Relaxation und dem Magnetisierungstransferkontrast die wachstumsbedingten
Änderungen am ausgeprägtesten. Die transversale Relaxation unter dem chemischen
Austausch beinhaltet zum einen die Fluktuation der Protonen selbst und zum ande-
ren den innewohnenden Relaxationsprozess und ist in der Literatur solide beschrieben
(Abschnitt 3.5.2.2).
4.4.3 Anwendungsbreite des Parameters T2
In der Diplomarbeit von M. Oechsner [192] konnte zwar die Eignung der transversalen
Relaxation zur Beschreibung der Zellproliferation am Beispiel E. coli gezeigt werden,
doch gab es keinen Hinweis darauf, inwieweit die Methode auf andere Bakterienar-
ten anwendbar war. Aufschluss darüber sollten die charakteristischen T2-Kurven der
vier bereits kapillarelektrophoretisch analysierten und standardisierten Bakterienspe-

142 4. Ergebnisse und Diskussion
zies S. vestibularis, P. fluorescens, M. luteus und N. cinerea geben. Die Messung erfolgte
in vier 5 mm-NMR-Röhrchen, die zwei Milliliter der jeweiligen Zellsuspension ent-
hielten. Die Zellen waren in Brain-Heart-Infusion(BHI)-Bouillon suspendiert und ihre
Konzentration wurde bei allen Bakterienspezies auf einen OD600-Wert von 0.015 ein-
gestellt. Zur Erstellung der T2-Kurven wurde die transversale Relaxation der vier Bak-
terienproben zusammen mit einer Negativkontrolle, die aus reinem Medium bestand,
bei 30 ◦ C über einen Zeitraum von 48 h mittels CPMG-präparierter MRT bei 17.6 T
simultan gemessen. Dazu wurde im Abstand von 10 Minuten eine Bildserie aufge-
nommen und für jede Probe aus dem exponentiellen Intensitätsabfall jedes Pixels der
entsprechende T2-Wert, gemittelt über ein ROI (region of interest), berechnet. Die ge-
nauen Mess- und Geräteparameter, die Probenpräparation, die Auswertung der Bilder
und die verwendeten und teilweise programmierten MATLAB-Routinen sind in Ab-
schnitt 5.1.5.1, Abschnitt 5.1.7.2.6 und Anhang A und B näher beschrieben. Wie aus
den erweiterten Bloch-Gleichungen zu sehen ist , enthalten die gemessenen T2-Werte
in gewissem Maße eine Diffusionswichtung. Da jedoch die experimentellen Parame-
ter während der Messserien unverändert blieben, wurde der Einfluss der Diffusion als
konstant angenommen und T2 als gemessenes T2 definiert. Vergleicht man die gemes-
senen T2-Kurven in Abbildung 4.57, so weist die T2-Kurve von S. vestibularis während
des Zellwachstums mit 40 ms eine besonders starke T2-Änderung auf. Abgesehen von
einem kleinen T2-Anstieg von 85 ms auf 92 ms in der ersten Messstunde, fällt die Kur-
ve innerhalb der ersten fünf Stunden auf einen Wert von 75 ms ab, um anschließend bis
auf einen Wert von ca. 115 ms steil anzusteigen und dort in einem Plateau zu enden.
Der anfängliche T2-Anstieg wird auch von der Negativkontrolle durchlaufen und wird
durch eine verzögerte Temperierung des Messsystems (Messtemperatur ist 30 ◦ C) her-
vorgerufen. Der ansonsten konstante T2-Wert der Negativkontrolle ist ein Indiz dafür,
dass äußere Störfaktoren während der Messung wie z. B. Temperaturschwankungen
ausgeschlossen werden können. Die starke T2-Änderung spricht somit für ein schnel-
les und intensives Zellwachstum der Streptococcus-Spezies. Bei P. fluorescens und N.
cinerea dagegen sind die T2-Kurven zum einen zeitlich verzögert und zum anderen be-
trägt die gesamte T2-Änderung weniger als 5 ms, woraus auf ein verzögertes und ge-
hemmtes Wachstum geschlossen werden kann. Die M. luteus-Kurve verläuft während
der gesamten Messzeit parallel zur Kontroll-Kurve und zeigt keinerlei Änderungen.
Visuelle Untersuchungen der Proben nach der Messung bestätigten diese Ergebnisse:
Während die S. vestibularis-Probe einen starken weißen Zellniederschlag zeigte, konn-
te bei den beiden Bakterienspezies P. fluorescens und N. cinerea lediglich eine leich-
te Trübung des Mediums festgestellt werden. Bei der M. luteus-Probe blieb dagegen
das Kulturmedium klar, ohne sichtbare Kolloidpartikel. Offensichtlich fand hier in der
Messapparatur innerhalb der 48 h keine Zellproliferation statt. Maßgeblich für die un-
terschiedlichen T2-Kurven der vier verschiedenen Bakterienspezies waren in diesem

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 143
Experiment vor allem ihre spezifischen Wachstumsvoraussetzungen. Während P. fluo-
rescens, M. luteus und N. cinerea der Gruppe der strengen Aerobier angehört, ist ein
fakultativ anaerobes Wachstum bei S. vestibularis möglich. Ihre Kultivierung zeigte so-
wohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen ein schnelles intensives
Wachstum. Eine Abhängigkeit der Zellproliferation von der Gefäßgeometrie ist daher
nicht gegeben. Die Ursache für die verzögerte bzw. gehemmte Zellproliferation des
Pseudomonas-, Neisserien- und Micrococcus-Stammes liegt dagegen vermutlich im
zu geringen Sauerstoffgehalt während der Kultivierung in den schmalen 5 mm-NMR-
Röhrchen begründet, so dass die Methode unter den gegebenen Versuchsbedingungen
nur auf Anaerobier anwendbar ist.
T2 [ms]
T2 [ms]
120
115
110
105
100
95
90
85
80
75
S. vestibularis
Medium
70
0 500 1000 1500
t [min]
2000 2500 3000
96
94
92
90
88
86
(a) Streptococcus vestibularis
84
0 500 1000 1500
t [min]
2000 2500 3000
(c) Micrococcus luteus
M.luteus
Medium
T2 [ms]
T2 [ms]
94
93
92
91
90
89
88
87
86
85
P.fluorescens
Medium
84
0 500 1000 1500
t [min]
2000 2500 3000
94
93
92
91
90
89
88
87
86
85
(b) Pseudomonas fluorescens
N.cinerea
Medium
84
0 500 1000 1500
t [min]
2000 2500 3000
(d) Neisseria cinerea
Abbildung 4.57: T2-Kurven verschiedener Bakterienspezies während ihrer Zellproliferation in BHI-
Medium bei 30 ◦ C, gemessen bei 17.6 T
Ein Vergleich der unter identischen Versuchsbedingungen (30 ◦ C, BHI-Medium, 17.6 T)
aufgenommenen T2-Wachstumskurven von S. vestibularis und E. coli zeigt bei Anaero-

144 4. Ergebnisse und Diskussion
biern eine Bakterienspezifizität. Damit besteht die Möglichkeit T2-Kurven zur Erstel-
lung mikrobieller Fußabdrücke (”footprints”) zu nutzen.
Abbildung 4.58: T2-Wachstumskurve
von E. coli in
BHI-Medium bei 30 ◦ C und
17.6 T
T2 [ms]
100
95
90
85
80
75
E.coli
Medium
70
0 500 1000 1500
t [min]
2000 2500 3000
4.4.4 Analyse der Zellproliferation von S. vestibularis
Von den analysierten Bakterienspezies eignete sich S. vestibularis am besten zur Un-
tersuchung der Korrelation zwischen transversaler Relaxation und Zellwachstum und
damit zur Untersuchung des physikalischen Hintergrundes. Zur Quantifizierung und
Interpretation der Änderung des Parameters T2 mit zunehmender Zellzahl wurden
NMR-Bildgebung und -Spektroskopie miteinander kombiniert und von einem Satz
von Bakterienproben neben der transversalen Relaxation
• der pH-Wert (sensitiver Parameter zur Beschreibung der Stoffwechselaktivität),
• die optische Dichte bei 600 nm, OD600 (Charakteristikum für die Zellzahl), und
• 1 H-NMR-Spektren
zu unterschiedlichen Inkubationszeiten über einen Zeitraum von 12 h gemessen. Da-
durch war es möglich, stoffwechselbedingte Änderungen der Metaboliten-, Aminosäu-
re- und Proteinkonzentration im extrazellulären Kulturmedium zeitlich mitzuverfol-
gen. Die Bildgebungsexperimente wurden bei 17.6 T durchgeführt, die Protonenspek-
tren bei 9.4 T aufgezeichnet.
4.4.4.1 Korrelation zwischen T2, Zellzahl und pH
Der Probensatz bestand aus sechs 5 mm-NMR-Röhrchen, die mit 2 ml Zellsuspension
des Streptococcus-Stammes mit einer Anfangskonzentration von 0.015 OD600 gefüllt

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 145
T 2 [ms]
600
OD
180
160
140
120
100
80
medium
tube 1
tube 2
tube 3
tube 4
tube 5
tube 6
60
100 200 300 400
t [min]
500 600 700
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
OD600
pH
0
100 200 300 400 500 600 700
t [min]
5
7.5
7
6.5
6
5.5
pH
Abbildung 4.59: Zeitlicher Verlauf
der gemessenen T2-Werte
von sechs identischen Inokula
der Bakterienspezies S. vestibularis
und einer Negativkontrolle.
Gemessen wurde in BHI-
Medium im Abstand von 10 Minuten
bei 30 ◦ C und 17.6 T. Die
Bakterienproben wurden nacheinander
zu unterschiedlichen
Inkubationszeiten zur weiteren
Messung der optischen Dichte
und des pH-Wertes aus dem
Magneten herausgenommen. Zu
diesen Zeitpunkten fallen die T2-
Kurven auf Null ab.
Abbildung 4.60: OD600- und
pH-Werte der Streptococcus-
Suspensionen, unmittelbar nach
der Probenentnahme aus dem
Magneten.
waren. Ein siebtes, welches ausschließlich Medium enthielt, diente als Negativkon-
trolle, und sollte während der gesamten Messzeit keine T2-Änderungen aufweisen.
Der zeitliche T2-Verlauf der jeweiligen Proben ist in Abbildung 4.59 dargestellt.
Zu unterschiedlichen Wachstumsstadien der Bakterienkultur wurde die Akquisition
gestoppt und zu jedem dieser Zeitpunkte der OD600- und pH-Wert einer Bakterien-
probe gemessen. Diese Zeitpunkte sind durch auf Null abfallende Linien in Abbild-
ung 4.59 markiert. Die Durchführung der OD600- und pH-Messungen erforderte die
Herausnahme der Proben aus dem Magneten, wodurch es zu unvermeidbaren Tem-
peraturschwankungen kam. Diese verursachten die im T2-Verlauf der Bakterienpro-
ben beobachtbaren lokalen Minima zu den Zeitpunkten des Akquisitionsstopps. Die
identischen Minima traten auch in der Negativkontrolle auf, weshalb ein Sedimen-
tationsprozess der Bakterienkulturen als Ursache ausgeschlossen werden kann. Die
OD-pH-Bestimmung erfolgte zusätzlich zu Beginn und am Ende der tomographischen

146 4. Ergebnisse und Diskussion
Messung. Insgesamt wurde der OD und pH-Wert 1.8 h, 3.1 h, 4.3 h, 5.5 h, 6.7 h, 8.1 h
und 11.6 h nach Herstellung der Inokula gemessen und in einem Diagramm in Ab-
bildung 4.60 aufgetragen. Mit zunehmender Zellzahl, d. h. mit steigendem OD-Wert
fällt der pH stetig und stagniert in der stationären Phase des Bakterienwachstums. Die
T2-Kurve steigt, wie bereits in Abschnitt 4.4.3 beschrieben, nach initialem Abfall steil
an und endet ebenfalls in einem Plateau in der stationären Phase. Die Stagnation der
OD-, pH und T2-Werte beginnt nahezu zum gleichen Zeitpunkt und indiziert die Ein-
stellung der Bakterienproliferation.
4.4.4.2 Komponenten im BHI-Medium
Der erste Schritt zur Aufklärung der physikalischen Zusammenhänge bestand in der
Identifizierung maßgeblicher Komponenten im BHI-Vollmedium. Dieses Vollmedium
besitzt eine komplexe Zusammensetzung und besteht unter anderem aus Kalbs-Hirn-
und Rinder-Herz-Extrakt und Pepton (Abschnitt 5.1.7.2.2). Die Komponenten-Analyse
erfolgte anhand eines 1D- 1 H-Spektrums und 2D-COSY-Diagramms, welche bei 9.4 T
gemessen wurden (Abbildung 4.61). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4.7 zusammen-
gefasst und ergeben sich in Anlehnung an die Arbeiten von Govindaraju [109], Lin-
don [160] und Evans [89]. Im COSY- und 1D-Spektrum sind die identifizierten Sub-
stanzen nummeriert aufgeführt. Neben zahlreichen Aminosäuren und Kohlenhydra-
ten konnten die fünf Hauptmetabolite des anaeroben Stoffwechsels Acetat, Ethanol,
Formiat, Laktat und Succinat zugeordnet werden.
HO
HO
HO
4
4
HO
4
4
Struktur Funktionelle chem. Versch.
6
CH 2 OH
3
2
5
2
α-Glukose
6
CH 2 OH
3
2
5
2
O
1
OH OH
O
OH
β-Glukose
1
OH
Gruppe (ppm) in
1 CH
2 CH
3 CH
4 CH
5 CH
6 CH
1 CH
2 CH
3 CH
4 CH
5 CH
6 CH
H2O + 10 % D2O
5.2
3.5
3.7
3.4
3.8
nicht aufgelöst
4.6
3.2
nicht aufgelöst
nicht aufgelöst
3.4
3.8

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 147
-
OOC 1 CH
2
-
-
OOC 1
-
NH 3
OOC 1
-
-
OOC 1
OOC 1
3
CH2 +
Acetat
CH
2
NH 3
Alanin
4
CH2 2
CH3 +
Arginin
CH
2
NH 3
+
3
CH2 Aspartat
1
HO CH2 CH
2
Ethanol
-
NH 3
OOC 1
3
CH3 5
CH2 2
CH3 H
Formiat
+
3
CH2 4
CH2 Glutamat
OOC 1
CH
2
NH 3
Laktat
+
N H
C
4
COO
-
3
CH3 +
NH 2
5
COO
-
NH 2
2 CH3
2 CH
3 CH3
2 CH
3 CH2
4 CH2
5 CH2
2 CH
3 CH2
1 CH2
2 CH3
1.8
3.7
1.4
4.1
1.8
1.6
3.1
3.8
2.6
3.6
1.1
1 CH 8.4
2 CH
3 CH2
4 CH2
2 CH
3 CH3
3.8
2.1
nicht aufgelöst
4.0
1.3

148 4. Ergebnisse und Diskussion
-
OOC 1 CH
2
NH 3
3
CH2 +
-
OOC CH
-
OOC 1
-
a
4
CH2 Lysin
NH 3
5
CH2 b
1
CH2 +
Phenylalanin
OOC 1
a
-
OOC CH
2
CH2 3
CH2 Succinat
CH
2
NH 3
CH
3
+ OH
Threonin
NH 3
a
-
OOC CH
NH 3
+
b
CH2 Tyrosin
+
b
CH 3
2
2
2
2
6
CH2 3
6 5
4
4
COO-
4
CH3 NH 3
1 4
OH
6 5
1
N
H
Tryptophan
1 2 -
OOC CH
NH 3
+
3
Valin
CH
3
4
CH3 4
7
CH3 4'
5
6
+
2 CH
3 CH2
4 CH2
5 CH2
6 CH2
a CH
b CH2
2 CH, 4 CH, 6 CH
3 CH, 5 CH
2 CH2, 3 CH2
2 CH
3 CH
4 CH3
a CH
b CH2
2 CH, 6 CH
3 CH, 5 CH
a CH
b CH2
4 CH
5 CH
6 CH
7 CH
2 CH, 3 CH
2 CH
3 CH
4 4 CH, ′
CH
Tabelle 4.7: Identifizierte Komponenten im BHI-Medium.
4.1
1.8
nicht aufgelöst
1.6
2.9
3.9
3.2
7.2, nicht aufgelöst
7.3, nicht aufgelöst
2.3
3.5
4.2
1.2
3.9
3.1
7.2
6.8
3.9
3.4, 3.2
7.7
7.1
7.2
7.5
nicht aufgelöst
3.5
2.2
1.0

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 149
Abbildung 4.61: COSY-Diagramm des BHI-Kulturmediums, gemessen bei 9.4 T und 300 K. An der xund
y-Achse sind die 1D- 1 H-Spektren der gleichen Probe abgebildet. α-Glukose: 1 ( 1 CH- 2 CH), 2 ( 4 CH-
5 CH), 3 ( 3 CH- 4 CH); β-Glukose: 4 ( 1 CH- 2 CH), 5 ( 5 CH- 6 CH); Acetat: 25 ( 2 CH3); Alanin: 6 ( 2 CH- 3 CH3);
Arginin: 7 ( 2 CH- 3 CH2), 8 ( 4 CH2- 5 CH2); Aspartat: 9 ( 2 CH- 3 CH2); Ethanol: 10 ( 1 CH2- 2 CH3); Formiat:
23 ( 1 CH); Glutamat: 11 ( 2 CH- 3 CH2); Laktat: 12 ( 2 CH- 3 CH3); Lysin: 13 ( 2 CH- 3 CH2) , 14 ( 5 CH2- 6 CH2);
Phenylalanin: 15 ( α CH- β CH2); Succinat: 24 ( 2 CH2 und 3 CH2); Threonin: 16 ( 3 CH- 4 CH3), 17 ( 2 CH- 3 CH);
Tryptophan: 18 ( α CH- β CH2), 19 ( α CH- β CH2); Tyrosin: 20 ( α CH- β CH2); Valin: 21 ( 3 CH- 4 CH) und ( 3 CH-
4′ CH), 22 ( 2 CH- 3 CH).

150 4. Ergebnisse und Diskussion
4.4.4.3 Metabolite
Im zweiten Schritt wurden die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Wachstumskur-
ve (1.8 h, 3.1 h, 4.3 h, 5.5 h, 6.7 h, 8.1 h und 11.6 h nach Herstellung der Inokula) auf-
genommenen 1D-Protonenspektren miteinander verglichen und semiquantitativ aus-
gewertet, d. h. die Protonensignale wurden auf die gleiche y-Achse skaliert, jedoch
nicht auf einen internen Standard bezogen. Eine Analyse zeigte vor allem Konzentra-
tionsänderungen der fünf Hauptmetabolite für Anaerobier. Ihre Protonensignale sind
in Abhängigkeit des Kulturstadiums zusammen mit den gemessenen pH-Werten in
Abbildung 4.62 dargestellt. Lediglich Ethanol lag in zu geringer Konzentration und
teilweise durch andere Resonanzen überlagert vor, so dass eine übersichtliche Abbil-
dung nicht möglich war.
Abbildung 4.62: Wasserstoff-Resonanzlinien der vier Hauptmetaboliten zu unterschiedlichen Zeiten der
Wachstumskurve von S. vestibularis und der sich dazu entwickelnde pH-Wert im extrazellulären Medium.
Die Resonanzlinien von Formiat, Acetat und Laktat zeigen ab einer Inkubationszeit
von ca. 5 h einen starken Intensitätsanstieg. Die Succinat-Konzentration hingegen
steigt in den ersten Stunden des Zellwachstums kontinuierlich an, um dann nach ei-
ner Inkubationszeit von 5 h wieder abzufallen. Die Ursache liegt möglicherweise im

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 151
Umbau der Bernsteinsäure zur Propionsäure begründet. Die zunehmende Produkti-
on an Metaboliten während der Zellproliferation bewirkt aufgrund ihrer sauren Car-
boxylfunktionen (Ameisensäure: pks=3.7, Essigsäure: pks=4.7, Bernsteinsäure: pks=4.7
und 5.6, Milchsäure: pks=3.9) eine Konzentrationserhöhung an H + -Ionen im Medi-
um. Wird ihre Konzentration zu hoch, kommt es zum Überschreiten der Pufferka-
pazität des Phosphatpuffers in der BHI-Bouillon und folglich zu dem beobachteten
pH-Abfall während des Bakterienwachstums. Die zunehmende Protonenkonzentrati-
on wirkt sich auch auf die chemische Verschiebung der Resonanzsignale aus. Ihre Ur-
sache liegt in der Änderung der Protonierungs- zu Deprotonierungsverhältnisse und
in der damit verbundenen Änderung der Abschirmung der betrachteten Wasserstoff-
kerne. Besonders deutlich wird dieser Effekt für die CH3-Resonanz des Acetats (hier
ändert sich die chemische Verschiebung von 1.84 ppm auf 1.92 ppm).
4.4.4.4 Quantitative Beiträge zur T2-Änderung während der Zellproliferation
Die T2-Kurven von S. vestibularis in Abbildung 4.59 repräsentieren das Mittel aller
Änderungen in der Zellkultur, die während der Zellproliferation stattfinden. Anhand
von Referenz-Modellen werden nachfolgend die einzelnen Beiträge aus Nährstoffver-
zehr, Zellzunahme, Metabolitenkonzentration und pH-Abfall quantitativ analysiert
und diskutiert.
4.4.4.4.1 Nährstoffverbrauch im Medium
Im Medium dienen hauptsächlich Aminosäuren und Kohlenhydrate als C-und N-
Quellen für den Bakterienstoffwechsel (Abschnitt 3.2.1.2). Wie in Abschnitt 4.4.4.2 ge-
zeigt, konnten neben der α- und β-Glukose die meisten Aminosäuren im ppm-Bereich
zwischen 4 und 2.5 ppm, der charakteristisch für das CαH-Atom ist, gefunden werden.
Eine Quantifizierung dieses ppm-Bereiches stellt somit eine gute Näherung bezüglich
des Gehaltes aller austauschbaren funktionellen Gruppen (-NH, -NH2, -OH, -SH und
-COOH) in den verschiedenen Aminosäureresten dar. Ferner sind in diesem Bereich
die Kohlenhydrate enthalten, welche zusammen mit den Proteinen den wesentlichen
Anteil des gebundenen Wassers bestimmen und somit Einfluss auf die transversale
Relaxation nehmen können.
Zur Quantifizierung des maßgeblichen ppm-Bereiches wurden 1 H-Spektren der Strep-
tococcus-Suspension zum Zeitpunkt t=0 h nach Herstellung des Inokulums und nach
einer Inkubationszeit von 12 h aufgenommen (Abbildung 4.63). Die Inkubation fand
wie bei allen NMR-Experimenten bei 30 ◦ C in 5 mm-NMR-Röhrchen statt. Beiden Pro-
ben wurde Maleinsäure als interner Standard in einer Konzentration von 1 mg/ml
zugesetzt und die Fläche unter der Kurve des Maleinsäuresignals auf eins normiert.
Die quantitative Auswertung der NMR-Spektren ergab im ppm-Bereich zwischen 4.0

152 4. Ergebnisse und Diskussion
bis 2.5 aufgrund des Nährstoffverzehrs während der Zellproliferation eine Gehaltsab-
nahme von 18 % (Abbildung 4.64a).
Abbildung 4.63: 1 H-Spektren einer Zellsuspension von S. vestibularis zu den Zeitpunkten (a) t=0 h
und (b) t=12 h der Wachstumskurve. (M = Maleinsäure, interner Standard in einer Konzentration von
1 mg/ml; L = Laktat; S = Succinat; A = Acetat; F = Formiat; E = Ethanol). Zur Quantifizierung der
Spektren wurde das Maleinsäuresignal auf eins normiert.
Um ihre Auswirkung auf die transversale Relaxation abschätzen zu können, wurde
in Abbildung 4.64b das BHI-Medium bei 17.6 T und 30 ◦ C kalibriert, indem T2 mit
verschiedenen BHI-Konzentrationen korreliert wurde. Die höchste eingesetzte Kon-
zentration entsprach mit 0.185 g/5 ml, der zur Kultivierung eingesetzten Medium-
konzentration. In Abbildung 4.64b zeigen sich die beiden Parameter abgesehen vom
höchsten und niedrigsten Wert linear zueinander. Mit abnehmender Mediumkonzen-
tration steigt T2 an. Aufgrund des komplexen multifunktionalen Systems wurde eine
mathematische Beschreibung des Zusammenhanges nicht versucht und die Daten für
die Bestimmung der Auswirkung des Nährstoffverzehrs direkt aus dem Diagramm in
Abbildung 4.64b abgelesen. Unter der Annahme, dass die Abnahme der Aminosäure-
und Kohlenhydrat-Konzentration durch den Nährstoffverzehr während der Zellproli-

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 153
feration einer Verdünnung des Mediums um 18 % entspricht, verursacht die Konzen-
trationsabnahme somit einen T2-Anstieg von 15 ms.
(a)
T 2 [ms]
135
130
125
120
115
110
105
100
95
90
85
0.11 0.12 0.13 0.14 0.15 0.16 0.17 0.18 0.19
Concentration [g/5ml]
Abbildung 4.64: Auswirkung des Nährstoffverbrauches auf T2 während der Zellproliferation. (a) Ausschnitt
der Spektren aus Abbildung 4.63 zur anschaulichen Darstellung des Nährstoffverbrauches im
ppm-Bereich 4 bis 2.5. (b) T2-Relaxation in Abhängigkeit der BHI-Konzentration, gemessen bei 17.6 T
und 30 ◦ C.
4.4.4.4.2 pH-Einfluss durch Bakterienmetabolismus
Der pH-Wert einer Lösung hat vor allem bei Molekülen mit ionisierbarer und aus-
tauschbarer funktioneller Gruppe, und damit auch bei zahlreichen Aminosäuren, ei-
ne große Wirkung auf die transversale Relaxation. Verändert sich der pH, so ändert
sich das Verhältnis zwischen protoniertem und deprotoniertem Zustand und damit
die chemische Austauschrate. Theoretisch beschreibt die Luz-Meiboom-Gleichung für
ein Zwei-Spin-System mit schnellem chemischen Austausch die Relaxationsrate in
Abhängigkeit der 180 ◦ -Puls-Rate in der CPMG-Sequenz [163] (Abschnitt 3.5.2.2):
�
1
R2(τ) = R2(0) +
kb
(b)
�� � � � ��
2 kbτ �
1 − tanh Piδω
kbτ 2
2 i
(4.3)
mit τ, der zeitlichen Verzögerung zwischen dem 90 ◦ und dem 180 ◦ Puls, R2(0) der
transversalen Relaxationsrate in Abwesenheit von Austausch, kb der chemischen Aus-
tauschrate, Pi der Protonenfraktion in der chemischen Umgebung i und δωi, der Dif-
ferenz der chemischen Verschiebung zwischen den austauschenden Spin-Spezies in
Einheit der Frequenz. Pi kann hier direkt aus der Henderson-Hasselbalch-Gleichung
berechnet und damit der pH miteinbezogen werden. In Übereinstimmung mit theo-
retischen Berechnungen konnte die starke pH-Abhängigkeit der Austauschrate kb für

154 4. Ergebnisse und Diskussion
Abbildung 4.65: pH-Abhängigkeit
der T2 Relaxation des BHI
Mediums bei einer Konzentration
von 0.185 g/5ml, gemessen
bei 30 ◦ C und 17.6 T.
Die T2-Kurve beschreibt die chemische
Austauschrate eines N-
Spin-Systems. Die gemessenen
Daten wurden zu Anschauungszwecken
an ein Polynom vierter
Ordnung angepasst. Die Kurve
repräsentiert kein physikalisches
[ms]
2
T
110
100
90
80
70
5 5.5 6 6.5 7 7.5
Modell. pH
die Aminosäuren L-Glycin, L-Arginin und L-Tryptophan experimentell gezeigt wer-
den [146]. Die Luz-Meiboom-Gleichung gilt für einen weiten Bereich und ist auch
für die Beschreibung der T2-Änderungen während der Bakterienproliferation geeig-
net. Das BHI-Medium besteht jedoch, wie in Abschnitt 4.4.4.2 identifiziert, aus einem
Gemisch vieler freier und zu Peptiden verknüpfter Aminosäuren und seine Komple-
xität verhindert eine Vorhersage der pH-abhängigen Änderung der chemischen Aus-
tauschrate nach der Luz-Meiboom-Gleichung.
In einem Referenz-Modell (Abbildung 4.65) wurde die transversale Relaxation der
Protein-Wasser-Mischung (0.185 g BHI/5 ml) bei 30 ◦ C und 17.6 T für unterschiedliche
pH-Werte gemessen. Die pH-Werte wurden mit 1 molarer NaOH und HCl eingestellt,
so dass durch die Einstellung an sich kein Verdünnungseffekt auftrat. Der T2-Verlauf
zeigt ein breites Minimum bei einem pH von 6.25. Bei diesem pH-Wert ist die che-
mische Austauschrate kb maximal. Korrekterweise müsste der chemische Austausch
solch einer komplexen Mischung durch ein N-Spin-Modell beschrieben werden. Dies
ist praktisch jedoch nicht durchführbar. Aufgrund des gut definierten Minimums in
Abbildung 4.65 wurde angenommen, dass der chemische Austausch dieses Systems
näherungsweise mit einer durchschnittlichen Austauschrate ¯ kb für einen zweiseitigen
Austausch zweier repräsentativer Spin-Spezies beschrieben werden kann. Insgesamt
wurde im pH-Bereich zwischen 5.0 und 7.5 ein T2-Unterschied von 40 ms bewirkt.
4.4.4.4.3 Effekt der Zellzunahme
Der von einer Bakterienkultur experimentell ermittelte T2-Wert setzt sich aus intra-
und extrazellulären Beiträgen zusammen. Maßgeblich ist dabei das relative Volumen,
welches von beiden Komponenten besetzt wird. Berechnet man die Volumenfraktion
für Bakterien, die in einer Zellsuspension mit einem OD600-Wert < 1 eingenommen
wird, kommt man unter Annahme eines Bakterienradius von 0.5 µm auf einen Wert
von unter 10 −5 . Ein OD-Wert von 1 ist in diesem Beispiel repräsentativ für verschie-

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 155
dene Bakterienkulturen und wird häufig in der stationären Phase erreicht. Das Ergeb-
nis rechtfertigt somit in erster Näherung die Vernachlässigung des Einflusses zellbe-
dingter Änderungen der Bakterienkultur auf den beobachteten T2-Verlauf während
der Zellproliferation.
4.4.4.4.4 Metabolitenkonzentrationen
In Abschnitt 4.4.4.3 konnte bereits gezeigt werden, dass während der Zellproliferation
von S. vestibularis hauptsächlich die Metaboliten Acetat, Formiat, Succinat und Laktat
in das extrazelluläre Medium freigesetzt werden und damit seine Zusammensetzung
ändern. Zur Bestimmung der Zunahme der Metabolitenkonzentration wurden nun die
entsprechenden Protonensignale der Kultur-Spektren in Abbildung 4.63 zu den Zeit-
punkten t=0 und t=12 h integriert. Die Ergebnisse wurden relativ zur Maleinsäurere-
sonanz berechnet und sind in Tabelle 4.8 zusammengefasst. Innerhalb von 12 h zeigte
sich für Formiat eine Zunahme um den Faktor 4.3, für Acetat um 3.2 und für Laktat
um den Faktor 7. Laktat ist somit im Stoffwechsel der dominante Metabolit. Ethanol
lag zur quantitativen Auswertung in zu geringer Konzentration vor.
Pro Molekül Maleat werden zwei Protonen erfasst (Struktur − OOC-CH=CH-COO − ).
Bei einem Molekulargewicht von 116.1 g/mol und einer Konzentration von 1 mg/ml
ist eine Stoffmenge von 8.61 mmol in einem Liter Medium enthalten. Unter Einbe-
ziehung der Avogadro-Konstante (NA=6.022 x 10 23 Teilchen pro mol) beinhaltet die
Signalfläche 1.04 x 10 22 Wasserstoffkerne/l. Für die Metabolite errechnen sich daraus
die folgenden Endkonzentrationen:
• Formiat (Mr=46.03 g/mol, 1 H pro Molekül): 0.41 mg/ml
• Acetat (Mr=60.05 g/mol, 3 H pro Molekül): 0.83 mg/ml
• Succinat (Mr=118.1 g/mol, 4 H pro Molekül): 0.47 mg/ml
• Laktat (Mr=90.08 g/mol, 3 H pro Molekül): 0.93 mg/ml
Alle quantifizierbaren Metabolite liegen in einer Konzentration von weniger als 1 mg
pro ml vor. Berücksichtigt man, dass das Medium zu Beginn des Bakterienwachstums
in einer Konzentration von 0.037 g/ml eingesetzt wird, liegen die Metabolitenkonzen-
trationen um einen Faktor 50 bis 100 niedriger vor. Der Beitrag der Metaboliten zur
Änderung von T2 kann somit in guter Näherung vernachlässigt werden. Die mögliche
Unterschätzung der Metabolitenkonzentrationen aufgrund unvollständiger longitudi-
naler Relaxation bei der Messung wurde mittels Ernst-Gleichung abgeschätzt:
s(0) ∝
M0
�
1 − e
TR
− T1 �
sinα
TR
− T 1 − e 1 cosα
(4.4)

156 4. Ergebnisse und Diskussion
Unter der Annahme einer maximalen Relaxationszeit von 3 s und Einbeziehung des
bei der Messung verwendeten Relaxationsdelays von 2 s berechnet sich der Fehler im
Metabolitengehalt zu 22 %, womit die Nährstoffkonzentration immer noch mindestens
um einen Faktor 39 höher liegt.
Metabolit Gehalt* Gehalt*
(t = 0h) (t = 12h)
Formiat 0.12 0.52
Acetat 0.74 2.40
Succinat 1.37 0.92
Laktat
Dublett
0.25
0.24
Quartett
nicht detektierbar
Dublett
1.78
1.70
Quartett
Tabelle 4.8: Quantifizierung der Metaboliten zu den Zeitpunkten t=0 h und t=12 h der Wachstumskurve
von S. vestibularis. *Der Gehalt wurde durch Integration der Spektren in Abbildung 4.63 bestimmt und
ist als Fläche unter der Kurve relativ zum Maleinsäuresignal (interner Standard, 1 mg/ml) angegeben.
4.4.4.4.5 Maßgebende Einflussfaktoren
In den letzten Abschnitten konnte der Nährstoffverzehr und die Beeinflussung der
chemischen Austauschrate durch den pH-Wert als Hauptursachen für die beobach-
teten Änderungen der transversalen Relaxation während der Zellproliferation iden-
tifiziert werden. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden zu den gemessenen pH-
Werten in Abbildung 4.60 die entsprechenden T2-Werte aus Abbildung 4.65 abgele-
sen und zusammen mit der gemessenen T2-Kurve aus Abbildung 4.59 in einem Dia-
gramm aufgetragen (Abbildung 4.66). In den ersten 5 h bis zum Erreichen des globalen
T2-Minimums von 70 ms sind die aus der pH-Kalibrierung des Mediums errechnete
und gemessene T2-Kurve nahezu deckungsgleich. In dieser Zeitspanne erhöhte sich
die Metabolitenkonzentrationen von Formiat, Acetat, Succinat und Laktat nur schlei-
chend und bewirkten lediglich eine pH-Absenkung um ca. 0.5 Einheiten (Abbildung
4.62). Betrachtet man die Wachstumskurve in Abbildung 4.60, so ist in diesem Stadium
mit einem OD600 von 0.416 die Hälfte des maximalen Zellwachstums erreicht und die
Bakterienpopulation befindet sich mitten in der exponentiellen Phase. Durch die ex-
ponentielle Zellproliferation setzt ab einer Inkubationszeit von 5 h beschleunigte Me-
0.24
0.37
0.34
0.18

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 157
[ms]
2
T
130
120
110
100
90
80
70
60
gemessene T -Kurve
2
berechnet aus pH-T -BHI-Kurve
2
100 200 300 400 500 600 700
t [min]
Abbildung 4.66: Gegenüberstellung
der gemessenen und
den aus der pH-Kalibrierung
(Abbildung 4.65) berechneten
T2-Werten. Zu Anschauungszwecken
sind die einzelnen
Datenpunkte mit einer Spline-
Kurve interpoliert. Die Kurven
stellen kein physikalisches
Modell dar.
tabolitenproduktion von Formiat, Acetat und Laktat ein. Der pH-Wert fällt rapide auf
5.16 ab und die T2-Kurven in Abbildung 4.66 driften zunehmend auseinander. Der ma-
ximale T2-Unterschied wird in der stationären Phase bei 11.6 h erreicht und beträgt 20
ms. Dieses Ergebnis entspricht etwa der zu 15 ms berechneten Wirkung des Nährstoff-
verbrauchs durch die mikrobielle Stoffwechselaktivität. Zusammengefasst lässt sich
sagen, dass die erste Hälfte der T2-Wachstumskurve nahezu ausschließlich durch den
pH-Wert bestimmt wird, während sich in der zweiten Hälfte die Effekte aus pH-Ände-
rung und Nährstoffverbrauch überlagern.
4.4.5 T2 als Maß für die antibiotische Wirksamkeit
4.4.5.1 Auswahl des Testsystems
In “whole-cell-bioassays” (Abschnitt 1.2.2) erfolgt die Toxizitätsbestimmung einer
Testsubstanz üblicherweise über ihre Auswirkung auf die Zellproliferation und mit-
tels optischer Detektion. In der Regel wird die hemmende Wirkung der Testsubstanz
als minimale Hemmkonzentration (MIC, Abschnitt 1.2.3) angegeben. In den vorherge-
henden Abschnitten zeigte sich, dass mit der transversalen Relaxation ein geeigneter
NMR-Parameter gefunden war, wachstumsbedingte Änderungen einer Bakterienkul-
tur zu erfassen. Der Parameter liefert somit Informationen über das Stadium der Zell-
kultur und kann zur Unterscheidung einer wachsenden und statischen Kultur heran-
gezogen werden. Der Zytotoxizitätstest wurde am Teststamm S. vestibularis entwickelt.
Sein Metabolismus war gründlich untersucht und seine Vancomycin-Empfindlichkeit
sowohl fluorimetrisch als auch mittels Mikrodilutionsverfahren (Abschnitt 4.3) über-
prüft. Als Lösungsmittel konnte H2O verwendet werden, so dass auf eine Untersu-
chung der T2-Beeinflussung durch Lösungsmittel verzichtet werden konnte.

158 4. Ergebnisse und Diskussion
4.4.5.2 T2-Beeinflussung durch Vancomycin
Bevor die Wirkung des Vancomycin auf S. vestibularis über T2-Wachstumskurven un-
tersucht werden konnte, musste sicher gestellt werden, dass die gemessenen T2-Werte
von den eingesetzten Vancomycin-Konzentrationen an sich nicht beeinflusst werden.
Bei Vancomycin handelt es sich, wie bereits in Abschnitt 4.3.3 beschrieben, um ein Gly-
kopeptid mit zahlreichen ionisierbaren funktionellen Gruppen, wodurch eine Beein-
flussung der transversalen Relaxation mit abnehmendem pH-Wert und damit Ände-
rung der chemischen Austauschrate nicht auszuschließen war. Zur Überprüfung wur-
den T2-Werte von BHI-Medium mit Vancomycin-Konzentrationen im Bereich von 0.01
µM bis 100 µM bei unterschiedlichen pH-Werten und bei 30 ◦ C und 17.6 T bestimmt.
Die Verhältnisse zwischen diesen Relaxationszeiten und ihren entsprechenden Blind-
werten (T0 2 ) aus reinem Medium bei den verschiedenen pH-Werten sind in Abbildung
4.67 dargestellt. Sie zeigen abgesehen von kleinen Fehlern, die innerhalb der ex-
perimentellen Schwankungen durch Mittlung der T2-Werte über ca. 140 Pixeln la-
gen (siehe Experimenteller Teil Abschnitt 5.1.5.1.3), konstante Linien. Hierdurch ist
die Vancomycin-Unabhängigkeit der T2-Relaxation im betrachteten Konzentrations-
bereich bewiesen.
Abbildung 4.67: pH-Abhängigkeit
der T2-Werte des BHI-
Mediums mit unterschiedlichen
Vancomycin-Konzentrationen,
normiert auf die pH-abhängigen
T2-Werte von reinem
BHI-Medium. Gemessen wurden
die T2-Werte bei 30 ◦ C und
0.80
10
-2
17.6 T. Concentration [ µ M]
4.4.5.3 Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit
0
2
/T
2
T
1.30
1.25
1.20
1.15
1.10
1.05
1.00
0.95
0.90
0.85
-1
10 1 10
pH=4.98
pH=5.49
pH=5.98
pH=6.45
pH=7.13
Zur Bestimmung der antibiotischen Wirkung des Vancomycins auf S.vestibularis wurde
ein Probensatz von sieben 5 mm-NMR-Röhrchen präpariert. Ähnlich der Makrodilu-
tionsmethode (DIN 58940-5) wurden fünf dieser Röhrchen mit 2 ml Bakteriensuspen-
sion in einer Konzentration von 0.015 OD600 befüllt. Jedes dieser Inokula enthielt eine
1:10 Verdünnung von Vancomycin in einem Konzentrationsbereich von 0.01 µM bis
100 µM. Die sechste und siebte Probe bestand aus reinem Medium und einer unbehan-
delten Bakteriensuspension und diente als Negativ- bzw. Positivkontrolle. Von diesem
10
2

4.4 Transversale Relaxation als Indikator für Zellwachstum 159
Probensatz wurde die transversale Relaxation über einen Zeitraum von 12 h bei 30 ◦ C
und 17.6 T simultan gemessen.
T 2 [ms]
125
120
115
110
105
100
95
90
85
80
75
control
medium
0.01 µM
0.1 µM
1 µM
10 µM
100 µM
70
100 200 300 400
t [min]
500 600 700
Abbildung 4.68: T2-Wachstumskurven
von S. vestibularis unter
dem Einfluss unterschiedlicher
Vancomycin-Konzentrationen,
gemessen bei 30 ◦ C und 17.6 T.
Das Diagramm in Abbildung 4.68 zeigt die T2-Kurven der jeweiligen Proben. Bei den
Bakterienproben in Gegenwart von Vancomycin-Konzentrationen ≥ 1 µM wurde kei-
ne zeitliche Veränderung der transversalen Relaxation festgestellt und damit kein Zell-
wachstum beobachtet. Hingegen zeigten die Bakteriensuspensionen bei einem Vanco-
mycin-Gehalt unter ≤ 0.1 µM gegenüber der Positivkontrolle keinen Unterschied in
ihrer Wachstumscharakteristik. Zur genaueren Untersuchung des Konzentrationsbe-
reiches 0.1 µM bis 1 µM wurde das Experiment mit intermediären Zwischenstufen (1:8,
2:8 etc. Verdünnungsstufen) wiederholt. Auch hier zeigte die inhibitorische Wirkung
des Vancomycin ein typisches Schwellenverhalten ohne Zwischenzustände. Diese soll-
ten sich in einer unterschiedlichen Steigung und einer zeitlichen Verzögerung der T2-
Kurven bemerkbar machen. Gemittelt über drei Messwerte wurde der MIC-Wert zu
0.33 ± 0.08 µM bestimmt. Dies entspricht einer Standardabweichung von 24.2 %. Ver-
glichen mit den Ergebnissen aus der FMR- (ED50=2.4 ± 0.7 µM) LIF-CE- (ED50=0.24
± 0.07 µM) und der Mikrodilutionsmethode nach DIN 58940-8 [2] (MIC=0.7 µM) liegt
dieses Ergebnis im gleichen Größenbereich. Die Eignung von T2 als Marker für Zell-
wachstum im Rahmen eines “in-vitro-whole-cell-bioassays” und die Richtigkeit der
Methode sind damit zunächst bestätigt.
4.4.5.4 Potenzial-Praktikabilität-Ausblick
MRI als Methode zur Detektion mikrobiellen Wachstums eröffnet in High-
Throughput-Screening-Verfahren eine neue Perspektive. Miniaturisierung, Paralleli-
sierung und Automatisierung, die Schlüsselfaktoren für Methoden mit hohem Test-
durchsatz können in der MRI in hohem Maße erfüllt werden. In der Bildgebung ist

160 4. Ergebnisse und Diskussion
das Pixel die kleinste Informationseinheit. Berücksichtigt man, dass eine Mittelung
über 100 Pixel bereits einen aussagekräftigen Wert liefert, und MRI-Experimente mit
einer Matrixgröße von 1024 x 1024 oder 2048 x 512 in Ganzkörpertomographen kei-
ne Seltenheit sind, werden Messprotokolle mit 10.000 Proben möglich. Die Detektion
kann somit für viele Proben parallel erfolgen, ohne dass für jede Probe eine separa-
te Anregung und Detektion notwendig ist, wie es bei den optischen Methoden der
Fall ist. Verwendet man für den Testansatz die Mikrodilution in Mikrotiterplatten (Ab-
schnitt 1.2.3), so wäre der gesamte Ablauf des Testverfahrens voll automatisierbar und
ein Durchsatz von 40.000 Testsubstanzen pro Stunde wäre möglich. Bisher wurde die
Eignung der MRI-Detektion nur an einem kleinen Probensatz von 20 Stück bei hoher
Feldstärke (17.6 T) und anaeroben Mikroorganismen gezeigt. Zur Realisierung der De-
tektionsmethode in High-Throughput-Verfahren unter Verwendung von Ganzkörper-
tomographen mit Feldstärken von 1.5 und 3 T müssen somit die Parameter T2, OD600
und pH neu korreliert werden. Auch wäre noch zu klären, ob unter Sauerstoffbega-
sung eine Detektion der Zellproliferation auch für Aerobier möglich ist. Letztendlich
wird erst durch die Testung vieler Substanzen im Routinelabor die Eignung der Me-
thode beurteilt werden können.
4.4.6 Fazit: T2 als Marker für Zellwachstum
• Hauptursachen der wachstumsbedingten T2-Änderung sind der Nährstoffver-
zehr und die stoffwechselbedingte pH-Änderung im extrazellulären Medium.
• Der T2-Verlauf zur Beschreibung von Wachstumskurven erwies sich als bakteri-
enspezifisch. Charakteristische T2-Kurven ergaben sich in 5 mm-NMR-Röhrchen
nur für Anaerobier.
• Die MIC-Werte des Vancomycin für S. vestibularis zeigten im Dilutionsverfahren
sowohl bei MRI- als auch bei spektralphotometrischer Detektion vergleichbare
Ergebnisse.

Kapitel 5
Experimenteller Teil
5.1 Bakteriologische Untersuchungen
5.1.1 Kapillarelektrophorese (CE)
5.1.1.1 Messapparatur und Geräteparameter
Die elektrophoretische Charakterisierung der Bakterien-Spezies wurde an einem Beck-
man-Gerät P/ACE System MDQ (Fullerton, CA, USA) unter Verwendung eines UV-
Detektors bei 214 nm vorgenommen. Für die Aktivitätsbestimmungen verschiedener
Antibiotika diente ein Argon-Laser-induzierter-Fluoreszenz-(LIF)-Detektor (488 nm)
(Beckman, Krefeld, Deutschland), welcher im Zwei-Kanal-System mit einem 520 nm
Bandpass- und einem 655 nm Longpass-Filter (Beckman) betrieben wurde. Die elek-
trophoretische Trennung erfolgte unter Verwendung einer Quarzglaskapillare (Poly-
micro Technologies, Phoenix, AZ, USA) mit einer Gesamtlänge von 31.5 cm, einer De-
tektionslänge von 21.0 cm und einem Innendurchmesser von 100 µm bei einer konstant
angelegten Spannung von 10 kV bei 23 ◦ C. Die Proben wurden an der Anode der Ka-
pillare durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi für eine Dauer von 10 s injiziert.
5.1.1.2 Spülschritte
Konditionierung einer neuen Kapillare
0.1 M HCl : 10 min, 20 psi
0.1 M NaOH : 20 min, 20 psi
Tageskonditionierung
H2O : 10 min, 20 psi
0.1 M NaOH : 20 min, 20 psi
H2O : 10 min, 20 psi
161

162 5. Experimenteller Teil
Spülschritte zwischen jeder Trennung
0.33 M H3PO4 : 16 min, 20 psi
H2O : 1 min, 20 psi
0.1 M NaOH : 3 min, 20 psi
H2O : 1 min, 20 psi
CE-Trennpuffer : 2.5 min, 20 psi
Durch 0.33 molaren Phosphatpuffer wird die polymere Polyethylenoxid-Lösung, die
im Puffer zum mobilen Beschichten der Kapillare verwendet wird, vollständig von
der Kapillarwand gelöst. Das Einspülen von CE-Puffer vor jeder Trennung beschichtet
die Kapillare neu.
Spülschritte zur Lagerung der Kapillare
0.1 M NaOH : 2 min, 20 psi
5.1.1.3 Wasser
H2O : 10 min, 20 psi
H2O : 1 min, 5 psi
Wenn nicht anders beschrieben, wurde das mittels Millipore-Reinigungssystem (Milli-
Q, Eschborn, Deutschland) gereinigte Wasser benutzt.
5.1.1.4 CE-Trennpuffer (pH = 8.7)
Tris-Borat-Na2EDTA (TBE)-Puffer (pH = 8.3)
Es wurde eine Stammlösung von 0.445 M Tris-Borat und 10 mM Na2EDTA bei
einem pH von 8.3 hergestellt. Dazu wurde das Produkt No T7527 (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen, Deutschland) in 1 l Wasser gelöst. Der hochkonzentrierte TBE-Puffer war,
aufbewahrt bei 4 ◦ C, über mehrere Monate haltbar.
Polyethylenoxid (PEO)-Lösung 0.5 %
0.2 g Polyethylenoxid (Mr=600.000; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland)
werden in 40 ml Wasser dispergiert, woraus sich ein 0.5 %iger Polymergehalt ergibt.
Das heterogene Gel wurde zur kompletten Lösung über Nacht bei 30 ◦ C gelagert.
Diese Lösung wurde über einen Zeitraum von einer Woche verwendet.
Für die Herstellung von 10 ml Trennpuffer wurden 17.5 µl TBE-Puffer und 250

5.1 Bakteriologische Untersuchungen 163
µl 0.5 %ige PEO-Lösung auf 10 ml mit Wasser verdünnt. Es ergibt sich daraus eine
Konzentration von 0.78 mM Tris-Borat, 0.018 mM Na2EDTA und 0.0125 % PEO bei
einem pH von 8.7. Der Trennpuffer wurde unmittelbar vor jeder Trennung hergestellt
und mittels Ultraschallbad 2 Minuten entgast.
5.1.2 Fluoreszenzspektroskopie
Gerät: Cary Eclipse Fluorimeter mit Mikrotiterplatten-Lesegerät (Varian, Darmstadt,
Deutschland).
Messwellenlängen: Anregungswellenlänge bei 488 nm und duale Emission bei 520 nm
und 655 nm.
Verwendetes Messprogramm: “Scan” (Varian).
5.1.3 Mikroskopie
Geräte: Olympus CH-2, CK2 mit 10-, 20-, 40- und 100-facher Vergrößerung (Hamburg,
Deutschland).
5.1.4 Ultraschallbad
Gerät: SONOREX RK 156 (Bandelin, Mörfelden-Walldorf, Deutschland).
Leistung: 120 W.
Frequenz: 35 KHz.
5.1.5 Magnetische Kernresonanz (NMR)
5.1.5.1 Bildgebung
5.1.5.1.1 Messapparatur und Geräteparameter
Die kernspintomographischen Messungen zur Bestimmung der transversalen Relaxa-
tion (T2) wurden am Bruker Avance 17.6 Tesla Spektrometer (Bruker Biospin GmbH,
Rheinstetten, Deutschland) durchgeführt. Zur Schaltung der Bildgebungsgradienten
wurde in die vertikale Bohrung des Magneten mit einem Durchmesser von 89 mm
ein Micro-2.5-Gradientenrohr (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten) mit einem Innen-
durchmesser von 40 mm und einer maximalen Stärke von G=1000 mT/m pro Raum-
richtung eingebracht. In das Gradientenrohr wurde der Probenkopf montiert, auf dem
sich als Sende-/Empfangsspule ein 20 mm 1 H-Birdcage-Resonator (Bruker Biospin
GmbH, Rheinstetten) befand, in welchem der jeweilige Probensatz in 5 mm-NMR-
Röhrchen fixiert wurde. Das Gradientensystem wurde auf 30 ◦ C temperiert. Die An-

164 5. Experimenteller Teil
steuerung des Spektrometers erfolgte durch einen angeschlossenen Rechner mit den
Softwarepaketen Paravision 3.0.2 und xwin 3.5 (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten).
5.1.5.1.2 Sequenz und Parameter
Abbildung 5.1: Multi-Spinecho
Sequenz zur Messung von T2.
Die Transversalmagnetisierung
wurde mit einem schichtselektiven
90 ◦ sinc3-Puls erzeugt
und nach der Hälfte der Echozeit
τ mit einem schichtselektiven
180 ◦ sinc3-Puls zur Rephasierung
invertiert. Nach jeder
Pulsanregung wurden 64
Echos ausgelesen. Die Schichtdicke
betrug 2 mm, die Matrixgröße
64 x 64, das Gesichtsfeld
20 x 20 mm 2 , die Echozeit 10 ms
und die Repetitionszeit 5 s.
5.1.5.1.3 Auswertung
Die aufgenommenen Echos wurden mittels MATLAB (The MathWorks, Natick, MA,
USA) ausgewertet. Es wurden entsprechende T2-Karten berechnet indem die Intensität
jedes Pixels nach dem Prinzip der kleinsten Fehlerquadrate an eine Monoexponential-
funktion (I(n) = I0e
Abbildung 5.2: T2-Karte eines
Probensatzes von sieben
5 mm-NMR-Röhrchen mit
Zellsuspension.
n2τ
− T2 ) angepasst wurde.
Die Annahme einer Monoexponentialfunktion für Zweiphasensysteme (Zellsuspen-
sionen) ist eine Vereinfachung, die jedoch aufgrund des geringen Volumenanteils der
Zellen gerechtfertigt ist. Bei einer Zellsuspension von einem OD600-Wert< 1 ergibt
sich bei einem durchschnittlichen Bakterienradius von 0.5 µm eine Volumenfraktion
< 10 −5 . Aus diesem Grund können intrazelluläre Beiträge und eine direkte Beeinflus-

5.1 Bakteriologische Untersuchungen 165
sung durch die Zellen vernachlässigt werden. In der T2-Karte wurde für jedes 5 mm-
NMR-Röhrchen ein ROI (region of interest) mit durchschnittlich 140 Pixeln definiert
und T2 als Mittelwert in den ROIs bestimmt. In die gemessenen T2-Werte gehen unter
anderem Diffusionseffekte mit ein. Aufgrund konstanter experimenteller Parameter
während einer Messserie, wurde der Einfluss der Diffusion als konstant angenommen
und T2 als gemessenes T2 definiert.
5.1.5.2 Spektroskopie
Die NMR-Spektren der Bakteriensuspensionen wurden am 9.4 T Bruker-Avance-NMR-
Spektrometer (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, Deutschland) gemessen. Verwen-
det wurde dabei ein BBO(Broadband Observe)-Probenkopf mit Z-Gradientensystem.
Jede Bakterienprobe enthielt 10 % D2O zur Setzung des Locksignals.
5.1.5.2.1 1D-Spektroskopie
Die Messungen erfolgten unter Verwendung von Watergate-W5-Wasserunterdrück-
ungspulsen und wurden bei 300 K mit den folgenden Parametern durchgeführt: Punk-
te, 64 K; Anzahl der Mittlungen, 64; Spektrale Breite, 16 ppm; Akquisitionszeit, 5.1 s
und Relaxationsdelay, 2 s. Die Quantifizierung erfolgte durch Integration der Flächen
unter den Protonensignalen. Maleinsäure in einer Konzentration von 1 mg/ml diente
als interner Standard (δ=6.2 ppm), dessen Fläche unter der Kurve auf eins normiert
wurde.
5.1.5.2.2 2D-Spektroskopie
2D-Doppelquanten-gefilterte-COSY-Experimente wurden bei 300 K unter Verwen-
dung von 3-9-19 Wasserunterdrückungspulsen (Watergate) und mit den folgenden Pa-
rametern durchgeführt: Punkte, 2048 K; Anzahl der Mittlungen, 80; Spektrale Breite,
12.32 ppm; Akquisitionszeit, 0.208 s; Relaxationsdelay, 2 s; Inkremente von t1, 256.
5.1.6 Fluoreszenzmarker: SYTO9 und Propidiumiodid
Der “Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit” (L-7012) zur Markierung lebender
und toter Bakterienzellen wurde über Molecular Probes (MobiTec, Göttingen, Deutsch-
land) bezogen. Er besteht aus den beiden Fluoreszenzfarbstoffen SYTO9 und Propidi-
umiodid. SYTO9 liegt in 3.34 mM, Propidiumiodid in 20 mM Konzentration, gelöst in
DMSO, vor. Für die Verwendung in den Zytotoxizitätsbestimmungen wurden diese
Stammlösungen mit DMSO 1:10 bzw. 1:100 verdünnt. Die Anregungs-/Emissionsma-
xima für diese Farbstoffe liegen für SYTO9 bei 480/500 nm und bei 490/635 nm für
Propidiumiodid. Die zwei Nucleinsäure-bindenden Farbstoffe unterscheiden sich in

166 5. Experimenteller Teil
ihrer Fähigkeit in lebende Zellen einzudringen. SYTO9 färbt lebende Zellen mit intak-
ter Membran grün, während Propidiumiodid tote Zellen mit geschädigter Membran
rot färbt.
5.1.7 Proben
5.1.7.1 Antibiotika-Lösungen
Stammlösungen: 10 mM Stammlösungen verschiedener Referenz-Antibiotika wurden
in geeigneten, möglichst nicht-toxischen Lösungsmitteln und damit bevorzugt in Was-
ser hergestellt. Wässrige Lösungen wurden mit Membranfiltern der Porengröße von
0.2 µm steril filtriert. Zur Verminderung von Aktivitätsverlust durch Zersetzung der
Proben empfiehlt sich eine Lagerung bei -30 ◦ C.
Ciprofloxacin (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) : H2O
Vancomycin-HCl (Ratiopharm, Ulm, Deutschland) : H2O
Ampicillin-Na (Pfizer Pharma GmbH, Karlsruhe, Deutschland) : H2O
Ofloxacin (Hoechst, Frankfurt, Deutschland) : 0.1 M NaOH
Arbeitslösungen: Die Arbeitslösungen im Konzentrationsbereich 1 mM bis 1 µM er-
gaben sich aus den Stammlösungen durch serielle 1:10-Verdünnung mit den entspre-
chenden Lösungsmitteln. 200 µl jeder Verdünnung wurden unmittelbar vor der Te-
stung zubereitet.
5.1.7.2 Bakterien
5.1.7.2.1 Bakterien-Stämme
Die bakteriologischen Messungen mittels Kapillarelektrophorese, NMR und Fluores-
zenzspektroskopie wurden an den folgenden fünf Bakterien-Stämmen durchgeführt:
• Aerobier
Pseudomonas fluorescens (DSM-No 50090; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
Micrococcus luteus (DSM-No 20030; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
Neisseria cinerea (DSM-No 4630; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
• Anaerobier
Escherichia coli (Top 10, Institut für Biotechnologie, Universität Würzburg,
Deutschland)
• Fakultativer Anaerobier
Streptococcus vestibularis (DSM-No 5636; DSMZ*, Braunschweig, Deutschland)
*DSMZ=Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

5.1 Bakteriologische Untersuchungen 167
5.1.7.2.2 Kultur-Medien
Müller-Hinton-Agarplatten
Müller-Hinton-Agarplatten wurden von Oxoid (Wesel, Deutschland) mit der folgen-
den Zusammensetzung bezogen:
Getrockneter Rinderextrakt : 2 g/l
Caseinhydrolysat : 17.5 g/l
Stärke : 1.5 g/l
Brain-Hart-Infusion(BHI)-Bouillon
Das pulverisierte BHI-Medium wurde von Oxoid (Wesel, Deutschland) mit folgender
Zusammensetzung bezogen:
Getrockneter Rinder-Herz-Extrakt : 12.5 g/l
Getrockneter Kalbs-Hirn-Extrakt : 5.0 g/l
5.1.7.2.3 Kultivierung
Pepton : 10 g/l
Glukose : 2 g/l
Chloride : 5 g/l
Dinatrium-Phosphat : 2.5 g/l
Die Bakterien-Spezies wurden in gefriergetrocknetem Zustand von der DSMZ bezo-
gen. Suspendiert in BHI-Bouillon wurden sie zunächst auf Müller-Hinton-Agarplatten
ausgestrichen und bei 30 ◦ C angezüchtet. Die Agarkultur diente für den Zeitraum von
einer Woche als Bakterienreservoir. Vor der Analyse wurden Bakterien in 5 ml der
BHI-Bouillon überimpft und bei 30 ◦ C für 12 h inkubiert. Diese Bakteriensuspension
diente zur Vorbereitung der verschiedenen CE-, NMR- und fluoreszenzspektroskopi-
schen Proben.
5.1.7.2.4 Zellkonzentration
Die Zellkonzentration wurde UV/VIS-spektroskopisch durch Messung der optischen
Dichte (OD) bei 600 nm und anschließendem Zählen der koloniebildenden Einheiten
(CFU) bestimmt. Zur letzteren Bestimmung wurden Bakterienproben in der exponen-
tiellen Phase mit einem bestimmten OD-Wert serienmäßig 1:10 verdünnt und ein defi-
niertes Volumen (1 ml) wurde auf BHI-Agar ausplattiert. Die Zellkonzentration ergab
sich durch visuelles Auszählen der gebildeten Kolonien nach einer Inkubation von 24
h bei 37 ◦ C.

168 5. Experimenteller Teil
5.1.7.2.5 Zellpräparation und Stammsuspensionen zur kapillarelektrophoretischen und fluo-
reszenzspektroskopischen Analyse
20 µl einer 12h-Bakterienkultur wurden in 2 ml BHI-Bouillon suspendiert und in 15 ml-
Röhrchen bei 30 ◦ C für 24 h bis zum Erreichen der frühen stationären Phase inkubiert.
Die Bakteriensuspension wurde in einer Zentrifuge (EBA 12; Hettich, Kirchlengern,
Deutschland) bei 3400 rpm für 5 min pelletiert. Der Überstand wurde abdekantiert,
die Zellen mit 500 µl Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Nach zweimaligem
Waschen wurden die Zellen entweder in Wasser (fluorimetrische Bestimmungen) oder
in Trennpuffer (CE-Bestimmungen) resuspendiert. Aufgrund der Bakterienernte in der
frühen stationären Phase, stellen die Bakterien in diesem Zustand nahezu 100 % le-
bende Zellen dar. Für die Kalibrierung des zur Zellmarkierung erforderlichen Kon-
zentrationsverhältnisses von SYTO9 und Propidiumiodid waren Bakterienproben mit
unterschiedlichem Gehalt an lebenden und toten Zellen erforderlich. Zur Herstellung
einer Bakteriensuspension mit 100 %igem Tot-Anteil wurden gewaschene Zellen für
eine Stunde in 50 %igem Isopropanol suspendiert und nach einem Waschschritt ent-
weder in Wasser (fluorimetrische Bestimmung) oder Trennpuffer (CE-Bestimmung)
überführt. Die Stammbakteriensuspensionen lebender und toter Zellen wurden auf
eine OD600-Wert von 0.5 eingestellt und unmittelbar vor jeder Messung präpariert.
Diese Zellkonzentration wurde für CE-Messungen mit UV-Detektion bei 214 nm ver-
wendet. Fluoreszenz-Messungen am Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät oder an der
Kapillarelektrophorese wurden mit 1:10 (Fluorimeter) bzw. 1:100 (LIF-CE) verdünnten
Bakterienproben durchgeführt. Die Entwicklung eines Zytotoxizitätstests mittels LIF-
CE und Fluorimeter erforderte Arzneistoff-behandelte Bakterienproben. Dazu wurden
1980 µl einer sich in der exponentiellen Phase befindlichen Bakterienkultur in BHI-
Medium (OD600=0.3) in fünf 15 ml Zentrifugenröhrchen aliquotiert. Die Zugabe von 20
µl verschiedener Konzentrationen einer 10fachen Verdünnungsreihe der Antibiotika-
Stammlösungen mit den entsprechenden Lösungsmitteln führte zu einem Testbereich
von 0.01 µM bis 100 µM an Antibiotika-Konzentration unter Verwendung von 1 %
Lösungsmittel (vgl. Abschnitt 5.2.5). Zusammen mit einer Positivkontrolle (Inokulum
mit 1 % Lösungsmittel) wurden die Ansätze bei 30 ◦ C für 18 h inkubiert, d. h. so lan-
ge, bis unbeeinflusste Bakterienproben den stationären Zustand erreichten. Anschlie-
ßend wurden die Bakterienzellen geerntet, wie zuvor beschrieben, gewaschen, in Was-
ser bzw. in Trennpuffer in den entsprechenden Konzentrationen suspendiert, und für
Fluoreszenz-Messungen verwendet.
5.1.7.2.6 Zellpräparation und Stammsuspensionen für die NMR-Messungen
20 µl einer 12h-Kultur wurden in 2.0 ml BHI-Medium suspendiert und in 5 mm-NMR-
Röhrchen überführt. Das Inokulum zeigte einen OD600-Wert von 0.015. Zur Bestim-

5.1 Bakteriologische Untersuchungen 169
mung der T2-Wachstumskurven wurden diese Proben über einen Zeitraum von 24 h
gemessen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) erfolgte durch
Messung von T2-Wachstumskurven in Abhängigkeit unterschiedlicher Antibiotika-
Konzentrationen. Dazu wurden 1.980 µl Bakteriensuspension mit einem OD600-Wert
von ca. 0.015 in fünf 5 mm-NMR-Röhrchen aliquotiert und mit 20 µl einer Antibiotika-
Stammlösung bzw. -Arbeitslösung versetzt, so dass sich eine Testkonzentration zwi-
schen 100 µM und 0.01 µM unter Verwendung von 1 % Lösungsmittel ergab.
5.1.8 Zytotoxizität
5.1.8.1 Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR)
200 µl Arzneistoff-behandelter Bakterienproben (Abschnitt 5.1.7.2.5), die zuvor auf
einen OD600-Wert von 0.5 eingestellt und anschließend 1:10 verdünnt wurden (ca. 10 7
Zellen/ml), wurden in die Vertiefungen einer weißen Mikrotiterplatte gegeben. Die
Zellmarkierung erfolgte durch hinzufügen von je 1 µl 0.33 mM SYTO9 und 2 mM Pro-
pidiumiodid und anschließender Inkubation von 15 Minuten unter Lichtausschluss.
Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät bei einer An-
regungswellenlänge von 488 nm und Zwei-Kanal-Emission bei 520 nm (grün, lebend)
und 655 nm (rot, tot) ausgelesen. Durch Vergleich mit einer Standard-Lebendigkeits-
Kurve (beschreibt die Beziehung zwischen den Verhältnissen grün/roter Fluores-
zenzintensitäten und unterschiedlichen Verhältnissen lebender zu toter Zellen) konnte
das Verhältnis grün/rot für jede Konzentration einer getesteten Substanz mit dem pro-
zentualen Anteil lebender Zellen korreliert werden. Die Testung einer Substanz wurde
zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Aktivität der getesteten Substanzen er-
folgte durch Berechnung von ED50-Werten (Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolati-
on.
5.1.8.2 LIF-CE
200 µl einer Arzneistoff-behandelten Bakteriensuspension (Abschnitt 5.1.7.2.5) wurde
auf einen OD600-Wert von 0.5 eingestellt, anschließend 1:100 verdünnt (ca. 10 6 Zel-
len/ml) und mit jeweils 1 µl von 0.033 mM SYTO9- und 20 mM Propidiumiodid-
Lösung versetzt. Die Fluoreszenzmarkierung erfolgte für 15 Minuten unter Lichtaus-
schluss. Die markierten Bakterienproben wurden an der Anode der Kapillare injiziert
durch Anlegen eines Druckes von 0.5 psi für eine Dauer von 10 s. Um die Peaks
der niedrig konzentrierten Bakterienproben fokussieren zu können, folgte der Proben-
injektion eine zweite Injektion aus einer unmarkierten Bakteriensuspension höher-
er Konzentration (OD600=0.5; d. h. ca. 10 8 Zellen/ml), ebenfalls durch Anlegen eines
Druckes von 0.5 psi für 10 s. Die Elektropherogramme wurden mit einer Anregungs-

170 5. Experimenteller Teil
wellenlänge von 488 nm und dualer Emission bei 520 nm und 655 nm ausgelesen (siehe
Abschnitt 5.1.1.1). Die Auswertung der Elektropherogramme erfolgte durch Integrati-
on aller Signale im aufgezeichneten Zeitfenster und die Bestimmung der Zytotoxizität
in Anlehnung an Abschnitt 5.1.8.1.
5.1.8.3 Mikrodilutionsverfahren
Die Bestimmungen der minimalen Hemmkonzentration mittels Mikrodilutionsverfah-
ren fanden am Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität Würzburg
statt. Es konnte auf ein etabliertes Testsystem, welches gemäß den DIN 58940-8 Richt-
linien [2] unter leicht modifizierten Bedingungen durchgeführt wurde, zurückgegrif-
fen werden. Dazu wurden Kulturen aus der exponentiellen Phase mit Medium auf
eine Zelldichte von 2 x 10 7 Zellen/ml eingestellt. In Mikrotiterplatten erfolgte die In-
kubation von 100 µl dieser Zellsuspension unter Zusatz von 100 µl einer serienmäßi-
gen 2fach-Verdünnung einer antimikrobiellen Substanz in Kulturmedium, bei 37 ◦ C
für 24 h. Die Verdünnungsreihe lag im Bereich 1 µg bis 32 µg. S. vestibularis wurde
in Todd-Hewitt-Bouillon (Oxoid, Basingstoke, England) mit 0.5 % Hefeextrakt und P.
fluorescens in konventioneller Müller-Hinton-Bouillon kultiviert. Der Test wurde mit
einem Mikrotiterplatten-Lesegerät bei 550 nm ausgewertet und das Ergebnis als MIC-
Wert angegeben, d. h. der niedrigsten Konzentration, bei welcher nach einer Inkubati-
onszeit von 24 h das Zellwachstum immer noch inhibiert war.
5.2 Zytotoxizitätstest an Blutstromformen von Trypano-
soma brucei brucei
Die Etablierung des Testsystems auf Trypanosoma brucei brucei (T. b. b.) erfolgte im
Armauer-Hansen-Institut der Missionsärztlichen Klinik. Alle Arbeitsschritte wurden
unter der Sterilbank (Hera soft, Heraeus Instruments, Osterode, Deutschland) durch-
geführt.
5.2.1 Medium
5.2.1.1 Baltz-Medium-Basis-Lösung
Die zur Zellkultivierung eingesetzte MEM-Basis-Lösung (+ Earle‘s-Reagenz, -L-Glu-
tamin, 500 ml Flasche, Gibco, Karlsruhe, Deutschland) enthielt zur besseren visuel-
len Überprüfung einer intakten Zellkultur und Zelldichte Phenolrot als pH-Indikator-
Zusatz. Bei zu hoher Zelldichte kommt es durch Übersäuerung des Mediums, her-
vorgerufen durch eine zu hohe Konzentration verschiedener Stoffwechselprodukte

5.2 Zytotoxizitätstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei 171
zum Absterben der Zellen. Der Zytotoxizitätstest wurde hingegen in Abwesenheit von
Phenolrot durchgeführt aufgrund der spektralphotometrischen Auswertung des Toxi-
zitätseffektes. Zur Herstellung der Baltz-Medium-Basis-Lösungen wurden die nach-
folgenden Substanzen in 50 ml MEM-Medium (ohne Phenolrot bzw. mit Phenolrot)
gelöst, der pH auf 7.5 eingestellt, anschließend der Ansatz steril filtriert und mit MEM-
Medium unter Zusatz von 5 ml nicht-essenzieller Aminosäuren (NEAA, 100x, Gibco,
Karlsruhe, Deutschland) auf 500 ml ergänzt.
HEPES : 3 g
Glukose-Monohydrat : 500 mg
Na-Pyruvat : 110 mg
Hypoxanthin : 7 mg
Thymidin : 2 mg
Adenosin : 10.7 mg
Bathocuproninsulfonat : 14.1 mg
L-Gluthamin : 146 mg
Alle Substanzen wurden von Roth, Karlsruhe, Deutschland bezogen. Die Baltz-
Medium-Basis-Lösungen waren gelagert bei 5 ◦ C über mehrere Wochen stabil.
5.2.1.2 Baltz-Medium zur Kultivierung
Das Baltz-Medium zur Kultivierung wurde nach folgender Vorschrift hergestellt:
Baltz-Medium-Basis-Lösung : 40 ml
β-Mercapto-Stammlösung : 0.4 ml
Penicillin/Streptomycin* : 0.4 ml
Inaktiviertes fötales Rinderserum : 8 ml
Es sollte bei 5 ◦ C aufbewahrt nicht länger als zwei Wochen verwendet werden.
Inaktiviertes fötales Rinderserum:
Das Rinderserum (Biochrom, Berlin, Deutschland) war in 500 ml Flaschen erhältlich.
Es wurde steril filtriert in zehn 50 ml Plastikröhrchen aliquotiert und bei -30 ◦ C
aufbewahrt. Vor Gebrauch erfolgte nach Auftauen eines 50 ml Aliquotes bei 37 ◦ C
Inaktivierung des Rinderserums im Wasserbad bei 56 ◦ C für 30 Minuten.
β-Mercaptoethanol-Stammlösung:
β-Mercaptoethanol 50 mM* : 4 ml
H2O, bidestilliert, Ampuwa : 6 ml
*Substanzen wurden von Biochrom, Berlin, Deutschland bezogen.

172 5. Experimenteller Teil
5.2.2 Parasitenkultur
5.2.2.1 Kultivierung
Trypomastigote Formen von Trypanosoma brucei brucei des Laborstammes TC 221 wur-
den in 5 ml Baltz-Medium in 25 cm 3 Kulturflaschen mit luftdurchlässigem Schraubver-
schluss (Biochrom, Berlin, Deutschland) bei 37 ◦ C und 5 % CO2 kultiviert. Die während
des Wachstums der Parasitenkultur vermehrte Stoffwechselproduktion führt zum Ab-
sterben der Zellen, so dass die Kultur im Abstand von 2 Tagen mit ca. 0.1 ml Zellkultur
in neues Medium überimpft werden musste. Eine Erneuerung der Kultur erfolgte im
Abstand von 6 Monaten durch Auftauen und Anzüchten neuer Stabilate (Abschnitt
5.2.2.2). Dabei sollte darauf geachtet werden, dass die Zellkultur gründlich mit Medi-
um (d. h. mindestens dreimal) gewaschen und restliches Glycerin aufgrund seiner to-
xischen Wirkung entfernt wird. Das Abdekantieren erfolgte durch Zentrifugation bei
3000 rpm für 10 Minuten (Potanta TRC, Hettich, Kirchlengern, Deutschland).
5.2.2.2 Stabilate
Zur Herstellung der Stabilate wurde eine in der exponentiellen Phase befindliche Try-
panosomenkultur durch Zentrifugation (Potanta TRC, Hettich, Kirchlengern, Deutsch-
land) bei 3000 rpm für 10 min pelletiert. Auf Eis gekühlt wurde das Pellet in 90 %
Baltz-Medium und 10 % Glycerol aufgenommen, so dass sich eine Zellkonzentration
von 10 6 Trypanosomen/ml ergab. Diese Zellsuspension, Stabilat genannt, ist bei -80 ◦ C
über mehrere Monate stabil. Ein Zellansatz wurde in 10 Eppendorf-Caps aliqotiert.
5.2.2.3 Zellkonzentration
Die Bestimmung der Zytotoxizität an Trypanosomen erforderte eine Zellsuspension
von 10 5 Zellen/ml. Die Zelldichte und die notwendige Verdünnung der aktuellen Try-
panosomenkultur wurde durch Auszählung mittels Zählkammer nach Neubauer [23]
bestimmt. Dazu wurde die Zählkammer mit einem geschliffenen Deckglas präpariert
und mit einer 100 µl Eppendorfpipette vorsichtig mit Zellkultur gefüllt. Ausgezählt
wurde das rote Quadrat in der Mitte der Abbildung 5.3. Eine Zellzahl von zehn ent-
sprach einer Trypanosomenkonzentration von 10 5 Zellen/ml.

5.2 Zytotoxizitätstest an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei 173
5.2.3 Referenz- und Testsubstanzen
5.2.3.1 Stammlösungen
Abbildung 5.3: Zählkammer
nach Neubauer 4, modifiziert
nach [284]. Die Kammertiefe beträgt
0.100 mm. Die Netzteilung
dieser Kammer weist 3 mal 3
große Quadrate von je 1 mm 2
Fläche auf. Für die Trypanosomenzählung
wurde nur das
große, rot markierte Quadrat in
der Mitte verwendet.
Die Referenz- und Testsubstanzen wurden entweder in Wasser, DMSO oder Ethanol
gelöst. Die Konzentration der Stammlösungen betrug dabei 10 mM. Wässrige Lösun-
gen wurden mit Membranfiltern der Porengröße von 0.2 µm steril filtriert. Zur Ver-
minderung des Aktivitätsverlustes durch Zersetzung der Proben empfiehlt sich eine
Lagerung bei -30 ◦ C. Die folgenden Substanzen wurden als Referenz-Substanzen zur
Etablierung des Testsystems eingesetzt.
Suramin-Na (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) : H2O
Pentamidin-diisethionat (Aventis, Bad Soden, Deutschland) : H2O
5.2.3.2 Arbeitslösungen
Melarsoprol (Aventis) : DMSO
Eflornithin-HCl (Aventis) : H2O
Nifurtimox (Bayer AG) : DMSO
Die Arbeitslösungen im Konzentrationsbereich 1 mM bis 100 pM (Arbeitslösungen 1-
8) ergaben sich aus den Stammlösungen durch serielle 1:10-Verdünnung mit Baltz-
Medium. Aufgrund der nachgewiesenen Toxizität einiger Lösungsmittel war darauf

174 5. Experimenteller Teil
zu achten, dass jede Verdünnung den gleichen Anteil Lösungsmittel enthielt. Dazu
wurde die erste Verdünnungsstufe mit reinem Medium, alle weiteren mit Medium
unter Zusatz von 10 % Lösungsmittel hergestellt. Unmittelbar vor der Testung wurden
200 µl jeder Verdünnung zubereitet.
5.2.4 AlamarBlue
AlamarBlue wurde als Resazurin-Natriumsalz von Sigma-Aldrich, Taufkirchen,
Deutschland bezogen. Es handelt sich dabei um die reduzierte Form des REDOX-
Indikators AlamarBlue. Für die Anwendung im Zytotoxizitätstest wurden 11 mg
Resazurin-Na in 100 ml 0.9 % NaCl gelöst. Bei 4 ◦ C aufbewahrt, war die Lösung über
mehrere Wochen stabil.
5.2.5 Durchführung des Zytotoxizitätstests
1 2 3 4-11
Blind- neg. pos. Testsubstanz
wert Kontrolle Kontrolle 100 µM - 10 pM
A M: 180 M: 180 M: 160 M: 160
ML: 20 A1: 20 ML: 20 A1: 20 - A8: 20
T: 20 T: 20
B M: 180 M: 180 M: 160 M: 160
ML: 20 A1: 20 ML: 20 A1: 20 - A8: 20
T: 20 T: 20
C M: 180 M: 180 M: 160 M: 160
ML: 20 B1: 20 ML: 20 B1: 20 - B8: 20
T: 20 T: 20
D M: 180 M: 180 M: 160 M: 160
ML: 20 B1: 20 ML: 20 B1: 20 - B8: 20
E . . .
T: 20 T: 20
. . . Substanz C
. . .
Tabelle 5.1: Pipettierschema des Zytotoxizitätstests an Blutstromformen von Trypanosoma brucei brucei.
M=Medium; ML=Medium mit 10 % Lösungsmittelanteil; T=Trypanosomensuspension (10 5 Zellen/ml);
A/B1-A/B8=Arbeitslösungen der Testsubstanzen A-B. Die Zahlen in der Tabelle sind in µl angegeben.
In 96-Mikrotiterplatten wurden 20 µl der Arbeitslösungen 1-8 in 160 µl vorge-
legtes Baltz-Medium pipettiert und anschließend 20 µl einer Trypanosomensus-

5.3 Berechnung von ED50-Werten 175
pension der Konzentration 10 5 Zellen/ml hinzugefügt (Tabelle 5.1). Der Testbe-
reich lag damit zwischen 100 µM und 10 pM mit einem Lösungsmittelanteil von
1 %. Positiv(Trypanosomen in Baltz Medium mit 1 % Lösungsmittel)- und Nega-
tiv(Testsubstanz in Medium ohne Trypanosomen zur Erfassung der Eigenabsorpti-
on)kontrollen wurden bei jedem Test zusätzlich inokuliert. Die Platten wurden an-
schließend bei 37 ◦ C in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für 24 h inkubiert. Nach Zuga-
be von 20 µl steril filtriertem AlamarBlue in jede Vertiefung erfolgte erneute Inkuba-
tion. Nach einer Gesamtinkubationszeit von 48 h wurden die Platten durch Messung
der Lichtabsorption an einem MR 700 Mikrotiterplatten-Lesegerät (Dynatech, Rückers-
dorf, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 550 nm und einer Referenzwellenlänge
von 630 nm ausgelesen. Die Testung einer Substanz erfolgte als Doppelbestimmung
(siehe Pipettierschema) und wurde zweimal wiederholt. Die Quantifizierung der Ak-
tivität der getesteten Substanzen erfolgte durch Berechnung von ED50-Werten (siehe
Abschnitt 5.3) mittels linearer Interpolation.
5.3 Berechnung von ED50-Werten
Die Auswertung des AlamarBlue-Testes auf Trypanosomen sowie der antibakteriel-
len Testung auf der Basis der SYTO9- und Propidiumiodid-Markierung erfolgte über
die Bestimmung der ED50-Werte mittels linearer Interpolation. Der ED50-Wert definiert
diejenige Konzentration, bei der 50 % der maximalen Inhibition bzw. Toxizität ein-
tritt. Zu seiner Bestimmung war es zunächst notwendig bei jeder getesteten Konzen-
tration einer bestimmten Substanz die beobachtete Zelldichte bzw. den prozentualen
Anteil lebender Zellen in Bezug auf die eingesetzten Positivkontrollen und Standard-
Lebendigkeits-Kurven zu berechnen. Nach folgender Gleichung konnte daraus der
entsprechende ED50-Wert ermittelt werden.
mit
log(ED50) = log(x1) + y1 − 0.5
(log(x2) − log(x1)) (5.1)
y1 − y2
y1: Bezüglich der getesteten absteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz,
der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der oberhalb 0.5 liegt.
x1: Die zum Wert y1 gehörige Konzentration der Substanz.
y2: Bezüglich der getesteten aufsteigenden Konzentrationsreihe einer Testsubstanz,
der erste berechnete prozentuale Anteil/100, der unterhalb 0.5 liegt.
x2: Die zum Wert y2 gehörige Konzentration der Substanz.

176 6. Zusammenfassung
Kapitel 6
Zusammenfassung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden potenzielle Wirksubstanzen zur Behandlung trypa-
nosomaler und bakterieller Infektionen gesucht. Während auf dem Gebiet der Trypa-
nosomiasis das Ziel in der Testung großer Substanzbibliotheken auf antitrypanosoma-
le Wirkung und in der Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen bestand, lag im
Bereich der bakteriellen Infektion der Schwerpunkt in der Entwicklung neuer Testme-
thoden.
Zu diesem Zweck wurde im ersten Teil der Arbeit mit dem AlamarBlue-Bioassay ein
In-vitro-High-Throughput-Screening-Verfahren zur antitrypanosomalen Aktivitätsbe-
stimmung verschiedener Substanzklassen etabliert (Abschnitt 4.1). In der Gruppe der
Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQs) mit C,C-verknüpfter Biaryl-Achse (Abschnitt
4.1.4.1.1) zeigten Dioncophyllin A (ED50=3.4±1.7 µM), B (ED50=2.6±0.4 µM) und C
(ED50=4.2±2.3 µM) sowie das dimere Ancistrogriffithin A (ED50=0.85±0.05 µM) die
stärkste Aktivität gegen Trypanosoma brucei brucei und lagen damit im Wirkbereich
des Nifurtimox (ED50=3.4±0.4 µM). Wie am Beispiel des unwirksamen dimeren Mi-
chellamin B mit sechs freien Hydroxy-Gruppen gezeigt werden konnte, war für ei-
ne gute antitrypanosomale Wirksamkeit die begrenzte Anzahl phenolischer Gruppen
auf eine oder zwei maßgeblich. Untersuchungen am Isochinolin-Gerüst ergaben, dass
unter diesen Bedingungen auch vereinfachte Analoga ohne Naphthalin-Einheit aktiv
sind. Mit Ancistrocladinium B, ein NIQ mit N,C-verknüpfter Hetero-Biaryl-Achse (Ab-
schnitt 4.1.4.1.2) konnte ein neuer in der antitrypanosomalen Aktivität wirksamerer
Alkaloidtypus gefunden werden (ED50= 0.35±0.02 µM). In dieser Gruppe zeigte sich
von phenyl- zu anthracensubstituierten Isochinolinen eine größere Wirksamkeit, die
sich durch zunehmende Lipophilie erklären ließ. Der Einfluss der Hydroxy-Gruppe
auf die antitrypanosomale Wirkung konnte auch am Beispiel der Fluorchinolone (Ab-
schnitt 4.1.4.2) nachgewiesen werden. Für wirksame Substanzen war somit auch das
Lipinski Kriterium [161] für “drug-like”-Substanzen erfüllt.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zum konventionell angewandten Mikrodilu-
tionsverfahren nach DIN 58940-8 [2], alternative und ergänzende Methoden zur Be-

stimmung der antimikrobiellen Aktivität potenzieller Wirksubstanzen entwickelt. Da-
zu wurde auf dem Gebiet der Kapillarelektrophorese (CE) (Abschnitt 4.2) und der
magnetischen Kernresonanz (NMR) (Abschnitt 4.4) nach Methoden zur Beschreibung
von Bakterienkulturen gesucht und diese Zytotoxizitätsbestimmungen zugänglich ge-
macht.
Nach Entwicklung geeigneter CE-Bedingungen und Optimierung der Bakterienkul-
turen und deren Probenpräparation konnte für Pseudomonas fluorescens und Strepto-
coccus vestibularis eine kapillarelektrophoretische UV-Methode mit guter Präzision, Se-
lektivität, Spezifizität und Linearität etabliert werden. Sie erlaubte die Trennung ver-
schieden großer Agglomerate und Ketten und die Erstellung charakteristischer Fin-
gerabdrücke. Die Zellmarkierung mit SYTO9 und Propidiumiodid, den beiden Fluo-
reszenzmarkern im “LIVE/DEAD BacLight viability kit”, ermöglichte mittels LIF-CE
die Konstitution der Bakterienkulturen zu untersuchen. Die beiden Nucleinsäure-
bindenden Fluoreszenzfarbstoffe unterscheiden sich in ihrer Eigenschaft in gesun-
de Zellen einzudringen, wodurch eine Differenzierung zwischen lebenden und to-
ten Zellen möglich wird: SYTO9 färbt alle Zellen grün, Propidiumiodid färbt alle
Zellen mit beschädigter Membran rot. Die Aufzeichnung mikrobieller Elektrophero-
gramme im Zwei-Kanal-Modus mittels LIF-Detektion ermöglichte das Verhältnis le-
bender zu toter Zellen mit charakteristischen elektrophoretischen Profilen zu korre-
lieren. Mit dieser neuen LIF-CE Methode, die erst durch Nachinjektion unmarkier-
ter Bakterienzellen als “stacking front” möglich wurde, konnte die Tendenz der mi-
krobiellen Kettenbildung und die Änderung des lebend/tot-Verhältnisses der Bakte-
rienkultur in Gegenwart unterschiedlicher Antibiotikakonzentrationen direkt beob-
achtet werden. Mit Hilfe der Korrelation des grün/rot-Fluoreszenzverhältnisses mit
dem prozentualen Anteil lebender Zellen wurden für Arzneistoff-exponierte Bak-
terienkulturen Dosis-Wirkungs-Diagramme erstellt und die entsprechenden ED50-
Werte berechnet. Zur Kontrolle der Ergebnisse wurden die ED50-Messung auch am
Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät (FMR) durchgeführt und ebenso die entspre-
chenden MHK-Werte mittels konventionellem Mikrodilutionsverfahren nach DIN be-
stimmt. Ciprofloxacin, Ampicillin-Na und Vancomycin-HCl zeigten für die fluorime-
trischen Methoden als auch für das Mikrodilutionsverfahren vergleichbare Ergebnisse.
Die fluorimetrischen Verfahren ermöglichten eine schnelle Differenzierung zwischen
zytostatischer und zytotoxischer Wirksamkeit, was mittels Mikrodilutionsverfahren
nicht möglich ist.
Mittels NMR konnte bei 17.6 Tesla im Bildgebungsexperiment gezeigt werden, dass
sich die transversale Relaxation T2 gut zur Beschreibung der Bakterienproliferation
verschiedener Anaerobier eignet. Der Parameter T2, welcher durch den chemischen
Austausch beeinflusst wird, erfasst dabei das Mittel aller wachstumsbedingten Ände-
rung in der Zellkultur. Durch Nährstoffverzehr, Metabolitenproduktion und steigen-
177

178 6. Zusammenfassung
der Zelldichte ändern sich sowohl Zusammensetzung und Konzentration des Medi-
ums als auch der pH-Wert, die Ionenstärke und die Viskosität. Zur Aufklärung der ein-
zelnen Beiträge und des Zusammenhangs zwischen Zellproliferation und T2 wurden
am Beispiel der Bakterien-Spezies Streptococcus vestibularis 1 H-NMR-Spektren von Bak-
terienkulturen unterschiedlicher Wachstumsstadien mit den extrazellulären Parame-
tern T2, OD600 und pH korreliert. Dabei konnten Nährstoffverzehr und pH-Wert-Ände-
rung durch Metabolitenproduktion als Hauptursachen für die T2-Parameterisierung
der Zellproliferation identifiziert werden. Die Bildgebung erlaubte die Aufzeich-
nung des zeitlichen T2-Verlaufes mehrerer Bakterienproben simultan. Aus den T2-
Wachstumskurven der Streptococcus-Spezies ließ sich in Gegenwart unterschiedlicher
Vancomycin-Konzentrationen der MHK-Wert des Antibiotikums zu 0.33±0.08 µM be-
stimmen. Er stand in gutem Einklang mit dem Ergebnis aus dem konventionellen Mi-
krodilutionsverfahren nach DIN (MHK=0.7 µM), der LIF-CE- (ED50= 0.24±=0.07 µM)-
und der FMR- (ED50=2.4±0.7 µM) Methode.

Kapitel 7
Summary
The purpose of this investigation was the search for new potential drugs for treat-
ment of trypanosomal and bacterial infections. According to trypanosomiasis, this stu-
dy aimed at screening large compound libraries for their antitrypanosomal activity
and analyzing structure activity relationships. In the field of bacterial infections the
development of new screening methods was of main interest.
In the first part of this thesis (Section 4.1) the AlamarBlue assay was established.
The assay showed great potential for the determination of drug sensitivities of Afri-
can trypanosomes in vitro and was suitable for high-throughput-screening of different
compound classes. At first the series of naphthylisoquinolin alkaloids (NIQs) having
a C,C-biaryl-axis (Section 4.1.4.1.1) were tested against Trypanosoma brucei brucei. The
most active compounds of this NIQ-class were Dioncophyllin A (ED50=3.4±1.7 µM),
B (ED50=2.6±0.4 µM), and C (ED50=4.2±2.3 µM), and the dimeric Ancistrogriffithin A
(ED50=0.85±0.05 µM). Their ED50 values were in the same range of inhibition concen-
tration as Nifurtimox (ED50=3.4±0.4 µM). Michellamin B which consists of two iden-
tical naphthylisoquinoline portions including six free hydroxy functions was inactive.
Thus, for good antitrypanosomal potency, the number of phenolic hydroxy functions
has to be limited to one or two. Under these circumstances even some naphthalene-free
tetrahydroisoquinolines were active to some extent. Ancistrocladinium B, a represen-
tative of the novel-type N,C coupled NIQ alkaloid with hetero-biaryl-axis exhibited si-
gnificantly higher antitrypanosomal activities (ED50= 0.35±0.02 µM) (Section 4.1.4.1.2).
Investigations of this novel-type alkaloid showed an increase in efficiency when going
from phenyl to anthracen substituted isoquinolines which is probably evoked by the
increase in the lipophilic character of the compounds. The influence of the hydroxy-
group on the potency was also verified for fluoroquinolones by structure-activity rela-
tionship (Section 4.1.4.2). Thus, for potent compounds the Lipinski’s criterion [161] for
drug-like compounds was met as well.
Further aim of this thesis was to find alternative and adjunct methods to the broth
microdilution test according to DIN 58940-8 [2], which is conventionally used for the
179

180 7. Summary
determination of the antibacterial activity of potential drugs. Therefore novel methods
were developed based on capillary electrophoresis (CE) (Section 4.2) and nuclear ma-
gnetic resonance (NMR) (Section 4.4), which were suitable for the description of cell
cultures and could be employed for activity screening.
Having developed suitable CE-conditions, and optimized bacterial cultures and sam-
ple preparation a reliable CE-method was established for the bacterial strains Strep-
tococcus vestibularis and Pseudomonas fluorescens. The method was performed by UV
detection and showed good precision, selectivity, specificity, and linearity. It allowed
for separation of microbial agglomerates and chains of different size, and was used to
create characteristic fingerprints.
Staining bacteria by using the LIVE/DEAD BacLight viability kit the constitution of a
bacterial population could be examined by means of LIF-CE. The kit consists of the two
fluorescent nucleic acid stains SYTO9 and propidium iodide, which differ in their abili-
ty to penetrate healthy cells making a distinction between live and dead cells possible:
SYTO9 stains all cells green, propidium iodide stains cells with damaged membrane
red. Monitoring electropherograms of bacterial samples by dual LIF detection, the ratio
of live to dead cells was correlated with the electrophoretic profile. Therefore, the new
LIF-CE method, based on the use of a second unlabeled bacteria injection as a stacking
front, allowed for the direct observation of the tendency of chain formation and al-
terations in the live/dead ratio of the bacterial composition in presence of different
antibiotics. By correlation of the ratio of green and red fluorescence with the percenta-
ge of live cells dose response curves of drug-treated bacterial samples were calculated,
which allowed for the assessment of ED50 values. To verify the results the determinati-
on of the antibacterial activity was repeated by fluorescence microplate reader (FMR)
measurements and broth microdilution method. For ciprofloxacin, ampicillin-Na, and
vancomycin-HCl similar results were obtained for each of the three methods. The fluo-
rometric methods allowed for a rapid differentiation between cytostatic and cytotoxic
efficiency, which was previously not possible with broth microdilution.
Using NMR experiments, it was shown by magnetic resonance imaging (MRI) at 17.6 T
that the transverse relaxation T2 is suitable for the description of anaerobical, bacterial
proliferation. The parameter T2, which is influenced by chemical exchange, is sensitive
to all variations of the bacterial culture. Consumption of the medium, metabolism, and
varying cell density change the composition and the concentration of medium as well
as pH, ionic strength and viscosity. To establish the dependence of T2 on cell prolife-
ration 1 H NMR spectra of Streptococcus vestibularis samples of different growth stages
were correlated with the extracellular parameters T2, OD600, and pH. The consumpti-
on of medium and the pH-variation evoked by the production of metabolites during
cell growth were identified to be the basis for the successful parametrization of cell
growth by T2. MRI allowed for measuring growth curves on the basis of T2 of several

acterial cultures simultaneously. From T2-growth curves of Streptococcus vestibularis in
the presence of varying concentrations of vancomycin, MIC of the antibiotic could be
determined to be 0.33±0.08 µM. This value was in good agreement with the results ob-
tained by conventional broth microdilution (MIC=0.7 µM), LIF-CE- (ED50= 0.24±0.07
µM), and FMR- (ED50=2.4±0.7 µM) method.
181

182 A. Abkürzungsverzeichnis
Anhang A
Abkürzungsverzeichnis
AATF Antimicrobial Availability Task Force
ADME Adsorption, Distribution, Metabolismus und Elimination
BHI Brain-Heart-Infusion
CA Community-acquired, ubiquitär auftretend
CE Kapillarelektrophorese
CEC Kapillarelektrochromatographie
CFU Colony forming units, koloniebildende Einheiten
CGE Kapillargelelektrophorese
CIEF Kapillar-Isoelektrische Fokussierung
CITP Kapillarisotachophorese
COMP Committee for Orphan Medicinal Products
COSY COrrelation SpectroscopY
CPMG Carr-Purcell-Meiboom-Gill
CZE Kapillarzonenelektrophorese
D Diffusionskoeffizient
DNDi Drugs for Neglected Diseases Initiative
DMFO Eflornithin, Difluormethylornithin
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
EC50
ED50
Effective concentration, 50 %
Effective dose, 50 %
EMEA European Medicines Agency
EOF Elektoosmotischer Fluss
FDA Food and Drug Administration
FID Free induction decay
FMR Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät
FQRP Fluorchinolon-resistenter Pseudomonas aeruginosa
FRET Fluorescence resonance energy transfer
HAT Human African Trypanosomiasis

HA Hospital-acquired, nosokomial
HTS High-throughput-screening
IC50
Inhibitory concentration, 50 %
IC Internal conversion
ICH International Conference of Harmonization
IDSA Infectious Diseases Society of America
IOWH Institute for One World Health
ISC Intersystem crossing
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LDL Low density lipoprotein
LIF Laser-induzierte Fluoreszenz
LIF-CE Kapillarelektrophorese mit Laser-induziertem-Fluoreszenz-Detektor
LPS Lipopolysaccharide
MEKC Mizellare elektrokinetische Chromatographie
MIC Minimum inhibitory concentration
MMV Medicines for Malaria Venture
MRI Magnetic resonance imaging
MRS Magnetic resonance spectroscopy
MRT Magnetic resonance tomography
MRSA Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus
MTC Magnetisierungstransferkontrast
NIQ Naphthylisochinolin-Alkaloide
NMR Nuclear magnetic resonance
OD Optische Dichte
ODC Ornithin-Decarboxylase
OM Outer membrane
PEO Poly(ethylen)oxid
PGSE Pulsed-field-gradient-spin-echo
ppm Parts per million
PPP Public-private-partnership
PRSP Penicillin-resistenter Streptococcus pneumoniae
PD-PPP Public-private-partnerships for product development
REDOX Reduktion-Oxidation
RFU relative fluorescence unit
ROI Region of interest
SAR Structure activity relationship, Struktur-Wirkungs-Beziehungen
SOD Superoxid-Dismutase
SW Bandbreite
T Tesla
183

184 A. Abkürzungsverzeichnis
T1
T2
longitudinale Relaxation
transversale Relaxation
T. b. b. Trypanosoma brucei brucei
TBE Tris-Borat-EDTA
TD Time domain
TMS Tetramethylsilan
VRE Vancomycin-resistenter Enterococcus
WHO World Health Organization

Anhang B
Prozessierung der Rohdaten
Mit nachfolgendem MATLAB-Code wurde aus den Multispin-Images T2 von jedem Pi-
xel durch Anfitten des Intensitätsverlaufs an eine Monoexponentialfunktion berechnet
und T2-Karten erstellt.
clear all;
patient_name = ’T2_va060305’;
scan_number = [3:134];
verz=’va060305.Ar1’;
%vez=’mo04-10-11’;
path=strcat(’/mamba/q_home/vahoerr/Daten/’,verz,’/’);
directory=’/mamba/q_home/vahoerr/Ergebnisse/’;
processed_data_directory = strcat(directory,’/’);
l=size(scan_number)
%clear all;
for u=1:l(2);
s=scan_number(u);
ordner=num2str(scan_number(u));
full_path=strcat(path,ordner)
cd(full_path);
% read TE values
pvm = read_acqp(’method’);
TE = read_acqp_value(pvm, ’$PVM_EchoTime=’);
TE_value = str2num(TE);
185

186 B. Prozessierung der Rohdaten
% read number of echo images
number_of_echo_images_str =
read_acqp_value(pvm, ’$PVM_NEchoImages=’);
number_of_echo_images = str2num(number_of_echo_images_str);
echo_times = TE_value*(1:number_of_echo_images)’;
% read NA
acqp = read_acqp(’acqp’);
n_avg = read_acqp_value(acqp, ’$NA’);
% read number of slices
number_of_slices = read_acqp_array(pvm,’$PVM_SPackArrNSlices’);
process_number=’1’;
% read matrix size
filename_reco = strcat(full_path,’/pdata/’,process_number,...
’/reco’);
reco = read_acqp(filename_reco);
matrix_size = read_acqp_array(reco,’$RECO_ft_size=’);
%t=echo_times
t=echo_times(2:64);
clear bild;
clear t2;
tic
for slice = 1:number_of_slices;
dateiname = strcat(full_path, ’/pdata/’,process_number,...
’/2dseq’);
bild = read_2dseq(matrix_size(1),matrix_size(2), ...
number_of_echo_images*number_of_slices, ...
(slice-1)*number_of_echo_images+1:slice*....
number_of_echo_images, dateiname, ’l’);
max_signal_int = max(max(max(bild)));
for kx=1:matrix_size(1);
[slice kx];

for ky=1:matrix_size(2);
signalint = reshape(bild(:,kx,ky),...
number_of_echo_images,1);
end
end
end
for k=1:64;
for kk=1:64;
[k kk];
data = bild([2:1:64],k,kk);
if data(1) > 3000;
[k kk];
t , data );
end
end
toc
end
options = optimset(’Display’,’off’,’MaxIter’,
1000, ’MaxFunEvals’, 1000);
[y err] =fminsearch(’t2fit_2’,[data(1) 100],options,...
t2(k,kk)=y(2);
Mo(k,kk)=y(1);
err;
error(k,kk)=err;
write_verzeichnis = strcat(processed_data_directory,...
patient_name, ’/’);
cd(processed_data_directory);
if (exist(patient_name) ˜= 7)
end
mkdir(patient_name);
datei1 = strcat(write_verzeichnis,’t2_’,ordner);
datei2 = strcat(write_verzeichnis,’bild_’,ordner);
save(datei1,’t2’);
save(datei2,’bild’);
end
187

188 C. Region of Interest (ROI)
Anhang C
Region of Interest (ROI)
Zur Definition der ROIs wurde der nachfolgende MATLAB-Code verwendet.
clear all;
patient_name = ’T2_va060320.AG1’;
scan_number = [126:243];
proben=17;
teil=’1’;
t=[0:12:1404];
directory=’/mamba/q_home/vahoerr/Ergebnisse’;
directory1 = strcat(directory,’/’);
directory2 = strcat(directory1,patient_name,’/’);
cd(directory2);
l=size(scan_number)
m=zeros(proben,l(2));
st=zeros(proben,l(2));
w=1;
s=scan_number(w);
ord=num2str(scan_number(w))
datei1 = strcat(’t2_’,ord,’.mat’)
load(datei1);
imagesc(t2)

for k=1:proben,
end
m
st
w=1;
s=scan_number(w);
ord=num2str(scan_number(w));
datei1 = strcat(’t2_’,ord,’.mat’)
load(datei1);
datei1
size(t2)
maske=roipoly;
size(maske)
for z=1:l(2),
end
ord2=num2str(scan_number(z));
datei2 = strcat(’t2_’,ord2,’.mat’);
load(datei2);
myS = size(maske)
t3 = t2(1:myS(1),1:myS(2));
clear t2
t2 = t3;
if size(t2,1)>116
end
t2=t2(1:116,:);
roi=maske.*t2;
m(k,z)=mean(roi(roi>0));
st(k,z)=std(roi(roi>0));
directory4=strcat(’t2_std’,teil);
cd(directory2)
if (exist(directory4)˜=7)
end
mkdir(directory4)
directory3=strcat(directory2,’t2_std’,teil,’/’);
datei6=strcat(directory3,’m’);
189

190 C. Region of Interest (ROI)
datei7=strcat(directory3,’st’);
datei8=strcat(directory3,’t’);
save(datei6,’m’)
save(datei7,’st’)
save(datei8,’t’)

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214

Danke
Zum Schluss möchte ich mich bei all den Pharmazeuten, Chemikern, Physikern,
Medizinern und Biologen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben. Mein besonderer Dank gilt:
Professor Dr. Ulrike Holzgrabe für die Betrauung mit diesem interdisziplinären Thema,
die wissenschaftlichen Freiheiten, die Bereitschaft zur freien Zeiteinteilung, wodurch mein
Zweitstudium der Physik möglich wurde und für ihre Unterstützung meiner Zukunftspläne.
Professor Dr. Peter Jakob für seinen Pragmatismus, der das Leben um so vieles leichter
macht und für die Erstellung des Zweitgutachtens.
Professor Dr. Tanja Schirmeister für die gute Zusammenarbeit bei der Betreuung des
zweiten Semesters und bei unserem gemeinsamen Projekt zur Auffindung neuer Leit-
strukturen gegen die Afrikanische Trypanosomiasis, ihre stets aufmunternden Worte
zur richtigen Zeit und für ihre Hilfe bei der Realisierung meiner zukünftigen Projekte.
PD Dr. Wilma Ziebuhr, Dr. Svetlana Kozitskaya und Elena Katzowitsch für die Bestim-
mung der minimalen Hemmkonzentrationen verschiedener Antibiotika mittels Mikro-
dilutionsverfahren und für die Diskussionen zum Thema mikrobieller Testverfahren.
PD Dr. Michael Steinert und Dr. Markus Wehrl für hilfreiche Diskussionen rund um
die Mikrobiologie.
Dr. Cornelius Faber, Dr. Martin Horstmann und Kerstin Hoffmann für die Ermögli-
chung des Bakterien-Projektes mittels magnetischer Kernresonanz.
Dr. Curd Schollmayer für die Hilfe bei der Messung der NMR-Spektren.
Dem Missionsärztlichen Institut insbesondere Professor Dr. Klaus Fleischer, PD Dr.
August Stich, Andreas Fabrizius, Silvia Miksch und Hanne Fleischmann für die zahl-
reichen Gespräche und Vorträge, die mir einen Einblick in die Tropenmedizin gaben;
Melanie Glaser für ihre Hilfe bei der Testung an Trypanosoma brucei brucei; und Andrea
Roggers und Daniela Heuer für ihre logistische Unterstützung.
PD Dr. Dietmar Steverding für seine elektronische Präsenz im fernen Norfolk und die
vielen Tipps und Tricks im Umgang mit Trypanosomen.
Professor Dr. Simon Croft, Dr. Vanessa Yardley, Howard Kendrick and Lauren
Rattrey für die freundliche Aufnahme in ihren Arbeitskreis während meines For-
215

216
schungsaufenthaltes in London und das Lehren des Umgangs mit humanpathogenen
Trypanosomen-Stämmen.
Den Professoren Dr. Chris Curtis und Dr. Jill Curtis für ihre Gastfreundschaft in Lon-
don.
Dr. Peer Löbmann und Holger Friedrich für die Ermöglichung der rheologischen Un-
tersuchungen polymerer PEO-Lösungen.
Den Arbeitskreisen Professor Dr. Dr. h.c. Gerhard Bringmann und Professor Dr. Rein-
hold Tacke für die Zusammenarbeit bei der Suche nach neuen Leitstrukturen gegen
die Afrikanische Trypanosomiasis in der Gruppe der Naphthylisochinolin-Alkaloide
und der Siliziumverbindungen.
Dem AK Ho und der EP5 für die abwechslungsreichen und lustigen letzten Jahre, ins-
besondere dem CE-Team: Susanne Kopec, Alexandra Deubel, Stefanie Laug und Chri-
stine Weber und meinen Büro-Kollegen in EP5: Volker Sturm, Florian Schmid, Jochen
Lorenscheid, Gert Schneider und Dr. Gerd Klug.
Und das Beste kommt immer zum Schluss, dem harten Kern: Cat, Schnurff, Igel, Böppi
und Mäuserich.