Methoden zur Evaluation von Zytotoxizit¨at und Struktur ... - OPUS

1.2 Entwicklung neuer Antiinfektiva 25
von radioaktiv markiertem 14 CO2 (im Bac-Tec-Verfahren realisiert) oder die Aufnahme
radioaktiv markierter Nukleotide wie [ 3 H]-Thymidin, [ 3 H]-Hypoxanthin oder Ami-
nosäuren gemessen werden [47, 78, 214]. Solche Methoden erfordern im Medium ei-
ne radioaktive Kohlenstoff- bzw. Wasserstoffquelle, wodurch ihre Durchführung auf-
grund gesetzlicher Auflagen problematisch ist. Eine andere Möglichkeit Stoffwechsel-
produktion und unter anderem CO2-Freisetzung zu messen, stellt die Kalorimetrie dar.
Hier wird mit einem Infrarot-Messsystem die durch den mikrobiellen Stoffwechsel
freiwerdende Wärme gemessen, wodurch ein Rückschluss auf die Zahl der Mikroor-
ganismen möglich ist.
Letztendlich eignet sich noch die Impedanzmessung. Gemessen wird der Widerstand
gegen den elektrischen Strom in der Zellkultur. Eine Verminderung der Impedanz ist
eine Folge von Zellvermehrung und -stoffwechsel, denn Nährstoffverzehr und Stoff-
wechselprodukte ändern die Komposition des Mediums.
All diese Detektionsmethoden können zur Auswertung von Testsystemen zur Bestim-
mung von Zytotoxizität angewandt werden. Sie wurden ursprünglich zur Messung
eines kleinen Probenumfanges entwickelt und ihre Anwendung in High-Throughput-
Screening-Verfahren mit Testungen von mehreren 100.000 Substanzen pro Tag ist
durch ihre Technik beschränkt.
1.2.3 ”High-throughput-screening” (HTS)
Schlüsselfaktoren für Testsysteme mit großer Durchsatzzahl, sogenannte High-
Throughput-Screening-Verfahren sind Miniaturisierung, Parallelisierung und Auto-
matisierung. Diese Kriterien sind durch den gesamten etablierten Testablauf von Pro-
benvorbereitung bis Detektion festgelegt. Zur Realisierung von Hochdurchsatz sollte
das Testverfahren aus nur wenigen einfachen Schritten bestehen, die vollautomatisier-
bar sind. Nicht selten werden Arzneistoff-exponierte Kulturen unter Einsatz von Robo-
tern in Mikrotiterplatten mit 1536-2080 Vertiefungen simultan präpariert. Die Miniatu-
risierung ist dabei maßgeblich zur Senkung der Kosten für Verbrauchsmaterialien und
Reagenzien. Zur parallelen Auswertung eignet sich vor allem die optische Detektion.
Ob in der Spektroskopie oder in der Bildgebung, die Turbidimetrie, Fluorimetrie und
Kolorimetrie sind die am häufigsten angewandten Verfahren. Diese Art der Detekto-
ren ist relativ kostengünstig und realisiert in einem “array” können sie die einzelnen
Proben separat aufzeichnen. Jede Methode erfordert jedoch für den Einsatz in High-
Throughput-Screening-Verfahren ein individuell angepasstes Design.
Konventionell wird zur Bestimmung der antibiotischen Wirksamkeit potenzieller An-
tiinfektiva das Mikrodilutionsverfahren nach DIN-Vorschrift (DIN 58940) [2] ange-
wandt. Es handelt sich dabei um ein Dilutionsverfahren mit turbidimetrischer Aus-
wertung, das in Mikrotiterplatten durchgeführt wird und die antimikrobielle Wirkung